灵菌红素亦称灵杆菌素，为含有3个吡咯环的脂溶性、非扩散性化合物，是一种天然红色素家族的统称[1-2]。因其具有抑菌、杀藻、抗原虫、抗病毒、抗癌、抗肿瘤、提高免疫力等生物学活性[3-8]，以及在药物开发、环境治理、食品添加剂制备[9]等方面应用价值高而引起人们的重视[10-11]。已有研究表明，可以合成灵菌红素的微生物主要有沙雷氏菌属、假单胞菌属、放线菌属、弧菌属、链霉菌属等属的一些种和某些特殊的海洋细菌[3,12-15]，其中以沙雷氏菌属报道居多[3]。粘质沙雷氏菌是最早发现的可以产灵菌红素的微生物[16]，目前，粘质沙雷氏菌仍然是人们研究灵菌红素合成的模式种[17-19]。
灵菌红素的生产途径主要包括化学合成和微生物发酵2大类方法[17,20]，由于化学合成的难度大且成本高，因此目前灵菌红素的生产仍以微生物发酵为主，筛选自然资源中高产灵菌红素的菌株几乎成为获得灵菌红素的唯一途径[1,3,12]。本研究拟从土壤中分离纯化高产灵菌红素的微生物，并对其所产灵菌红素的性质及最佳产生条件进行初步探究，以期增补高产灵菌红素菌株，并为灵菌红素的进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
50份土壤样品随机采集于本学校食堂、卫生间、污水管道口、动物厂等地。
DNA提取试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；NaOH（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；甘油、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、四硼酸钠、甲醇（体积分数99.5%）、乙酸、乙醚、氯仿、无水乙醇、丙酮、标准蛋白（均为分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司。
LB培养基、休和利夫森二氏培养基、硝酸盐还原试验培养基、吲哚试验培养基、VP试验培养基、明胶试验培养基、脲酶试验培养基及柠檬酸盐试验培养基均按常规方法[21-23]配制。所有培养基调节至相应pH值后，于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50FBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DP71光学显微镜 日本尼康株式会社；HH-1数显恒温水浴锅 国华仪器制造有限公司；ZHWY-100B台式摇床 上海旻泉仪器有限公司；PH-240A干燥培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；SC12核酸电泳仪 北京凯元信瑞仪器有限公司；DelDocXR+凝胶成像系统、S1000聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国伯乐公司；Sorall ST8R高速冷冻离心机 美国热电公司；UL-5000超微量分光光度计 上海美析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的筛选与纯化
分别称取1 g样品土壤，加入99 mL灭菌水制成土壤悬液。将悬液置于摇床27 ℃、120 r/min培养1 h后，静置10 min，取上清液涂布在LB固体培养基上，室温条件下培养2 d，挑取产红色素的3株菌株使用平板划线法分离纯化，通过显微镜镜检观察菌落的色泽、形态等特点，挑取单菌落扩大培养后用甘油保藏于-80 ℃冰箱。
1.3.2 菌株的染色与形态学观察
将分离纯化后的3株菌株分别制备为菌悬液，经100倍稀释后涂布于LB固体培养基，27 ℃培养24 h，挑取培养后的菌落，用生理盐水梯度稀释（10-5～10-2）后革兰氏染液染色，使用光学显微镜100倍物镜与10倍目镜观察细菌个体形态[24]。
1.3.3 16S rDNA测序
按照DNA试剂盒说明书提取纯化菌株DNA，电泳检查DNA完整性，使用通用引物27F（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGTTACCTTGT TACGACTT-3′）[25]扩增16S rDNA片段，PCR反应体系：2 μL模板DNA、1 μL 27F引物、1 μL 1492R引物、12.5 μL Taq DNA聚合酶、8.5 μL ddH2O[26]。反应条件：98 ℃、5 min；95 ℃、35 s，55 ℃、35 s，72 ℃、90 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。反应结束用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确认扩增片段并进行DNA测序，结果提交至NCBI数据库中，进行BLAST在线比对，使用MEGA 7.0软件绘制系统进化树[14]。
