在鲜食葡萄栽培管理过程中，为改善果穗形态、果粒外观及果实口感，种植人员通常会疏除大量葡萄幼果。大量葡萄疏除幼果（thinned unripe grape，TUG）被直接丢弃在果园内，不仅造成资源浪费，还对生态环境产生不利影响，堆积的TUG腐烂后易成为病原体滋生载体[1]，同时会提高土壤酸度，破坏果园土壤结构稳定性[2]。
我国葡萄种植平均单株TUG生物量为0.51 kg，果园平均种植密度为3 800株/hm2[3]。结合国际葡萄与葡萄酒组织2025年度报告可知，全球每年TUG总生物量约为13 759 kt，其中西班牙、法国、中国位居产量前3，年产生物量分别为1 802、1 517、1 459 kt。TUG含有丰富的多酚[4]、有机酸[5]、甾醇[6]、氨基酸[7]及谷胱甘肽[8]等多种生物活性成分，这类成分能够延缓或抑制自由基产生、降低癌症发生风险、预防心血管疾病，充分体现出TUG极高的资源化开发价值。酚类化合物主要在葡萄果皮中合成，在果实转色前期，酚类化合物含量呈快速累积态势；但随着果实体积膨大、质量增加，受稀释作用影响，酚类化合物含量在葡萄成熟阶段会出现明显下降[4]。这一规律也证实了未成熟葡萄中酚类物质含量更高的特性[9]，为TUG作为多酚提取原料提供了理论支撑。
Jančářová等[10]以4种白葡萄品种为研究对象，跟踪监测其7—11月成熟期间的酚类物质变化情况，结果显示，酚类物质质量浓度从首次采样时的5 000 mg/L降至成熟时期的104 mg/L，下降幅度达97.92%，直观呈现了果实成熟过程中酚类物质的流失特征。王美丽[11]在研究4种酿酒葡萄成熟过程中单体酚的动态变化时，于转色期采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法成功检出没食子酸、苯甲酸、丁香酸、儿茶素、芦丁及阿魏酸等多种酚类成分。此外，Bagheri等[12]在葡萄幼果汁液中检出芦丁、没食子酸、羟基苯甲酸、对香豆酸和白藜芦醇等酚类物质；Guler等[13]也证实葡萄幼果果汁具有较强的抗氧化活性，该特性与其含有高水平没食子酸、(+)-儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、香草酸、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、(-)-表儿茶素、咖啡酸、咖啡酰酒石酸和对香豆酸等酚类成分密切相关。其中，咖啡酰酒石酸作为葡萄中主要的酚酸类物质，具有显著的抗氧化、抗炎及保护心血管等生理活性，且在TUG中含量相对稳定；(+)-儿茶素作为黄烷-3-醇类多酚的典型代表，抗氧化能力突出，是TUG中极具开发价值的核心活性单体，二者均为TUG多酚中兼具生理活性与开发潜力的关键成分。综上，作为富含多种活性酚类成分的优质原料，TUG具有深度开发利用潜力。
目前，酚类化合物的提取已形成多种较为成熟的技术方案，其中溶剂提取法[14]、超临界萃取技术[15]、微波辅助提取法[16]及酶提取法[17]等应用最为普遍，可实现酚类物质的高效富集。Shojaee-Aliabadi等[18]以乙醇溶液作为提取溶剂开展葡萄幼果多酚提取实验，结果证实提取时间、提取温度及乙醇体积分数是影响提取效果的关键因素。通过响应面法优化确定最优工艺参数为：提取温度44.93 ℃、提取时间19.34 h、乙醇体积分数70.08%；在此条件下，葡萄幼果多酚提取量达到388.79 mg/100 g，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率为91.01%，为TUG多酚提取工艺的优化提供了参考依据。
值得注意的是，经提取获得的酚类粗提物往往含有较多杂质，需进一步分离、纯化以提升目标物纯度，吸附分离法是该环节的常用技术。已有研究表明，大孔树脂因对多酚类物质具有适宜的吸附与解吸性能，成为多酚纯化的优选载体[14]。Sun Lijun等[19]从多种大孔树脂中筛选出X-5树脂用于葡萄幼果多酚纯化，经工艺优化后，多酚类物质纯度从35.17%提升至74.64%，提高1.12倍；该团队还采用X-5树脂与聚酰胺树脂组合纯化体系对绿原酸和根皮苷进行分离，最终二者纯度分别达到15.20%和97.52%。后续研究中，该团队进一步将X-5树脂与聚酰胺树脂联用，对苹果幼果中的绿原酸、表儿茶素、金丝桃苷及根皮苷开展分离纯化，最终获得的目标物纯度分别高达96.21%、95.34%、95.36%和97.36%[20]。
为实现TUG中多酚类物质的高效提取和纯化，本研究拟通过有机溶剂提取法和微波辅助浸提相结合提取TUG粗多酚并对提取参数进行优化，通过大孔树脂吸附法对其中的咖啡酰酒石酸和(+)-儿茶素进行纯化，以期为TUG的高值化利用提供理论依据，提高果园固体废物的综合利用水平。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘巨峰’TUG采集于陕西咸阳杨陵区曹辛庄栽培果园，疏除时果粒处于转色前期，单果粒直径0.8～1.2 cm，单果粒鲜质量0.35～0.50 g，果粒呈淡绿色、果肉饱满，无病虫害、无机械损伤，采摘后立即带回实验室，经清洗、沥干、粉碎后低温保存，用于后续多酚提取。
咖啡酰酒石酸、(+)-儿茶素 美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈 德国Merck公司；X-5树脂 安徽三星树脂科技有限公司；聚酰胺树脂 西安蓝深特种树脂有限公司。
