桑葚是桑科落叶乔木的成熟果实，富含花色苷、多酚、黄酮、多糖及白藜芦醇等生物活性成分，具有抗氧化、改善睡眠、调节血脂和增强免疫等多种保健功能[1-2]。由于鲜果采收季节性强、货架期短，制约其产业化开发。以桑葚为原料酿制发酵酒不仅能延长原料利用周期、提高产品附加值，还可通过乙醇发酵提升活性成分的生物利用度[3-6]。
目前，桑葚酒的生产主要依赖商用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但现有菌株在花色苷保留、色泽稳定性及香气协调性等方面表现不足，产品质量稳定性差，难以满足规模化、高品质生产需求[7]。酵母菌株选择对果酒品质具有决定性影响，部分商用酵母菌株因细胞壁吸附或代谢特性导致花色苷损失[8-10]。从同类果酒中定向筛选专用菌株是改善桑葚酒色泽稳定性和花色苷保留率的有效途径。Zhou Jianli等[11]从蓝莓酒中筛选出高产丙酮酸和乙醛酵母菌株，可显著促进吡喃花色苷等稳定色素形成。Minnaar等[12]研究发现，德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）发酵可提升赤霞珠葡萄酒中花色苷和黄烷醇含量，改善酒体色泽。Longhi等[13]从葡萄表面筛选的酵母可提高葡萄酒中酚类物质的释放和保留。不同酵母菌株对樱桃酒[14]、李子酒等[15]果酒中花色苷保留和色泽参数均存在显著影响。然而，纯种商用酵母发酵桑葚酒风味单一，适配桑葚酒的专用特色酵母菌株有待挖掘开发[16]。
本研究以自然发酵桑葚酒液为菌源，从中分离纯化酵母菌株。通过产气能力进行初筛，再结合产乙醇能力和花色苷积累能力进行复筛，通过形态学观察及分子生物学技术进行鉴定，并将筛选获得的菌株与商用酿酒酵母的发酵性能进行对比分析，旨在为桑葚酒专用酵母的开发及产业升级提供优质菌种资源与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚干、蔗糖 市购；商用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC9 法国Lallemand公司；果胶酶（1.0×106 U/g）、纤维素酶（1.1×106 U/g） 山东隆科特酶制剂有限公司。Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（SK8259） 上海生工生物工程股份有限公司。
HCl标准溶液（1 mol/L）、HCl（6 mol/L）、没食子酸（纯度≥98%） 上海麦克林生化科技股份有限公司；芦丁（纯度≥98%） 合肥巴斯夫生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂 福州飞净生物科技有限公司；五水硫酸铜、四水合酒石酸钾钠、无水葡萄糖、氢氧化钠、二水合乙酸锌、亚甲蓝、甲基红、亚铁氰化钾（均为分析纯） 西陇科学股份有限公司。
YPD液体培养基：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；YPD固体培养基：在YPD液体培养基基础上，添加琼脂粉20 g。培养基均于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
HWS-80B恒温恒湿培养箱 长葛市明途机械设备有限公司；YX-280A手提式压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司；HHS-4S电子恒温不锈钢水浴锅上海锡仪试验仪器有限公司；WTC2003电子天平 杭州万特衡器有限公司；721可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；WYT手持折光仪 成都豪创科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑葚汁与自然发酵桑葚酒制备
称取桑葚干，按料液比6∶100（g/mL）加入蒸馏水，室温浸泡2 h后打浆，向浆液中添加纤维素酶1 g/L和果胶酶0.4 g/L，50 ℃酶解1 h，酶解结束后95 ℃保温3 min灭酶，过滤，滤渣再次提取，合并滤液并定容，用蔗糖调整糖度至20 °Brix，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，即得桑葚汁。桑葚汁在室温下自然发酵3个月，即得自然发酵桑葚酒。
1.3.2 酵母菌的分离、纯化及筛选
1.3.2.1 分离与纯化
取自然发酵桑葚酒液10 mL，加入90 mL无菌生理盐水，充分振荡混匀后进行10倍梯度稀释。分别取10-3、10-4、10-5稀释度菌悬液0.1 mL，涂布于YPD固体培养基，28 ℃培养2～3 d。挑选典型酵母菌落（菌落呈乳白色、圆形、边缘整齐、表面光滑）进行划线纯化，重复纯化3次后转接至YPD斜面，4 ℃保存备用。
1.3.2.2 初筛
采用杜氏管发酵法进行初筛。将活化后的菌株以 5%（V/V）接种量接入灭菌后的20 °Brix桑葚汁中，28 ℃静置培养24 h，观察杜氏管产气情况，筛选产气充足（杜氏管充满气体）的菌株。