1.3.4 红色素的制备与表征
取20 μL实验室保藏菌液，10倍稀释涂布接种于LB固体培养基（n＝3），在室温（25 ℃）条件下培养，定时观察菌体生长及色素生产情况。待菌体和色素覆盖整个培养基时，刮下菌体，转移至500 mL灭菌水中制备菌悬液。先将菌悬液8 000 r/min离心10 min，吸取上清液（即水溶性色素，胞外灵菌色素），将上清液过C18反相柱纯化，采用水以及30%、60%、100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发仪（40 ℃）浓缩后蒸发至干，收集红色素粉末。将离心后的菌体沉淀置于100 mL 99.5%甲醇中，于组织匀浆机研磨菌体后，经200～300目 硅胶柱纯化得到醇溶色素（胞内灵菌红素），进一步用正己烷-乙酸乙酯（1∶40，V/V）洗脱色素，收集洗脱液，用旋转蒸发仪（40 ℃）浓缩后，蒸发至干，得到红色素粉末[27]。
称取2种红色粉末各0.01 g，分别溶于5 mL甲醇溶液（pH 3），采用分光光度计扫描200～800 nm波长范围内的吸收光谱，记录最大吸收峰；基于液相色谱-质谱法，在正离子扫描模式下检测其分子离子峰及碎片离子特征。
1.3.5 粘质沙雷氏菌最适生长及产色素条件优化
1.3.5.1 最适生长及产色素温度
取1 μL粘质沙雷氏菌液接种于4 mL LB液体培养基，分别在20、22、27、32、37 ℃条件下120 r/min摇床培养48 h，每隔12 h取菌液摇匀，用LB培养基调零，测定菌体密度（OD600 nm值）[26]。另取菌液8 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入4 mL 99.5%甲醇，用组织匀浆机研磨菌体使胞内色素溶于甲醇中，8 000 r/min离心15 min，测定上清液OD535 nm值，以评估红色素产量[28]。
1.3.5.2 最适生长及产色素pH值
用pH值缓冲液分别调节LB液体培养基的pH值为3、4、5、6、7、8、9、10，接种1 μL菌液，32 ℃条件下培养24 h，取菌液摇匀后测定菌体密度（OD600 nm值）[26]。采用1.3.5.1节方法测定上清液OD535 nm值[12,29]。
1.3.6 菌体蛋白质与还原糖含量测定
接种4 μL菌液于4 mL LB液体培养基，在32 ℃、pH 8 条件下摇床120 r/min培养12 h，8 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀烘干后加入99.5%甲醇，用组织匀浆机将菌体研磨破裂，得到待测样品。准确量取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 1 mg/L蛋白质标准溶液，加蒸馏水至1.0 mL，采用考马斯亮蓝G250法测定OD595 nm值，绘制蛋白质标准曲线[30]，加待测样品1.0 mL，以考马斯亮蓝G250法测定菌体蛋白含量。
准确量取0、0.1、0.2、0.4、0.6 mL 1 mg/L葡萄糖标准液，加蒸馏水至1.0 mL，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定OD540 nm值[30-31]，绘制还原糖标准曲线。样品溶液操作同上，加待测样品1.0 mL，以3,5-二硝基水杨酸比色法测定菌体还原糖含量。
1.3.7 菌株生化生理特性与代谢特征测定
采用LB、休和利夫森二氏、硝酸盐还原、吲哚、VP、明胶、脲酶及柠檬酸盐试验培养基测定菌株的生化生理特性与代谢特征。
1.3.8 灵菌红素产量测定
20 μL菌液经180 μL LB液体培养基稀释后，采用涂布平板法接种于LB固体培养基，在27 ℃条件下培养24 h，用细胞刮板刮取菌体，称质量（m0/g）[25]，每个平板用15 mL LB液体培养基冲洗至离心管中，8 000 r/min离心10 min，纯化后收集胞外灵菌红素。菌体中加入15 mL 99.5%甲醇，用组织匀浆机研磨菌体，使胞内色素溶于甲醇中，纯化后测定OD535 nm值。根据灵菌红素标准曲线y＝0.032 2x+0.003 7（R2＝0.998 3）计算灵菌红素产量。用蒸馏水冲洗菌体，烘干至质量恒定，称质量（m1/g），菌体干质量与细菌生物量分别按式（1）（2）计算：