1.2 仪器与设备
FD5-37冷冻干燥机 美国SIM公司；KQ-500DE超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；RC-5C-PLUS高速冷冻台式离心机：美国Kendro公司；UV-1700分光光度计 日本岛津公司；QTRAP5500三重四极杆复合线性离子阱液相色谱-质谱仪 美国AB SCIEX公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；C18 SMB100-10色谱柱 富士硅化学株式会社；LC-16P半制备型液相色谱仪 岛津仪器（苏州）有限公司；2695 HPLC仪、2699紫外检测器 美国Waters公司；BS-100N自动收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
2020年花后15 d（疏果期）采集样品，经均质机制浆（添加1%（m/m）NaHSO3作为保护剂），蒸30 s灭活内源多酚氧化酶，匀浆冷冻干燥24 h，得幼果干粉。
1.3.2 TUG多酚广泛靶向代谢组学分析
参考文献[21-22]，采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）进行广泛靶向代谢组学分析。
1.3.3 TUG多酚提取参数优化
固定超声功率250 W、浸提温度40 ℃、提取时间4 h、乙醇体积分数70%，考察不同超声时间（5、10、15、20、25 min）对多酚得率的影响；固定超声时间15 min、超声功率250 W、提取时间4 h、乙醇体积分数70%，考察不同提取温度（30、35、40、45、50 ℃）对多酚得率的影响；固定超声时间15 min、超声功率250 W、浸提温度40 ℃、乙醇体积分数70%，考察不同浸提时间（3、3.5、4、4.5、5 h）对多酚得率的影响；固定超声时间15 min、超声功率250 W、浸提温度40 ℃、提取时间4 h，考察不同乙醇体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）对多酚得率的影响。
基于单因素试验结果，利用Design-Expert 13软件进行4因素3水平实验设计，因素水平如表1所示。
表1 响应面试验因素水平
Table1 Factors and levels of response surface methodology test
B浸提温度/℃304050 C提取时间/h345因素-10+1 A超声时间/min01530 D乙醇体积分数/%607080
1.3.4 多酚得率计算
多酚得率按式（1）计算：
式中：ρ为提取液多酚质量浓度/（μg/mL）；V为提取液定容体积/mL；F为样品稀释倍数；m为葡萄幼果样品质量/g。
1.3.5 静态吸附率与解吸率计算
静态吸附率与解吸率分别按式（2）（3）计算：
式中：ρ0为吸附前原液目标组分质量浓度/（mg/mL）；ρ1为吸附平衡后上清液目标组分质量浓度/（mg/mL）；Vd为解吸液体积/mL；V为吸附液体积/mL；ρd为解吸液中目标组分质量浓度/（mg/mL）。
1.3.6 TUG粗多酚制备
在最优浸提条件下制备TUG多酚粗提液，4 ℃冷藏24 h后，于45 ℃旋转蒸发去除乙醇，经蒸馏水洗涤烧瓶，合并收集洗涤液，7 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集上清液得无醇粗提液。参照Sun Lijun等[19]的方法，选用X-5树脂纯化多酚。将脱除乙醇后的固体提取物加蒸馏水溶解，配制为质量浓度2 g/L的样液，样液与预处理树脂按照体积比10∶1混合，25 ℃、150 r/min恒温振荡吸附，持续12 h后，过滤并收集吸附树脂。将树脂转入丝口瓶，加入600 mL 75%乙醇，25 ℃、150 r/min振荡解吸4 h，抽滤后收集上清液，经旋转蒸发脱醇、冷冻干燥，制得TUG粗多酚。
1.3.7 TUG粗多酚中咖啡酰酒石酸分离纯化
取0.6 g TUG粗多酚溶于300 mL蒸馏水，经恒流泵以1.16 mL/min流速泵入X-5树脂层析柱（30 mm× 300 mm）；分别以5%、10%、15%、20%乙醇作为洗脱液进行梯度洗脱，每50 mL流出液作为一个组分，采用HPLC法[19]测定各组分中咖啡酰酒石酸含量，以此筛选最优洗脱液体积分数。
1.3.8 TUG粗多酚中(+)-儿茶素分离纯化
称取0.6 g TUG粗多酚样品，溶解于300 mL蒸馏水中，经恒流泵以1.16 mL/min流速泵入聚酰胺树脂层析柱（30 mm×300 mm）；分别以10%、20%、30%、60%乙醇作为洗脱液，每50 mL流出液作为一个组分，采用HPLC法[23]检测各组分中(+)-儿茶素含量，以此筛选最佳洗脱液体积分数。
1.4 数据处理
采用SPSS 20.0进行单因素方差分析和独立样本t检验，不同字母表示处理间存在显著差异（P＜0.05）。各实验组均重复3次，结果以x±s表示。
2 结果与分析
2.1 TUG酚类物质组成
采用UPLC-MS/MS技术从TUG中共鉴定出456种单体酚类化合物，可归为12个大类，分别为酚酸类、黄酮醇、二氢黄酮、黄酮类、花青素、黄烷醇类、芪类化合物、木脂素、原花青素、黄酮碳糖苷、查耳酮及香豆素。由表2可知，黄酮醇相对含量最高，达24.72%，酚酸类与黄烷醇类相对含量次之，分别达19.08%与16.07%。
