高血压是一种全球性的高发性心血管疾病,也是引起中风、心脏病和肾功能衰竭等重大健康问题的主要危险因素[1]。目前临床上常用的合成降压药如卡托普利、依那普利等长期服用可引起干咳、头痛等不良反应[2]。因此,天然来源的降血压肽成为研究热点[3]。降血压肽是一类具有血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性的多肽类物质。研究显示,天然来源的降血压肽不仅具有显著的降血压功效,对正常血压个体无不良影响,且迄今为止鲜见明显毒副作用报道[4]。
在天然降血压肽的众多来源中,益生菌尤其是乳酸菌已成为其重要且有效的产生来源。益生菌能够定植于肠道并调节菌群组成与代谢,对高血压、动脉粥样硬化等心血管代谢疾病具有保护作用[5-6]。乳酸菌在发酵过程中能够特异性水解酪蛋白,释放具有ACE抑制活性的短肽,从而使发酵产物兼具调节肠道健康与辅助降压的双重功能[7-8]。源自乳酸菌发酵乳的VPP(Val-Pro-Pro)与 IPP(Ile-Pro-Pro)作为代表性降压三肽,除具有ACE抑制活性外,其改造衍生物还可显著促进肌细胞葡萄糖摄取,通过腺苷酸活化蛋白激酶/葡萄糖转运蛋白4通路调控糖代谢;动物试验证实,长期摄入富集VPP、IPP的发酵乳可显著延缓自发性高血压大鼠血压上升,降压效果与活性三肽摄入剂量呈正相关[9-10]。近年来,从乳酸菌发酵产物中分离ACE抑制肽的研究逐渐增多,副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)[11]、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)[12-13]、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)[14]等菌株均被证实可通过此途径发挥降压作用。
骆驼乳具有独特的蛋白组成,其不含β-乳球蛋白和αs1-酪蛋白,乳清蛋白含量较高,酪蛋白胶束结构更松散,因此更易被乳酸菌水解并释放生物活性肽。研究表明,驼乳经乳酸菌发酵后可产生多种ACE抑制肽。传统发酵驼乳制品中蕴藏着丰富的乳酸菌资源,是挖掘新型ACE抑制益生菌的优良菌种库[15]。已有研究从驼乳中成功分离出副干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌等多种乳酸菌,并证实其发酵驼乳具有ACE抑制活性[16-17]。然而,这些自然筛选菌株的初始ACE抑制率普遍偏低,难以满足工业化应用需求。菌株的产肽能力受发酵条件(如碳源、氮源、温度、pH值等)显著影响,需通过系统的工艺优化才能充分释放其ACE抑制潜力。
因此,本研究以实验室保藏的539株源自内蒙古驼乳的益生菌为研究对象,根据ACE抑制率从中筛选出ACE抑制活性较高的益生菌,并通过生理生化实验及分子生物学技术进行鉴定。通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验设计对该菌株发酵条件进行优化。本研究旨在为益生菌源降血压肽制剂的开发提供优良菌种资源,并为降血压相关功能食品的研发应用提供理论依据。
供试菌株均来自本研究团队前期从内蒙古驼乳中筛选的539株潜在益生菌,样品采集于呼和浩特市、鄂尔多斯市、阿拉善盟及赤峰市巴林右旗等4个地区,菌株现保存于内蒙古农业大学食品质量与安全实验室(-80 ℃保藏)。
脱脂乳粉 安徽白鲨生物科技有限公司;葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糖浆、可溶性淀粉、甘露醇、蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸铵、甘氨酸、牛肉浸粉 上海泽生科技开发股份有限公司;ACE(1 U/mL)、细菌基因组DNA提取试剂盒、糖发酵培养管试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;马尿酰组氨酸亮氨酸(hippuryl-histidyl-leucine,HHL)溶液 上海麦克林生化科技股份有限公司;乙腈、三氟乙酸 美国Sigma-Aldrich公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
MRS肉汤培养基:蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉8.0 g/L、 酵母粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0 mL/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、乙酸钠5.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L。
BHI肉汤培养基:脑心浸粉12.5 g/L、牛脑浸粉5.0 g/L、 蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖2.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钠2.5 g/L。