1.3.2.3 复筛
将产气能力较强的初筛菌株以1%（V/V）接种量接入灭菌后的20 °Brix桑葚汁中，28 ℃静置发酵7 d。发酵结束后测定乙醇体积分数，筛选产乙醇性能优良的菌株。
将产乙醇性能优良的菌株以1%（V/V）接种量接入灭菌后的20 °Brix桑葚汁中，28 ℃静置发酵7 d。发酵结束后测定花色苷含量，以未发酵桑葚汁为基准计算花色苷相对含量，从而筛选出花色苷积累能力较强的菌株。
1.3.3 菌株形态学分析与分子生物学鉴定
对复筛菌株进行菌落特征观察和细胞形态观察[17]。采用DNA抽提试剂盒提取菌株总DNA。以NL1（5′-GCATAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTC CGTGTTTCAAGACGG-3′）为引物扩增26S rDNA D1/D2 区序列。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增体系（25 μL）：10×PCR Buffer、dNTP（各10 mmol/L）、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL）、 MgSO4（50 mmol/L）共12.5 μL，NL1、NL4引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序。测序结果在NCBI GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，选择相似度最高的序列，利用MEGA 12软件基于邻接法构建系统发育树。
1.3.4 桑葚酒发酵专用菌株的应用效果评价
以筛选获得的桑葚酒发酵专用菌株为实验组，商用酿酒酵母SC9为对照组，分别按1%（V/V）接种量接入灭菌后的20 °Brix桑葚汁中，于28 ℃静置发酵30 d。发酵结束后巴氏灭菌（65 ℃、30 min），6 000 r/min离心5 min，取上清液作为桑葚酒样品，以未发酵桑葚原汁为空白对照（CK），分别测定乙醇体积分数、花色苷、总黄酮、总酚、总酸等理化指标。以未发酵桑葚汁为基准计算总黄酮、总酚相对含量。
1.3.5 理化指标检测
总酸测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]；乙醇体积分数测定：参照GB 5009.225— 2023《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》[19]；可溶性固形物测定：参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[20]；花色苷测定：pH示差法[21]；总酚测定：Folin-Ciocalteu法[22]；总黄酮测定：亚硝酸钠-硝酸铝比色法[23]。
1.3.6 香气分析
香气分析采用定量描述分析法，选取果香、甜香、酸香、酒香、酵母香、花香、酸败味和刺激性气味8个维度，各维度按1～10分强度标度评分（1＝“几乎无”、3＝“弱”、5＝“中等”、7＝“强”、10＝“极强”），由10名经过培训的评审员独立打分，取平均值绘制香气雷达图，以直观表征桑葚果酒的香气轮廓。
1.4 数据分析
采用Excel 2020整理数据，SPSS 27.0进行数据分析，Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 自然发酵桑葚酒液中菌株的筛选
2.1.1 菌株初筛
由表1可知，从自然发酵桑葚酒液共分离获得80株疑似酵母菌，共有11株菌株在24 h内产气并充满整个杜氏小管，表明这些菌株生长速率较快，起酵能力较强，具备较好的发酵能力；其他菌株在24 h内产气量不足，未能充满杜氏小管，表明其起酵能力相对较弱。因此，选择11株产气较强的菌株进行复筛。
表1 酵母产气能力
Table1 Yeast gas production capacity
++1产气情况菌株数-65+1+++0++++2+++++11
注：+++++.气体充满杜氏小管；++++.气体充满杜氏小管的4/5；+++.气体充满杜氏小管的3/5；++.气体充满杜氏小管的2/5；+.气体充满杜氏小管的1/5；-.不产气体。
2.1.2 菌株复筛
2.1.2.1 产乙醇能力
酵母菌株的选择是调控果酒品质与发酵进程的核心环节[24]；不同菌株发酵所得果酒在香气轮廓、风味特征及口感质地等方面存在显著差异，进而决定产品的品质等级[25]。将初筛获得的11株菌株分别接种进行桑葚酒发酵。由图1可知，LJ3-2、LJ3-3、LJ3-10、LJ34-1和LJ34-3共5株菌株表现出较强的乙醇生成能力（乙醇体积分数为4.3%～7.1%）。因此，对这5株菌株的花色苷积累能力作进一步分析。
图1 不同酵母菌株对桑葚酒乙醇体积分数的影响
Fig.1 Effects of different yeast strains on ethanol content of mulberry wine