表2 TUG中酚类物质的分类
Table2 Classification of phenolic compounds in TUG
类别数量相对含量/%酚酸类14119.08黄酮醇10624.72二氢黄酮4814.13黄酮类483.51花青素242.21黄烷醇类1616.07芪类化合物160.65木脂素140.08原花青素1311.62黄酮碳糖苷120.19查耳酮117.68香豆素70.05
由图1可知，保留时间7.778 s对应成分峰面积最大，相对含量最高。结合UPLC-MS/MS分析结果、前人研究[24]、 保留时间比对、加标回收验证，可推测该成分为咖啡酰酒石酸。同理，确定保留时间11.205 s的成分为(+)-儿茶素。
图1 TUG粗多酚溶液的液相色谱图
Fig.1 Liquid chromatogram of crude polyphenol solution from TUG
采用HPLC法对(+)-儿茶素与咖啡酰酒石酸标准品溶液进行检测，记录不同质量浓度标准品对应的峰面积并绘制标准曲线。其中，(+)-儿茶素在0.006～0.15 g/L范围内、咖啡酰酒石酸在0.02～1 g/L范围内均表现出良好的线性关系；(+)-儿茶素线性方程为y＝23 105 587.51x-24 195.47，咖啡酰酒石酸的线性方程为y＝33 630 684.38x+ 55 438.45，其中y为峰面积，x为目标物质量浓度/（g/L），2种物质的回归方程的R2均为0.999。基于此计算可得TUG中咖啡酰酒石酸和(+)-儿茶素质量分数分别为0.15%和0.05%。
2.2 响应面试验优化分析
由图2A可知，多酚得率随着超声时间的延长呈现先升高后降低的变化趋势，超声时间15～20 min时多酚得率基本不变，超声时间25 min时多酚得率反而下降，基于高效提取及节能综合考虑，选择超声时间为15 min；由图2B可知，多酚得率随着浸提温度的升高也呈现先升高后降低的变化趋势，在浸提温度40 ℃时，多酚得率达到峰值，这可能是由于适当升温可提升分子运动速率，促进多酚物质的溶出；而温度过高则会导致酚类物质结构被破坏或发生氧化降解，使得率下降，故选择最佳浸提温度为40 ℃；由图2C可知，提取时间在4.0 h以内时，多酚得率随着提取时间的延长而升高，超声时间继续增加时，多酚得率基本不变，故选择最佳提取时间为4 h；由图2D可知，乙醇体积分数为70%时，多酚得率最高，故选择最佳乙醇体积分数为70%。
图2 超声时间（A）、浸提温度（B）、提取时间（C）、乙醇体积分数（D）对TUG多酚得率的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic time (A), extraction temperature (B), extraction time (C) and ethanol volume fraction (D) on polyphenol yield of TUG
在单因素试验结果基础上，本研究选取对TUG多酚提取效果影响显著的4个关键因素，即超声时间（X1）、浸提温度（X2）、提取时间（X3）和乙醇体积分数（X4），开展响应面试验优化。该试验设计共设置29个处理组，且每个处理组均重复3次。响应面试验优化结果如表3所示，方差分析结果如表4所示。
表3 响应面试验优化结果
Table3 Optimization results of response surface test
序号A超声B浸提C提取D乙醇体积Y多酚时间/min温度/℃时间/h分数/%得率/%10304702.03230304701.8830504701.78430504701.76515403601.72615405602.03715403801.84815405802.0690404602.121030404601.57110404801.931230404802.061315303702.061415503701.811515305702.031615505702.14170403701.641830403701.70190405701.962030405701.672115304601.982215504602.102315304802.182415504802.132515404702.292615404702.292715404702.282815404702.302915404702.29
表4 方差分析及回归方程系数显著性检验
Table4 Analysis of variance and significance test of regression equation coefficients