以上培养基均置于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,灭菌后冷却备用。
脱脂乳:将脱脂乳粉按10.00 g/100 mL溶解于蒸馏水中,于115 ℃高压蒸汽灭菌15 min,冷却后备用。
PR124ZH电子天平 奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;PB-10精密pH计 德国Sartorius公司;YXQ-LS-100SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司;UH 5300紫外-可见分光光度计 日本日立公司; Eppendorf 5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;DX96快速梯度聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、ZORBAX SB-C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 安捷伦科技(中国)有限公司。
1.3.1 菌株的活化
将保存的供试菌株解冻后取200 μL菌液接种于5 mL的MRS/BHI肉汤培养基中进行活化,于37 ℃恒温培养箱中静置培养24 h。其中,菌株活化使用与保藏培养基相同的液体培养基。传代2次后备用,采用稀释涂布法测定菌液终浓度,调整至2×108 CFU/mL。
1.3.2 益生菌筛选及鉴定
1.3.2.1 益生菌筛选
采用相应的液体活化培养基将供试菌株于37 ℃培养活化传代2次后备用,菌液终浓度达到2×108 CFU/mL。取2 mL二代菌液离心(8 000 r/min、10 min),去上清液,使用无菌生理盐水洗涤2次后重悬至1 mL无菌生理盐水中。将菌悬液按2%(V/V)的接种量接种至脱脂乳中,于37 ℃发酵24 h,根据ACE抑制率筛选目标菌株。
1.3.2.2 糖发酵试验
参考GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》进行糖发酵试验。分别测定菌株Y43-3-1对纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖的利用情况。将菌悬液接种于含上述糖类的培养管中,37 ℃培养24~48 h,观察颜色变化,若培养管由紫色变为黄色,表明该糖类被利用(阳性);若颜色不变(仍为紫色),表明不被利用(阴性)。
1.3.2.3 分子生物学鉴定
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA,使用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rDNA基因。PCR扩增体系(50 μL):在PCR管中依次加入2×Taq PCR Master Mix 25 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 2 μL,最后用灭菌蒸馏水补足至50 μL。PCR扩增条件:96 ℃预变性5 min;96 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;35个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。对获得的双向测序结果进行拼接,将拼接后的16S rDNA序列通过BLAST程序在NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对,并利用MEGA 11.0软件构建系统发育树。
1.3.3 发酵条件优化单因素试验
以10.00 g/100 mL脱脂乳为发酵基质,不添加外源碳源和氮源,接种量2%(V/V)、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h、初始pH自然(约为6.5)。在上述固定基础发酵条件下依次考察碳源种类(蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糖浆、可溶性淀粉、甘露醇)、葡萄糖添加量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL)、氮源种类(尿素、硫酸铵、甘氨酸、牛肉浸粉、酵母粉、蛋白胨)、酵母粉添加量(6、8、10、12、14 g/L)、发酵时间(20、24、28、32、36 h)、发酵温度(35、37、39、41、43 ℃)、接种量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,V/V)及初始pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)对ACE抑制率的影响。
1.3.4 Plackett-Burman试验设计