2.1.2.2 花色苷积累能力
由图2可知，未发酵桑葚汁（CK）中总花色苷质量浓度为37.02 mg/L。发酵结束后，菌株LJ34-1发酵桑葚酒中总花色苷质量浓度最高，为118.34 mg/L，其相对含量达319.7%，明显高于其他4株酵母，这与其较低的细胞吸附作用和适宜的代谢特性密切相关。因此选用LJ34-1作为桑葚酒发酵专用菌株。
图2 不同酵母菌株对桑葚酒花色苷含量的影响
Fig.2 Effects of different yeast strains on anthocyanin content of mulberry wine
2.1.3 筛选菌株鉴定
2.1.3.1 形态学观察
由图3a可知，菌落呈线状条带分布，菌落为乳白色至奶油色，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，无明显菌丝，是典型的酵母菌菌落特征；由图3b可知，菌体细胞主要呈卵圆形至椭圆形，大小较为一致，部分细胞可见明显的出芽结构（芽体附着于母细胞），细胞分散或呈小簇分布，未见明显真菌丝生成。
图3 酵母菌菌落形态（a）和细胞形态（b）
Fig.3 Yeast colony morphology (a) and cell morphology (b)
2.1.3.2 分子生物学鉴定
对筛选得到的LJ34-1进行基因组DNA提取，以NL1/NL4为引物进行PCR扩增，获得约600 bp的单一清晰条带，无明显杂带，产物测序结果在NCBI GenBank数据库中进行BLAST比对，由图4可知，菌株LJ34-1与KY106827.1（Candida tropicalis）聚为一支，鉴定为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。
图4 基于26S rDNA基因序列的LJ34-1系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of LJ34-1 based on 26S rDNA gene sequence
2.2 菌株LJ34-1发酵对桑葚酒品质的影响
2.2.1 理化指标
取商用酿酒酵母SC9及菌株LJ34-1分别接种发酵桑葚汁，以未发酵桑葚汁为对照组（CK）。由图5a可知，发酵30 d后，LJ34-1组乙醇体积分数达11.7%，与SC9组（12.5%）接近。LJ34-1组总酸质量浓度为3.86 g/L，低于SC9组（5.87 g/L）。CK、SC9、LJ34-1组桑葚酒中可溶性固形物含量分别为21.1、6、7 °Brix。
图5 不同酵母菌株发酵桑葚酒理化指标（a）与活性成分（b）对比
Fig.5 Comparison of physicochemical indicators (a) and bioactive components (b) of mulberry wine brewed with different yeast strains
由图5b可知，LJ34-1、SC9组花色苷质量浓度分别为43.82、25.38 mg/L。LJ34-1组花色苷、总黄酮、总酚相对含量分别为191.1%、52.6%、60.2%，高于SC9组（分别为110.7%、36.1%、47.2%）。由此可见，菌株LJ34-1有利于提高桑葚酒花色苷、总酚及总黄酮等活性成分的含量。
2.2.2 香气特征
由图6可知，菌株LJ34-1发酵桑葚酒的香气成分更偏向清新的果香、甜香和花香，其刺激性气味明显低于酿酒酵母SC9发酵桑葚酒，这表明菌株LJ34-1能有效减少发酵过程中的刺激性副产物，赋予桑葚酒更清新、协调的果香背景，有利于提升桑葚酒的整体感官品质和消费者接受度。
图6 不同酵母菌株发酵桑葚酒感官品评香气雷达图
Fig.6 Sensory evaluation aroma radar chart of mulberry wine brewed with different yeast strains
3 结 论
本研究从自然发酵桑葚酒液中筛选获得菌株LJ34-1，经形态学和分子生物学鉴定为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。以商用酿酒酵母SC9为对照，菌株LJ34-1发酵桑葚酒乙醇体积分数、花色苷及总酸质量浓度分别为11.7%、43.82 mg/L与3.86 g/L；以未发酵桑葚汁为基准，菌株LJ34-1发酵桑葚酒花色苷、总黄酮、总酚相对含量分别为191.1%、52.6%、60.2%，均高于SC9组（分别为110.7%、36.1%、47.2%）；果香和花香更为突出，刺激性气味显著降低，整体风味清新协调，更符合桑葚酒的品质需求。LJ34-1作为非酿酒酵母，在单菌发酵体系中表现出良好的保色和功能性提升优势。本研究为桑葚酒的制备提供了重要菌种资源，可提高桑葚酒品质，未来可深入解析菌株LJ34-1在花色苷保护、香气形成及功能成分调控中的作用机制，并探索其在协同发酵及工业化放大中的应用潜力。
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