AC0.030 610.030 66.200.026 0 AD0.115 610.115 623.390.000 3 BC0.034 210.032 46.550.022 7 BD0.007 210.007 21.460.246 7 A20.610 010.610 0123.41＜0.000 1校正总和1.300 028来源平方和自由度均方FP模型1.230 0140.088 217.84＜0.000 1 A0.056 010.056 011.340.004 6 B0.016 110.016 23.260.092 4 C0.104 510.104 521.150.000 4 D0.038 510.038 57.800.014 4 AB0.004 210.004 20.854 80.370 9 CD0.002 010.002 00.409 70.532 5 B20.046 010.046 09.300.008 7 C20.363 310.363 373.50＜0.000 1 D20.070 410.070 414.240.002 1残差0.069 2140.004 9失拟项0.069 0100.006 9138.000.000 1误差项0.000 240.000 1
序号25～29平均值为2.29%，标准差仅为0.0069%，变异系数小于0.3%，说明该条件下提取结果稳定性极强。模型P＜0.000 1，表明模型具有显著性，该F值由噪声导致的概率仅为0.01%。由P值可知，A、C、D、AC、AD、BC、A2、B2、C2、D2均对多酚得率存在显著影响。失拟项F＝138.00、P＜0.000 1，呈显著性，源于本响应面试验平行重复的随机纯误差极小；即便模型仅存在轻微拟合偏差，也会使失拟项F值显著偏高，进而出现模型拟合效果优异但失拟项显著的特例。该结果不影响模型可靠性，模型可用于后续预测及工艺优化。模型决定系数为0.946 9，预测决定系数为0.694 9，与校正决定系数0.893 8吻合度良好，二者差值小于0.2。信噪比可评判模型信号与噪声点比，常规阈值为4。本模型信噪比13.959 4，信号响应水平充足，可依托该模型开展实验域数据分析及参数优化。
基于回归模型绘制因素交互作用等高线图与响应面图可直观呈现因素间相互作用规律。在三维响应面图中，表面越陡峭、弯曲度越高，表明对应因素间的交互作用越强；在二维等高线图中，椭圆形等高线代表因素间存在显著交互作用，圆形等高线则表示交互作用不显著[25]。由图3可知，超声时间会影响乙醇体积分数的最优选择，当超声时间过长时，需适当提高乙醇体积分数以缓解多酚类物质的降解；浸提温度与提取时间的交互作用呈现明显的温度依赖性，高温条件下适当延长提取时间，可补偿多酚因热降解造成的损失，而在低温条件下，提取时间对多酚提取率的影响则不显著。
图3 超声时间、浸提温度、提取时间及乙醇体积分数交互作用对多酚得率影响的三维响应面图及二维等高线图
Fig.3 Three-dimensional response surface and two-dimensional contour plots showing interactive effects of ultrasonic time, extraction temperature, extraction time and ethanol volume fraction on polyphenol yield
借助Design-Expert 13软件，基于响应面试验数据拟合得到二次多元回归模型方程：Y＝2.29-0.068 3A-0.036 7B+0.093 3C+0.056 7D+0.032 5AB-0.087 5AC+ 0.017 0AD+0.090 0BC-0.042 5BD-0.022 5CD-0.306 7A2-0.084 2B2-0.236 7C2-0.104 2D2，通过求解确定TUG多酚提取的最优工艺条件为：超声时间15 min、浸提温度37 ℃、提取时间4 h、乙醇体积分数70%。为验证回归模型的可靠性，在上述最优条件下开展验证实验，测得样品中多酚得率为（2.38±0.045）%，与模型预测值2.39%高度吻合，表明所建立的回归模型具有良好的拟合度与实用性。
2.3 TUG粗多酚的分离与纯化
以70%乙醇为提取剂，结合X-5树脂静态吸附与75%乙醇洗脱工艺，从500 g TUG干粉中成功制备得到16.98 g多酚粗提物，其外观如图4所示。性能检测结果显示，该X-5树脂对TUG多酚的静态吸附率为（90.50±0.04）%，静态解吸率达（96.09±0.02）%；经检测，所得多酚粗提物纯度为（61.00±0.01）%。
图4 TUG粗多酚干粉外观
Fig.4 Appearance of crude polyphenol powder from TUG
2.4 TUG粗多酚中咖啡酰酒石酸的分离与纯化
为进一步提升X-5大孔树脂对咖啡酰酒石酸的富集效率与产品纯度，本研究采用动态洗脱法开展梯度洗脱优化实验：将TUG粗多酚溶液上样至X-5树脂柱，待静态吸附达到平衡后，依次以体积分数5%、10%、15%、20%乙醇进行梯度洗脱，收集各洗脱组分并采用HPLC法测定咖啡酰酒石酸含量。结果表明，15%乙醇为最优洗脱液，其对咖啡酰酒石酸的洗脱率及所得产物纯度明显高于其他梯度，可高效获得高纯度目标组分。
以15%乙醇对吸附咖啡酰酒石酸的X-5树脂层析柱进行动态洗脱。洗脱体积在0～200、200～350、350～400、400～450、450～500 mL区间内的洗脱液液相色谱图如图5所示。其中，0～200 mL洗脱液仅含少量杂质与未被完全吸附的咖啡酰酒石酸；200～450 mL为咖啡酰酒石酸的主要洗脱区间，该洗脱液目标物峰面积点比明显提升，大量咖啡酰酒石酸被洗出；其中200～350 mL洗脱液中咖啡酰酒石酸纯度最高，杂峰数量最少且峰形尖锐，为后续定向收集、浓缩纯化提供了关键技术依据，可有效保障产品纯度。