Plackett-Burman试验设计在单因素优化结果的基础上,以葡萄糖添加量(A)、酵母粉添加量(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)、接种量(E)、初始pH值(F)6个因素为考察对象,以菌株Y43-3-1发酵上清液的ACE抑制率为响应值,筛选出对菌株Y43-3-1的ACE抑制能力具有显著影响的因素。试验设计因素及水平见表1。
表1 Plackett-Burman试验设计因素及水平
Table1 Factors and levels of Plackett-Burman design
B酵母粉添加量/(g/L)713 C发酵时间/h2028因素低水平(-1)高水平(+1)A葡萄糖添加量/(g/100 mL)0.52.5 D发酵温度/℃3539 E接种量/%1.03.0 F初始pH5.07.0
1.3.5 最陡爬坡试验设计
正效应因素按其回归系数大小设定变化步长,负效应因素则沿相反方向调整[18]。以ACE抑制率的响应值为依据,确定后续Box-Behnken试验设计的中心点位置,从而明确其优化区间。
1.3.6 Box-Behnken试验设计
根据Plackett-Burman试验结果筛选出的3个关键显著因素:葡萄糖添加量(A)、酵母粉添加量(B)、发酵时间(C)为自变量,以ACE抑制率为响应值进行Box-Behnken试验设计(表2),并构建二次回归模型。根据最陡爬坡试验结果选择ACE抑制能力最高的一组培养条件作为后续Box-Behnken试验设计的中心点,进一步优化发酵条件,Box-Behnken试验设计因素及水平见表2。
表2 Box-Behnken试验设计因素及水平
Table2 Factors and levels of Box-Behnken design
因素低水平(-1)中心水平(0)高水平(+1)A葡萄糖添加量/(g/100 mL)1.51.92.3 B酵母粉添加量/(g/L)101214 C发酵时间/h242832
1.3.7 ACE抑制率测定
采用HPLC法[19]测定ACE含量。
预处理条件:在1.5 mL离心管中加入200 μL 5 mmol/L HHL溶液(溶于0.1 mol/L硼酸盐缓冲液,含0.3 mol/L NaCl,pH 8.3)和80 μL发酵上清液,对照组以80 μL 0.1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.3)代替发酵上清液,37 ℃水浴5 min,加入20 μL ACE溶液(0.1 U/mL),混匀后在37 ℃水浴反应30 min。加入250 μL 1 mol/L盐酸溶液终止反应。反应溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC测定。
HPLC检测条件:C18反相色谱柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-超纯水(20∶80,V/V), 含0.01%三氟乙酸;流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长228 nm;进样量20 μL。
定性定量分析:依据产生的马尿酸保留时间进行定性,以其峰面积进行定量。
抑制率按下式计算:
式中:A为对照中马尿酸的峰面积;B为添加发酵上清液样品中马尿酸的峰面积。
所有实验均重复测定3次,结果以x±s表示。采用Design-Expert 13.0进行Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计。采用SPSS 26.0进行单因素方差分析及多重比较检验,显著性水平α=0.05。采用Origin 2022绘图。
2.1.1 高ACE抑制活性益生菌的筛选
以实验室前期分离保存的539株潜在益生菌为供试菌株,由表3可知,共筛选出9株高ACE抑制活性(ACE抑制率大于30.00%)菌株。其中菌株Y43-3-1抑制率最高,为58.16%,因此选取菌株Y43-3-1为目的菌株。
表3 9株筛选菌株的ACE抑制率
Table3 ACE inhibition rates of nine screened strains
序号菌号ACE抑制率/%1Y43-3-158.16±0.08a 2YM37-1-254.30±0.13ab 3YM46-1-153.27±0.10ab 4YB29-1-248.58±0.08bc 5YB32-141.65±0.14cd 6YB5-1-139.81±0.18cd 7YB4-3-1-238.89±0.03cd 8YB33-3-2-137.24±0.20d 9YM39-131.93±0.13d
注:菌号编号中,Y表示厌氧培养;B表示BHI培养基;M表示MRS培养基;同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.1.2 菌株Y43-3-1的糖发酵试验
糖发酵试验结果显示,菌株Y43-3-1能够利用纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖。该碳源利用特征与植物乳植杆菌典型表型一致,初步确定菌株Y43-3-1疑似植物乳植杆菌。
2.1.3 菌株Y43-3-1的分子生物学鉴定