式中：V表示菌液体积/mL
1.3.9 灵菌红素在不同溶剂中的溶解性测定
称取0.01 g胞外灵菌红素和0.01 g胞内灵菌红素，分别溶于5 mL甲醇、乙醇、水、乙酸、丙酮（n＝3），空白溶剂调零，测定OD535 nm值。
1.3.10 灵菌红素的热稳定性、光照稳定性测定
称取0.01 g胞外灵菌红素和0.01 g胞内灵菌红素，分别溶于5 mL蒸馏水和甲醇，设置30、40、50、60、70、80、90 ℃温度梯度（n＝3），水浴加热3 h后，用相应溶剂定容至5 mL，测定OD535 nm值[32]。
称取0.01 g胞外灵菌红素溶于20 mL蒸馏水，称取0.01 g胞内灵菌红素溶于20 mL甲醇，设置黑暗避光、自然光和紫外光条件（n＝3），32 ℃照射3 h，用相应溶剂定容至20 mL，取样测定OD535 nm值，继续照射12 h，再次测定OD535 nm值，黑暗避光条件在0、3、12 h分别测定OD535 nm值，取3次测定平均值[33]。
1.4 数据处理
每个实验设置3个平行，实验数据表示为x±s，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，使用Origin 9.0绘制数据图。
2 结果与分析
2.1 产红色素菌株的鉴定
2.1.1 产红色素菌株的筛选、纯化与形态学观察
以产红色素细菌LZ-1为例，由图1可知，经平板划线分离形成单菌落，菌落形态相似，均为红色隆起、湿润、圆形、不透明，菌落直径约为1.0 mm。对菌株进行革兰氏染色，在油镜下观察发现菌株均为短杆状，革兰氏染色为红色，说明3株菌均为革兰氏阴性菌。
图1 初筛菌株菌落形态（A）与细胞形态（B）
Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of primary screening strains
2.1.2 16S rDNA测序鉴定结果
由图2可知，菌株LZ-1与粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）聚为同一分支，Bootstrap支持率为99%，结合形态学特征，鉴定菌株LZ-1为粘质沙雷氏菌。
图2 基于16S rDNA测序的菌株LZ-1系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain LZ-1 based on 16S rDNA sequencing
2.1.3 红色素鉴定
紫外-可见吸收光谱显示，2种红色素在535 nm波长处均具有最大吸收峰。液相色谱-质谱分析显示，2种红色素主要分子离子峰为m/z 324.2 [M+H]+，综合判定该红色素为灵菌红素。
2.2 粘质沙雷氏菌LZ-1产灵菌红素的最适温度与pH值
2.2.1 最适温度
由图3A可知，随着温度升高，菌体密度（OD600 nm值） 呈现先上升后下降的趋势。其中，32 ℃培养48 h时，菌液OD600 nm值较12 h极显著（P＜0.01）上升，且在不同时间段，32 ℃培养菌液的OD600 nm值均高于其他组，说明粘质沙雷氏菌的最适生长温度为32 ℃。由图3B可知，随着温度的升高，OD535 nm值也呈先上升后下降的趋势。其中，27 ℃培养48 h时，OD535 nm值较12 h极显著（P＜0.01）上升，且在不同时间段，27 ℃培养时OD535 nm值均高于其他组，说明粘质沙雷氏菌生产灵菌红素最适温度为27 ℃。值得注意的是，32 ℃处理24 h开始，灵菌红素产量增长放缓，说明高温不利于灵菌红素生产。
图3 温度对粘质沙雷氏菌LZ-1生长（A）及灵菌红素产量（B）的影响
Fig.3 Effects of temperature on the growth (A) of S. marcescens LZ-1 and prodigiosin yield (B)
2.2.2 最适pH值
由图4A可知，pH 8条件下培养粘质沙雷氏菌LZ-1的OD600 nm值最高，表明粘质沙雷氏菌LZ-1生长最适pH值为8，当pH≤4时粘质沙雷氏菌LZ-1生长受到抑制。由图4B可知，pH值为4条件下，OD535 nm值显著高于其他组（P＜0.05、P＜0.01）；pH值为3时，OD535 nm值也处于较高水平。因此，粘质沙雷氏菌LZ-1生产灵菌红素最适pH值为3～4。