图5 洗脱体积0～200（A）、200～350（B）、350～400（C）、400～450（D）、450～500 mL（E）区间内洗脱液的液相色谱图
Fig.5 Liquid chromatograms of eluents collected at elution volume ranges of 0-200 (A), 200-350 (B), 350-400 (C), 400-450 (D) and 450-500 mL (E)
2.5 TUG粗多酚中(+)-儿茶素的分离与纯化
为进一步提升TUG的高值化利用水平，实现咖啡酰酒石酸与(+)-儿茶素的定向分离，本研究将去除咖啡酰酒石酸后的TUG多酚粗提物二次上样至聚酰胺树脂柱，开展梯度洗脱优化实验。待样品充分吸附后，依次以10%、20%、30%、60%乙醇进行梯度洗脱，收集各洗脱组分并通过HPLC法分析(+)-儿茶素含量与纯度。10%、20%、30%、60%乙醇洗脱液的液相色谱图如图6所示。其中，10%与20%乙醇洗脱能力较弱，仅能洗出少量(+)-儿茶素及极性较强的杂质；30%与60%乙醇均可高效洗脱(+)-儿茶素，目标物峰面积点比高且杂峰干扰少，可获得高含量(+)-儿茶素组分；综合考虑试剂消耗、洗脱效率及生产成本，30%乙醇作为洗脱液更具经济与环保效益，既能保证(+)-儿茶素的高洗脱率与纯度，又可降低高浓度乙醇的使用量与后续回收成本，为(+)-儿茶素的工业化纯化提供了可行方案。
图6 10%（A）、20%（B）、30%（C）和60%（D）乙醇梯度洗脱条件下各洗脱组分液相色谱图
Fig.6 Liquid chromatograms of eluted fractions under gradient elution with 10% (A), 20% (B), 30% (C) and 60% (D) ethanol
3 讨 论
TUG作为葡萄栽培过程中的副产物，长期以来多被废弃或作为低价值饲料利用，造成资源浪费与环境压力。多酚类物质作为植物体内重要的次生代谢产物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，是食品、医药、化妆品等领域的重要原料。本研究通过广泛靶向代谢组学、响应面优化、树脂纯化等系列技术，系统开展TUG中多酚类物质的鉴定、提取及定向纯化研究，不仅明确了TUG的多酚组成特征，建立了高效的提取纯化工艺，更为TUG的高值化利用提供了理论依据与技术支撑。
3.1 基于广靶代谢组学的TUG多酚组成鉴定
本研究采用UPLC-MS/MS技术对TUG进行酚类成分的广泛靶向代谢组学分析，共鉴定出456种单体酚类化合物，涵盖12个大类，显著高于现有葡萄果实、叶片等部位的多酚鉴定数量[26]，表明TUG是一种富含多酚资源的潜在原料。从组分分布来看，黄酮醇（24.72%）、酚酸类（19.08%）和黄烷醇类（16.07%）为TUG中含量最高的3类多酚，这与葡萄成熟果实中多酚以花青素、原花青素为主的组成特征存在明显差异[27]，推测其原因可能与葡萄幼果的生长发育阶段有关—幼果期植物处于旺盛的次生代谢阶段，黄酮醇与酚酸类物质作为基础酚类前体，合成积累量相对较高，而花青素等色素类多酚的合成则主要集中在果实成熟阶段。
3.2 TUG中高含量目标单体酚鉴定
HPLC结合标准品验证表明，咖啡酰酒石酸与(+)-儿茶素是TUG中点比最高的2种单体酚，质量分数分别为0.15%和0.05%。咖啡酰酒石酸作为葡萄中最主要的酚酸类物质，具有较强的抗氧化活性与抗炎作用[28]；(+)-儿茶素作为黄烷醇类的代表性物质，不仅具有优异的抗氧化性能，还能调节血脂、保护心血管健康[29]。2种目标物质的确定为TUG的定向开发提供了明确的靶点，也进一步证实了TUG作为多酚原料的开发价值。
3.3 基于响应面法的TUG多酚提取工艺优化
多酚类物质的提取效率受提取时间、温度、溶剂浓度、超声条件等多种因素影响[30]，单因素试验仅能确定各因素的大致适宜范围，而响应面法可通过多因素交互作用分析实现提取工艺的精准优化。本研究以超声时间、浸提温度、提取时间、乙醇体积分数为关键因素，采用4因素3水平响应面试验设计，建立了TUG多酚提取的回归模型，模型决定系数为0.946 9，校正决定系数为0.893 8，信噪比达13.959 4，表明模型拟合度高、可靠性强，可有效预测TUG多酚含量。单因素试验结果显示，超声时间、浸提温度、提取时间、乙醇体积分数对TUG多酚得率均存在较大影响，其中超声时间15～20 min、浸提温度40 ℃、提取时间4 h、乙醇体积分数70%时提取效果较佳。这与多酚类物质的理化性质密切相关：超声处理可通过空化效应破坏TUG细胞结构，促进多酚溶出，但过长时间超声会导致多酚氧化降解，降低得率；温度升高可提高多酚在溶剂中的溶解度，但超过40 ℃后，多酚类物质的酚羟基易发生氧化，同时溶剂挥发性增强，反而导致得率下降；提取时间延长可增加多酚的溶出量，但4 h后细胞内多酚已基本溶出，继续延长时间无明显促进效果，还会增加能耗与生产成本；乙醇体积分数70%时，既能保证多酚的溶解性，又能减少水溶性杂质的溶出，提高提取液的纯度。交互作用分析表明，超声时间与乙醇体积分数、浸提温度与提取时间的交互作用显著，这为提取工艺的实际应用提供了重要参考：在实际生产中，若超声时间因设备限制无法严格控制在15 min，可适当提高乙醇体积分数至75%左右，缓解多酚降解；若浸提温度低于最优值37 ℃，可适当延长提取时间，补偿多酚溶出量的不足。优化后的最优工艺条件为超声时间15 min、浸提温度37 ℃、提取时间4 h、乙醇体积分数70%，验证实验中多酚得率达（2.380±0.045）mg/g， 与预测值高度吻合，表明该工艺稳定可靠。与现有葡萄多酚提取工艺相比，本研究优化的工艺提取效率更高、能耗更低，且无需添加复杂试剂，更适合工业化大规模应用。