由图1可知,菌株Y43-3-1与Lactiplantibacillus plantarum strain NWAFU1329(MG565988.1)亲缘关系最近,聚于同一分支。因此将其鉴定为L. plantarum。
图1 基于16S rDNA基因序列构建的菌株Y43-3-1系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of strain Y43-3-1 constructed based on 16S rDNA gene sequences
2.2.1 碳源种类及最适碳源添加量的确定
由图2A可知,与未添加碳源的对照组相比,所有供试碳源均能有效促进菌体生长及其ACE抑制活性物质的合成。当以葡萄糖为碳源时,ACE抑制率最高,达到58.77%,显著高于其他碳源组(P<0.05)。这一结果与乳酸菌的代谢特性相符,葡萄糖是乳酸菌优先利用的速效碳源,可通过糖酵解途径快速为菌体生长和蛋白酶合成提供能量与前体物质,从而促进酪蛋白的水解及ACE抑制肽的释放[20]。因此,选择最优碳源为葡萄糖。
图2 碳源种类(A)及葡萄糖添加量(B)对ACE抑制率的影响
Fig.2 Effects of carbon source types (A) and glucose addition dosage (B) on ACE inhibition rate
由图2B可知,随着葡萄糖添加量在0.5~2.5 g/100 mL 范围内增加,菌株Y43-3-1发酵上清液的ACE抑制率呈先上升后下降的趋势。当葡萄糖添加量为1.50 g/100 mL时,ACE抑制率最高,达到59.32%。当添加量低于1.50 g/100 mL时,碳源供应不足,菌体生长受限,蛋白酶合成量减少,导致ACE抑制率偏低;当添加量高于1.50%时,过量的葡萄糖会导致菌体代谢向产酸方向过度偏移,发酵液pH值迅速下降,可能抑制蛋白酶活性或使已产生的ACE抑制肽发生降解,同时过酸环境也会影响菌株的正常生长代谢,导致ACE抑制率下降。因此,选择葡萄糖添加量1.50 g/100 mL进行后续实验。
2.2.2 氮源种类及最适氮源添加量的确定
由图3A可知,与未添加氮源的对照组相比,所有供试氮源均能有效促进菌体生长及其ACE抑制活性物质的合成。其中,酵母粉组的ACE抑制率最高,达到59.17%,显著高于其他氮源组(P<0.05)。这是因为酵母粉不仅提供丰富的氨基酸和小肽,还含有嘌呤、嘧啶等生长因子,能够有效促进乳酸菌的增殖和蛋白酶系统的表达,从而增强对酪蛋白的水解能力,释放更多ACE抑制肽[21]。相比之下,无机氮源(如尿素、硫酸铵)缺乏生长因子,难以支持菌株的高密度生长;牛肉浸粉和蛋白胨虽为有机氮源,但其促生长效果不及酵母粉[22]。因此,选择最优氮源为酵母粉。
图3 氮源种类(A)及酵母粉添加量(B)对ACE抑制率的影响
Fig.3 Effects of nitrogen source types (A) and yeast powder addition dosage (B) on ACE inhibition rate
由图3B可知,随着酵母粉添加量在6~14 g/L范围内增加,菌株Y43-3-1发酵上清液的ACE抑制率呈先上升后下降的趋势;当酵母粉添加量为10 g/L时,ACE抑制率最高(59.12%),且与其他处理组存在显著差异(P<0.05)。因此,选择酵母粉添加量10 g/L进行后续实验。
2.2.3 发酵时间的确定
由图4可知,随着发酵时间在20~36 h范围内增加,菌株Y43-3-1发酵上清液的ACE抑制率呈先上升后下降的趋势;当发酵时间为24 h时,ACE抑制率最高,达到58.58%。发酵时间过短(20 h)时,菌株生长尚未达到稳定期,蛋白酶分泌量不足,酪蛋白水解不充分,导致ACE抑制肽产量较低;发酵时间过长(28~36 h)时,已产生的ACE抑制肽可能被菌株自身分泌的肽酶进一步水解为更小的肽段或游离氨基酸,导致ACE抑制活性下降,同时发酵体系中代谢产物如乳酸的积累也可能对蛋白酶活性产生反馈抑制[23]。因此,选择发酵时间24 h进行后续实验。
图4 发酵时间对菌株Y43-3-1发酵上清液ACE抑制率的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on ACE inhibition rate of fermentation supernatant from strain Y43-3-1
2.2.4 发酵温度的确定
由图5可知,随着发酵温度在35~43 ℃范围内升高,菌株Y43-3-1发酵上清液的ACE抑制率呈先上升后下降的趋势;当发酵温度为37 ℃时,ACE抑制率最高,达58.61%,且与其他处理组存在显著差异(P<0.05)。因此,选择发酵温度为37 ℃进行后续实验。
图5 发酵温度对菌株Y43-3-1发酵上清液ACE抑制率的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on ACE inhibition rate of fermentation supernatant from strain Y43-3-1
2.2.5 接种量的确定