图4 pH值对粘质沙雷氏菌LZ-1生长（A）和灵菌红素产量（B）的影响
Fig.4 Effects of pH on the growth (A) of S. marcescens LZ-1 and prodigiosin yield (B)
2.2.3 菌体蛋白质与还原糖含量
粘质沙雷氏菌LZ-1在接种量为0.1%，32 ℃、120 r/min 摇床培养12 h时，消耗LB培养基中还原糖质量浓度为48.44 mg/L，收集菌体并破壁后，还原糖质量浓度为17.54 mg/L，收集量约点消耗总量的36%，表明菌体将部分吸收的还原糖用于合成细胞结构组分，部分流向次级代谢途径。粘质沙雷氏菌LZ-1在接种量为0.1%，32 ℃、120 r/min 摇床培养12 h时，消耗培养基中的蛋白质量浓度为14.66 mg/L，离心后破壁菌体，收集蛋白质量浓度为1.67 mg/L，蛋白质消耗与菌体蛋白增量差异较大，表明氮源可能更多用于合成含氮次级代谢产物（如灵菌红素）。
2.2.4 粘质沙雷氏菌LZ-1的灵菌红素产量
将20 μL菌液稀释10倍后涂布于LB固体培养基（n＝3），在pH 4、27 ℃条件下培养24 h，平均每个直径9 cm平板可收集菌株LZ-1菌体干质量为0.20 g，菌株LZ-1生物量为13.11 g/L，菌株LZ-1的灵菌红素产量为91.50 mg/L。
2.3 粘质沙雷氏菌LZ-1生化生理特性与代谢特征
VP试验可以检测细菌分解葡萄糖生成丙酮酸的能力，糖发酵试验可以检测细菌分解糖类产酸产气的能力，VP试验阳性，糖发酵试验阴性，说明粘质沙雷氏菌LZ-1可以分解糖类为丙酮酸，但不能继续分解丙酮酸为二氧化碳和水，也不能生产乳酸；柠檬酸盐试验为阴性，说明粘质沙雷氏菌LZ-1不能利用柠檬酸盐，即不能以柠檬酸盐为碳源生长，也无法参与三羧酸循环，说明粘质沙雷氏菌LZ-1不能进行有氧呼吸，结合pH＜4时粘质沙雷氏菌生长明显受抑制，而柠檬酸pKa1＝3.13，提示2%柠檬酸是针对粘质沙雷氏菌的有效消毒剂之一；硝酸盐还原试验阳性，说明粘质沙雷氏菌LZ-1可以还原硝酸盐为亚硝酸盐，粘质沙雷氏菌LZ-1可能在还原硝酸盐的过程中完成某些氧化反应；明胶是一种粘结剂，其本质为蛋白质，明胶液化试验阳性，说明粘质沙雷氏菌LZ-1 可以分解蛋白质为氨基酸；脲酶试验阴性，说明粘质沙雷氏菌LZ-1无法分泌脲酶，不能利用尿素分解产生的NH3合成氨基酸，代谢产生的NH3和部分CO2、
以尿素的形式排出；吲哚试验可以检测细菌中的色胺酶，吲哚试验阳性说明粘质沙雷氏菌LZ-1含有色胺酶，可以分解色氨酸生成吲哚，粘质沙雷氏菌LZ-1生产的灵菌红素和吲哚拥有相同的吡咯环结构，可能是合成灵菌红素的原料之一。
2.4 灵菌红素的理化性质
2.4.1 灵菌红素的溶解性
为更高效地开发和利用灵菌红素，对胞外灵菌红素和胞外灵菌红素的溶解性进行探究，由表1可知，无论是胞外灵菌红素还是胞内灵菌红素，将其等质量溶于等体积水、乙酸、丙酮、乙醇、甲醇后，OD535 nm值从大到小依次均为：乙酸＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞水，说明灵菌红素在以上溶剂中的溶解度为乙酸＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞水，胞外灵菌红素在水中的溶解性远高于胞内灵菌红素。
表1 灵菌红素在不同溶剂中的OD535 nm值
Table1 OD535 nm values of prodigiosin in different solvents
胞外灵菌红素0.1992.5371.5200.6380.678胞内灵菌红素0.0802.1461.6130.6420.714项目水乙酸丙酮乙醇甲醇
2.4.2 灵菌红素的热稳定性
由表2可知，胞外灵菌红素30～70 ℃组与25 ℃组相比几乎没有变化，80 ℃组OD535 nm值低于25 ℃组23.25%，90 ℃组OD535 nm低于25 ℃组51.62%，说明温度不高于70 ℃时，灵菌红素较为稳定，几乎不发生分解；温度不低于80 ℃时，灵菌红素开始分解，说明灵菌红素具有较强热稳定性。胞内灵菌红素30～60 ℃组与25 ℃组相比几乎没有变化，70～90 ℃组OD535nm值相比25 ℃组升高，表明甲醇在高温条件下可能与灵菌红素发生反应。
表2 灵菌红素在不同温度条件水浴3 h后的OD535 nm值
Table2 OD535 nm values of prodigiosin after 3 h water bath treatment at different temperatures