3.4 TUG中目标多酚的分步定向纯化工艺确定
粗多酚提取液中含有大量杂质，不仅影响目标多酚的纯度与生物活性，还会限制其在高端产品中的应用，因此纯化工艺是多酚资源开发的关键环节。本研究采用“X-5树脂粗纯化→X-5树脂梯度洗脱纯化咖啡酰酒石酸→聚酰胺树脂梯度洗脱纯化(+)-儿茶素”的分步纯化策略，实现了TUG中2种目标多酚的定向分离与富集，具有显著的技术优势。X-5大孔树脂具有吸附容量大、解析率高、再生性能好、成本低廉等优点，是多酚类物质粗纯化的常用材料[19]。本研究中，X-5树脂对TUG多酚的静态吸附率达（90.50±0.04）%，静态解吸率达（96.09±0.02）%，经粗纯化后多酚纯度达（61.00±0.01）%，显著高于粗提物纯度，表明X-5树脂可有效去除粗提物中的大部分杂质，为后续目标多酚的纯化奠定了基础。在咖啡酰酒石酸的定向纯化中，通过X-5树脂梯度洗脱优化，确定15%乙醇为最优洗脱液，该条件下的洗脱液可特异性富集咖啡酰酒石酸，有效避免其他多酚组分的干扰。洗脱曲线分析显示，200～350 mL洗脱区间为咖啡酰酒石酸的高纯度洗脱段，此区间内洗脱液中目标物峰形尖锐、杂峰极少，经浓缩干燥后可获得高纯度的咖啡酰酒石酸精品，满足食品、化妆品等领域的应用要求。在(+)-儿茶素纯化过程中，采用聚酰胺树脂进行二次分离，其核心优势在于聚酰胺树脂可通过氢键作用特异性结合黄烷醇类物质，实现与其他多酚组分的高效分离[31]。梯度洗脱实验表明，30%乙醇作为洗脱液时，既能保证(+)-儿茶素的高洗脱率，又能有效降低杂质含量，且相较于60%乙醇洗脱方案，可减少乙醇用量30%以上，降低了生产成本与环保压力。此外，聚酰胺树脂与X-5树脂均具有良好的再生性能，经5次再生处理后，吸附率与解析率仍保持在85%以上，可重复利用，进一步降低了工业化生产成本，提升了工艺的经济性与可持续性。
相较于现有葡萄多酚纯化工艺，本研究采用的分步纯化策略具有明显优势：一是能够实现2种高价值目标多酚的定向分离，避免单一纯化导致的资源浪费；二是选用的树脂材料成本低廉、再生性好，工艺操作简单、无需复杂设备，适合大规模工业化应用；三是纯化过程未使用有毒有害试剂，符合绿色生产理念，所得产品安全性高，具有直接应用于功能食品、医药等领域的潜力。
从应用前景来看，TUG多酚及其纯化产物可广泛应用于多个领域：在食品工业中，可作为天然抗氧化剂添加到油脂、饮料、糕点等产品中，延长产品保质期，同时提升产品的营养价值；在化妆品领域，咖啡酰酒石酸的抗炎、抗氧化特性可用于开发护肤品，改善皮肤状态，(+)-儿茶素的心血管保护作用可用于功能性化妆品的研发；在医药领域，2种目标多酚的生物活性可为新型药物的研发提供原料支撑。此外，TUG多酚的开发还可带动葡萄栽培产业的产业链延伸，增加果农收入，实现经济效益与环境效益的双赢。
3.5 前景与展望
尽管本研究取得了阶段性成果，但仍存在一些不足，后续研究方向：一是对TUG中456种多酚的生物活性研究尚不全面，尤其是微量多酚（如芪类化合物、木脂素）的活性潜力有待进一步挖掘；二是现有纯化工艺虽已达到工业化应用的基本要求，但在纯化效率与产品纯度上仍有提升空间，可通过树脂改性、工艺参数进一步优化等方式完善；三是可开展TUG多酚的制剂研究，开发多酚胶囊、口服液等产品，拓展其应用形式。未来，可结合分子生物学等技术，深入探究TUG多酚的合成机制与作用靶点，为其高值化利用提供更坚实的理论支撑，推动葡萄副产物资源的高效利用与产业升级。
4 结 论
本研究构建了一种简便易行且高效的咖啡酰酒石酸与(+)-儿茶素分离纯化方法。有机溶剂提取法和微波辅助浸提TUG粗多酚的最佳条件为：超声时间15 min、浸提温度37 ℃、提取时间4 h、乙醇体积分数70%，TUG多酚中咖啡酰酒石酸与(+)-儿茶素的提取纯化工艺：X-5树脂吸附、15%乙醇梯度洗脱可提取咖啡酰酒石酸，聚酰胺树脂吸附、30%乙醇梯度洗脱可提取(+)-儿茶素。
[1] Dou Jiao, Meng Yonghong, Liu Lei, et al. Purification, characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thinned-young apple[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015,72: 31-40. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2014.07.053.
[2] Mazzola M. Elucidation of the microbial complex having a causal role in the development of apple replant disease in Washington[J]. Phytopathology, 1998, 88(9): 930-938. DOI:10.1094/phyto.1998.88.9.930.