由图6可知,随着接种量在0.5%~3.0%范围内增加,菌株Y43-3-1发酵上清液的ACE抑制率呈先上升后下降的趋势;当菌株Y43-3-1接种量为2.0%(V/V)时,ACE抑制率最高(58.64%),且与其他处理组存在显著差异(P<0.05)。因此,选择接种量2.0%(V/V)进行后续实验。
图6 接种量对菌株Y43-3-1发酵上清液ACE抑制率的影响
Fig.6 Effect of inoculation volume on ACE inhibition rate of fermentation supernatant from strain Y43-3-1
2.2.6 初始pH值的确定
由图7可知,初始pH值对菌株的ACE抑制率具有显著影响,初始pH值在5.0~7.5范围增加时,ACE抑制率先增加后降低。当初始pH值为6.0时,ACE抑制率最高,达58.15%,且与其他处理组存在显著差异(P<0.05)。因此,选择初始pH 6.0进行后续实验。
图7 初始pH值对菌株Y43-3-1发酵上清液ACE抑制率的影响
Fig.7 Effect of initial pH on ACE inhibition rate of fermentation supernatant from strain Y43-3-1
Plackett-Burman试验设计结果如表4所示,基于此构建各因素与ACE抑制率的一次回归方程:Y=56.32+1.73A+2.45B+1.01C-0.34D-0.15E+0.23F。
表4 Plackett-Burman试验设计及结果
Table4 Plackett-Burman design and corresponding results
时间/h温度/℃量/%pH抑制率/%(g/100 mL)(g/L)60.5720391751.8572.5720353554.43100.51328391557.27 A葡萄糖 B酵母粉试验号添加量/添加量/C发酵D发酵E接种F初始ACE 12.51320393758.8220.51328353757.9132.5728391756.2340.51320393555.7650.5728353754.1482.51320351760.3492.51328351562.48112.5728393555.95120.5720351550.62
由表5可知,该模型显著(P<0.05);模型信噪比为18.162 6(>4);决定系数(R2)=0.976 7,说明模型线性方程能够解释97.67%的响应变化;修正决定系数(
=0.948 8,代表方程可解释94.88%的变异,因此,该模型能够用于ACE抑制率预测与发酵工艺优化。由P值可知,葡萄糖添加量(A)、酵母粉添加量(B)及发酵时间(C)3个因素均为显著影响因素。
表5 Plackett-Burman试验设计回归模型方差分析
Table5 Analysis of variance for regression model of Plackett-Burman design
A35.71135.7161.380.000 51.7328.56*E0.26410.2640.453 90.530 4-0.150.21来源平方和自由度均方FP效应贡献度/%显著性模型122.13620.3634.990.000 697.67*B71.83171.83123.490.000 12.4557.45*C12.32112.3221.180.005 81.019.85*D1.3611.362.340.186 8-0.341.09 F0.64410.6441.110.340 90.230.52残差2.9150.581 72.33总离差125.0411
注:*.差异显著(P<0.05)。
从各因素的效应方向来看,葡萄糖添加量(A)、酵母粉添加量(B)和发酵时间(C)的回归系数均为正值,表明在试验水平范围内,适当提高这3个因素的水平有助于提升ACE抑制率。其中酵母粉添加量的效应值最大(2.45),说明氮源供应对菌株产肽能力的促进作用最为突出,这与酵母粉富含生长因子、能有效促进蛋白酶合成的特性相符。发酵温度(D)和接种量(E)的回归系数为负值,但未达到显著水平(P>0.05),表明在本实验设定范围内,这2个因素对ACE抑制率的影响相对有限,这可能与菌株对温度和接种量具有较宽的适应范围有关。
基于Plackett-Burman试验设计所得回归模型及关键因素效应值方向和大小确定最陡爬坡步长:葡萄糖添加量以0.2 g/100 mL步长递增,酵母粉添加量以1 g/L步长递增,发酵时间以2 h步长递增,以A葡萄糖添加量1.5 g/100 mL、B酵母粉添加量10 g/L、C发酵时间24 h进行最陡爬坡试验。由表6可知,在第3组中,葡萄糖添加量为1.9 g/100 mL、酵母粉添加量为12 g/L、发酵时间为28 h,ACE抑制率达到最高值(65.92%)。以该条件确定Box-Behnken试验设计的中心点。
表6 最陡爬坡试验设计与结果
Table6 Design and results of steepest ascent experiment
试验号A葡(g萄/1糖00添 m加L)量/添加B量酵/母(粉g/L)时C发间酵/hACE抑制率/%11.5102458.6521.7112663.7831.9122865.9242.1133063.43
2.5.1 Box-Behnken试验设计结果