胞外灵菌红素4.5854.5434.5434.5434.4204.4203.5192.218胞内灵菌红素2.6532.6142.6172.5732.7313.3173.3122.978样品25 ℃30 ℃40 ℃50 ℃60 ℃70 ℃80 ℃90 ℃
2.4.3 灵菌红素的光照稳定性
由表3可知，对于胞外灵菌红素，经3 h自然光、紫外光照射，OD535 nm值分别高于避光组12.72%和12.93%，经12 h自然光、紫外光照射，OD535 nm分别高于避光组59.77%和51.17%。对于胞内灵菌红素，与避光组相比，紫外照射3 h时OD535 nm值下降8.29%，紫外照射12 h，OD535 nm值下降12.92%；自然光照射3 h，OD535 nm值下降7.47%，自然光照射12 h，OD535 nm值下降9.02%。故保存灵菌红素时要注意避光保存，尤其是避免紫外照射。
表3 灵菌红素的在不同光照条件下的OD535 nm值
Table3 OD535 nm values of prodigiosin under different illumination conditions
0～12 h自然光紫外光自然光紫外光样品避光3 h12 h胞外灵菌红素1.4541.6391.6422.3232.198胞内灵菌红素3.1592.9232.8972.8742.751
3 讨 论
粘质沙雷氏菌LZ-1生长最适温度为32 ℃，生产灵菌红素最适温度为27 ℃，高温会抑制灵菌红素合成通路中氧甲基转移酶的转录，进而降低色素产量[34-35]；粘质沙雷氏菌LZ-1生长最适pH值为8，生产灵菌红素最适pH值为3～4，粘质沙雷氏菌LZ-1在弱碱性环境下繁殖，在酸性条件下生产灵菌红素，可能是生产灵菌红素相关的酶原需要在酸性条件下激活。本研究测得每个直径9 cm平板可收集粘质沙雷氏菌LZ-1菌体干质量为0.20 g，菌株LZ-1生物量13.11 g/L，灵菌红素产量91.50 mg/L，谭新凤[30]从金针菇菌渣堆肥和土壤中得到粘质沙雷氏菌，测得灵菌红素产量84.974 mg/L，菌体干质量8.15 g/L，与本研究结果相似。
糖类是微生物最主要的碳源与能源物质；蛋白质兼具碳源、氮源双重功能，同时是构建菌体细胞结构的关键组分。当环境糖类匮乏时，微生物可氧化分解蛋白质，为自身生命活动供能[33]。粘质沙雷氏菌平均每合成1 g糖类需要消耗2.76 g糖类，每合成1 g蛋白质需要消耗8.78 g蛋白质，蛋白质利用率仅为糖类的31.44%，说明当环境碳源匮乏时，粘质沙雷氏菌LZ-1可分解氧化蛋白质以供给细胞生命活动所需能量。在LB培养基中外源添加糖类能够减少蛋白质的消耗，在蛋白供给有限的条件下支撑更多菌体增殖并合成灵菌红素。
胞外灵菌红素是由不溶于水的灵菌红素与蛋白质、碳水化合物等结合形成的水溶性大分子复合物；胞内灵菌红素则以高密度、不溶于水的纯色素形态存在，主要储存于菌体内部的特化细胞器（大囊泡）。本研究结果显示灵菌红素溶解性乙酸＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞水，李雪[14]从金针菇菌渣堆肥中分离的粘质沙雷氏菌ZPG19所产灵菌红素溶解性为甲醇＞乙醇＞异丙醇，与本研究结果相似。当温度不低于70 ℃时，醇溶色素OD535 nm明显比60 ℃以下的高，甲醇沸点是64.7 ℃，位于60～70 ℃之间，可能是因为高温条件下甲醇挥发导致样品浓度升高，从而影响吸光度测定结果。自然光、紫外光分别照射3、12 h，胞外灵菌红素（水溶）吸光度随时间延长而升高，胞内灵菌红素（醇溶）吸光度下降，不同处理结果可能与灵菌红素在不同溶剂中的稳定性差异及光照条件下的结构变化有关，也说明灵菌红素光稳定性较差，需避光保存，该研究可为灵菌红素的微生物培养生产提供基础研究。
4 结 论
从环境中分离出的粘质沙雷氏菌LZ-1为1株高产灵菌红素的菌株。该菌生长的最适温度32 ℃、最适pH值 为8；产灵菌红素最适温度为27 ℃、最适pH值为3～4，在此条件下灵菌红素产量为91.50 mg/L。灵菌红素溶解度为乙酸＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞水，具有热稳定性强，光稳定性差的特点，本研究为理解粘质沙雷氏菌LZ-1的生存策略，更高效地开发和利用这种宝贵的天然色素提供基础研究。
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