[3] Wei Mengyuan, Ma Tingting, Cao Muming, et al. Biomass estimation and characterization of the nutrient components of thinned unripe grapes in China and the global grape industries[J]. Food Chemistry,2022, 15: 100363. DOI:10.1016/j.fochx.2022.100363.
[4] Honisch C, Osto A, Dupas de Matos A, et al. Isolation of a tyrosinase inhibitor from unripe grapes juice: a spectrophotometric study[J]. Food Chemistry, 2020, 305: 125506. DOI:10.1016/j.foodchem.2019.125506.
[5] Gambuti A, Picariello L, Rinaldi F, et al. Modification of the organic acid profile of grapes due to climate changes alters the stability of red wine phenolics during controlled oxidation[J]. Vitis, 2019, 58(5): 127-133. DOI:10.5073/vitis.2019.58.special-issue.127-133.
[6] 郭崇婷, 李旋, 毕金峰, 等. 疏果活性成分、功能特性及其应用研究进展[J]. 食品科学, 2020, 41(11): 303-309. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190702-024.
[7] Gutiérrez-Gamboa G, Wei Mengyuan, Moreno-Simunovic Y, et al.Potential opportunities of thinned clusters in viticulture: a mini review[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2021,101(11): 4435-4443. DOI:10.1002/jsfa.11170.
[8] Fia G, Bucalossi G, Proserpio C, et al. Unripe grapes: an overview of the composition, traditional and innovative applications, and extraction methods of a promising waste of viticulture[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research, 2022, 28(1): 8-26. DOI:10.1111/ajgw.12522.
[9] Pour N M S. General and polyphenolic composition of unripe grape juice (verjus/verjuice) from various producers[J]. Mitteilungen Klosterneubg, 2008, 58: 28-31.
[10] Jančářová I, Jančář L, Náplavová A, et al. Changes of organic acids and phenolic compounds contents in grapevine berries during their ripening[J]. Open Chemistry, 2013, 11(10): 1575-1582. DOI:10.2478/s11532-013-0288-2.
[11] 王美丽. 葡萄成熟过程与葡萄酒陈酿过程单体酚变化的研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2006.
[12] Bagheri H, Esmaiili M. Ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from unripe grape (Qora)[J]. Erwerbs-Obstbau, 2017,59(3): 221-226. DOI:10.1007/s10341-016-0315-5.
[13] Guler A, Tokusoglu O, Artik N. Alterations on phenolic compounds and antioxidant activity during sour grape juice concentrate processing[J]. Journal of Viticulture and Enology Science and Technology, 2018, 33(2): 136-144. DOI:10.1051/ctv/20183302136.