在上述试验结果的基础上,以葡萄糖添加量(A)、酵母粉添加量(B)和发酵时间(C)为考察因素,以ACE抑制率(Y)为响应值进行Box-Behnken试验设计。通过Design-Expert 13.0软件对表7结果进行多元二次回归拟合分析,得到二次多项式回归方程:Y=66.00+0.80A+ 0.63B+0.65C+0.08AB+0.23AC-0.08BC-2.86A2-4.75B2-6.96C2。
表7 Box-Behnken试验设计及结果
Table7 Box-Behnken design and corresponding results
11.5102859.5042.3142861.8071.5123260.00101.9142461.00131.9122866.20161.9122865.80试验号A葡萄糖添加量/B酵母粉C发酵ACE(g/100 mL)添加量/(g/L)时间/h抑制率/%22.3102860.8031.5142860.2051.5122459.0062.3122460.3082.3123262.2091.9102459.20111.9103260.50121.9143262.00141.9122865.90151.9122866.10171.9122866.00
由表8可知,该模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05),R2=0.995 7,
,说明99.01%的响应变异性可以被模型解释,表明该模型可靠,拟合程度良好。由P值可知,一次项A、B、C及二次项A2、B2、C2对ACE抑制率的影响水平极显著(P<0.01),其他项对结果影响不显著(P>0.05)。由F值可知,对ACE抑制率影响的顺序为葡萄糖添加量(A)>发酵时间(C)>酵母粉添加量(B)。
表8 Box-Behnken试验设计回归模型方差分析
Table8 Analysis of variance for regression model of Box-Behnken design
模型117.21913.02178.76<0.000 1 C3.3813.3846.390.000 3残差0.5170.033失拟项0.4130.0503.000.125 6纯误差0.1040.020来源平方和自由度均方FP A5.1215.1270.27<0.000 1 B3.1313.1342.890.000 3 AB0.022 510.022 50.308 80.593 7 BC0.022 510.022 50.308 80.595 7 AC0.202 510.202 52.780.139 4 A234.50134.50475.54<0.000 1 B227.65127.65379.48<0.000 1 C232.13132.13441.03<0.0001总离差117.7216
2.5.2 响应面分析
响应面图中,等高线呈椭圆形表示两因素交互作用较强,圆形则表示交互作用较弱;曲面坡度越陡峭,表明该因素对响应值的影响越大;开口向下的凸形曲面表明响应值存在最大值[24]。
如图8A所示,葡萄糖添加量(A)和酵母粉添加量(B)、葡萄糖添加量(A)和发酵时间(C)、酵母粉添加量(B)和发酵时间(C)间交互作用响应曲面图坡度较平缓,等高线趋于圆形,有一定交互作用,但均不显著,与方差分析结果一致。
图8 各因素交互作用对ACE抑制率影响的响应面及等高线图
Fig.8 Response surface and contour plots of interactive effects of various factors on ACE inhibition rate
通过Design-Expert 13.0软件得出最佳发酵条件:葡萄糖添加量1.90 g/100 mL、酵母粉12.00 g/L、发酵时间28 h、温度37 ℃、接种量2%(V/V)、初始pH 6.0。在此条件下,ACE抑制率预测值为66.20%。在最优条件下进行3次平行验证实验,ACE抑制率实际值为65.72%,与模型的相对误差极小,ACE抑制率较优化前(58.16%)明显提高。在乳制品体系中,袁林[13]、陈舒柔[25]、张洪志[26]等报道的ACE抑制率分别为70.50%、约65%和65.17%;在非乳制品体系中,Hokmabadinazhad[27]、Mirzapour[28]等报道的抑制率分别约为55%和81%。上述差异主要归因于发酵底物的不同,脱脂乳中富含的酪蛋白是ACE抑制肽的优质前体物质。
本研究采用单因素试验及响应面试验对传统驼奶中分离的植物乳植杆菌Y43-3-1发酵条件进行优化。结果表明,葡萄糖添加量、酵母粉添加量和发酵时间是3个显著影响因素(P<0.05)。最优发酵条件为:以10%脱脂乳为基底,葡萄糖添加量1.9 g/100 mL、酵母粉添加量12 g/L、发酵时间28 h、发酵温度37 ℃、接种量2%(V/V)、初始pH 6.0。在此优化条件下,ACE抑制率实测值达到65.72%,较优化前(58.16%)明显提高。本研究为降血压功能性食品及益生菌制剂开发提供了新的菌种资源与工艺参考。
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