[14] Kammerer J, Schweizer C, Carle R, et al. Recovery and fractionation of major apple and grape polyphenols from model solutions and crude plant extracts using ion exchange and adsorbent resins[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2011, 46(8): 1755-1767. DOI:10.1111/j.1365-2621.2011.02681.x.
[15] Aliakbarian B, Fathi A, Perego P, et al. Extraction of antioxidants from winery wastes using subcritical water[J]. The Journal of Supercritical Fluids, 2012, 65: 18-24. DOI:10.1016/j.supflu.2012.02.022.
[16] Pingret D, Fabiano-Tixier A S, Le Bourvellec C, et al. Lab and pilotscale ultrasound-assisted water extraction of polyphenols from apple pomace[J]. Journal of Food Engineering, 2012, 111(1): 73-81.DOI:10.1016/j.jfoodeng.2012.01.026.
[17] Zheng Huzhe, Hwang I W, Kim S K, et al. Optimization of carbohydrate-hydrolyzing enzyme aided polyphenol extraction from unripe apples[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2010, 53(3): 342-350. DOI:10.3839/jksabc.2010.053.
[18] Shojaee-Aliabadi S, Hosseini S M, Tiwari B, et al. Polyphenols content and antioxidant activity of Ghure (unripe grape) Marc extract: influence of extraction time, temperature and solvent type[J].International Journal of Food Science & Technology, 2013, 48(2): 412-418. DOI:10.1111/j.1365-2621.2012.03203.x.
[19] Sun Lijun, Guo Yurong, Fu Chengcheng, et al. Simultaneous separation and purification of total polyphenols, chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples[J]. Food Chemistry, 2013, 136(2):1022-1029. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.09.036.
[20] Sun Lijun, Liu Dongjie, Sun Jiaojiao, et al. Simultaneous separation and purification of chlorogenic acid, epicatechin, hyperoside and phlorizin from thinned young Qinguan apples by successive use of polyethylene and polyamide resins[J]. Food Chemistry, 2017, 230:362-371. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.03.065.
[21] Chen Wei, Gong Liang, Guo Zilong, et al. A novel integrated method for large-scale detection, identification, and quantification of widely targeted metabolites: application in the study of rice metabolomics[J].Molecular Plant, 2013, 6(6): 1769-1780. DOI:10.1093/mp/sst080.
[22] Fraga C G, Clowers B H, Moore R J, et al. Signature-discovery approach for sample matching of a nerve-agent precursor using liquid chromatography-mass spectrometry, XCMS, and chemometrics[J].Analytical Chemistry, 2010, 82(10): 4165-4173.
[23] 魏梦媛. 鲜食葡萄疏除幼果营养分析及应用探究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2022. DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2022.001799.
[24] Vendramin V, Viel A, Vincenzi S. Caftaric acid isolation from unripe grape: a “green” alternative for hydroxycinnamic acids recovery[J].Molecules, 2021, 26(4): 1148. DOI:10.3390/molecules26041148.
[25] 郑百良. 谷糠酚类物质提取、分离及活性研究[D]. 洛阳: 河南科技大学, 2022. DOI:10.27115/d.cnki.glygc.2022.001046.
[26] Du Yan, Li Xingyan, Xiong Xiaolin, et al. An investigation on polyphenol composition and content in skin of grape (Vitis vinifera L. cv. Hutai No.8) fruit during ripening by UHPLC-MS2 technology combined with multivariate statistical analysis[J]. Food Bioscience,2021, 43: 101276. DOI:10.1016/j.fbio.2021.101276.
[27] Roufas K, Chatzimitakos T, Athanasiadis V, et al. Changes in polyphenols and anthocyanin pigments during ripening of Vitis vinifera cv. Maratheftiko: a two-year study[J]. Beverages, 2023, 9(2): 39.DOI:10.3390/beverages9020039.
[28] Boulebd H, Mechler A, Thi Hoa N, et al. Insights on the kinetics and mechanisms of the peroxyl radical scavenging capacity of caftaric acid: the important role of the acid-base equilibrium[J]. New Journal of Chemistry, 2022, 46(16): 7403-7409.
[29] Chan Y H, Moss J W E, Williams J O, et al. (+)-Catechin attenuates multiple atherosclerosis-associated processes in vitro, modulates disease-associated risk factors in C57BL/6J mice and reduces atherogenesis in LDL receptor deficient mice by inhibiting inflammation and increasing markers of plaque stability[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2023, 67(14): 2200716. DOI:10.1002/mnfr.202200716.
[30] Osorio-Tobón J F. Recent advances and comparisons of conventional and alternative extraction techniques of phenolic compounds[J].Journal of Food Science and Technology, 2020, 57(12): 4299-4315.DOI:10.1007/s13197-020-04433-2.
[31] 张佰清, 张艳艳, 李龙杰. 二次柱层析制备高纯度树莓籽原花青素的工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(8): 163-166. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201108037.