浓香型白酒是中国4大基本香型白酒之一,其产销量点白酒总量的70%以上[1]。中高温大曲作为酿造浓香型白酒的糖化发酵剂,富含微生物和酶系,对出酒率和酒质具有重要的影响[2]。小麦的淀粉含量高、黏着力强、氨基酸丰富,能为微生物的生长提供充足的营养,是生产中高温大曲的优质原料[3]。小麦的品质会影响制曲过程中微生物的富集和代谢,进而影响大曲的理化性质及微生物群落[4-6]。使用不同品质小麦生产的浓香型大曲,其微生物优势群落结构存在差异,影响酿酒及酒体品质[7],酿酒专用小麦制作的大曲微生物物种丰富度、挥发性风味成分均高于普通小麦[8]。此外,小麦粗蛋白和湿面筋含量与枝孢属(Cladosporium)呈显著正相关(P<0.05),且真菌属与大曲理化特性也存在一定相关性[9]。
大曲理化指标是衡量大曲质量的关键参数,酶活力主要来源于微生物代谢,是其功能的核心体现;微生物群落作为白酒发酵的动力,对发酵效率、风味形成和品质稳定性具有决定性作用[10-12]。目前研究主要集中于不同小麦的品质对大曲的挥发性风味成分、微生物物种丰富度的影响[4,9]等方面,而对不同小麦品种制备的中高温大曲理化指标及微生物群落结构差异研究却鲜见报道。
为筛选适宜制曲的小麦品种,本研究选择12种不同品种小麦,按传统中高温大曲制曲工艺制备大曲样品,通过常规检测方法及高通量测序技术分别检测不同中高温大曲样品的基本理化指标和微生物群落多样性,并通过Spearman秩相关性分析对两者间的相关性进行分析,探讨不同品种小麦对中高温大曲的理化指标及微生物群落结构的影响,对筛选适宜中高温大曲制曲小麦品种、提升大曲品质具有重要意义。
12个不同品种(蜀麦114、蜀麦133、蜀麦691、蜀麦830、科成麦4号、科成麦6号、川麦93、川麦104、郑麦583、新麦38、新麦45、新麦169)小麦营养成分与加工品质指标见表1。
表1 不同品种小麦营养成分与加工品质指标
Table1 Nutritional components and processing quality indexes of different wheat varieties
蜀麦13367.912.523.3M2川麦9367.112.524.9M7川麦10466.812.625.9M8品种淀粉质量蛋白质量湿面筋质量大曲分数/%分数/%分数/%编号蜀麦11467.512.725.4M1蜀麦69166.014.028.9M3蜀麦83067.412.625.9M4科成麦4号66.913.227.5M5科成麦6号67.312.926.0M6郑麦58363.415.533.8M9新麦3863.515.231.8M10新麦4562.716.532.9M11新麦16964.314.127.2M12
3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、无水乙酸钠、亚硫酸氢钠、氢氧化钠、葡萄糖(均为分析纯) 天津市致远化学试剂有限公司;碘、乳酸、碘化钾、柠檬酸、三氯乙酸(均为分析纯) 天津 市科密欧化学试剂有限公司;酚酞、乙醇、酒石酸钾钠、磷酸、冰乙酸、无水碳酸钠、福林-酚试剂、可溶性淀粉、木糖、苯酚、磷酸氢二钠、盐酸、己酸(均为分析纯) 成都市科隆化学品有限公司;淀粉酶(3 700 U/g) 北京索莱宝科技有限公司;糖化酶(100 000 U/g)、 酪蛋白、酪氨酸(均为分析纯) 北京奥博星生物技术有限责任公司;木聚糖、羧甲基纤维素钠(均为分析纯) 美国Sigma-Aldrich公司;PowerSoil DNA提取试剂盒 德国QIAGEN公司。
DSX-30L高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;UV-1600分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;HPX-150恒温培养箱、HH-W21-600S数显电热恒温水浴箱 上海跃进医疗器械有限公司;H1650-W离心机 湘仪离心机仪器有限公司;PHS-3C精密pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;GeneAmp 9700聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国ABI公司;HISEQ测序仪、MiSeq PE300测序平台 美国Illumina公司。
1.3.1 中高温大曲制备
由川南某浓香型白酒企业以12种不同品种的小麦为原料,经润麦破碎、加水搅拌、压块成型、培菌发酵、出房储存等工序生产而成。制曲季节为秋季,破碎时,粗粉点75%~80%、其他为细粉;曲坯入房后曲块开始升温至47~52 ℃,合房后温度逐渐升高,顶温达55~60 ℃,当温度下降至50 ℃时进行翻曲,整个培菌发酵时间30 d;出房储存90 d[13]。所制大曲依次编号为M1~M12。采集整块大曲样品进行粉碎,过40目筛,采用四分法混匀,分装于无菌袋中,-80 ℃保存备用。
1.3.2 中高温大曲理化指标测定
液化力、糖化力、发酵力、酯化力及水分、酸度、淀粉含量:按照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[14]进行测定。酸性蛋白酶、中性蛋白酶活力:按照DB34/T 3085—2018《浓香大曲检测操作规程》[15]进行测定。纤维素酶活力:按照NY/T 912—2020《饲料添加剂纤维素酶活力的测定 分光光度法》[16]进行测定。半纤维素酶活力:按照GB/T 23874—2009《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法》[17]进行测定。大曲酶活力单位按上述标准规定,单位为U/g。还原糖含量:按照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》[18]进行测定。
1.3.3 DNA提取、PCR扩增及高通量测序
按照PowerSoil DNA提取试剂盒操作流程进行对大曲样本中的总DNA进行提取。采用细菌16S rRNA基因V3~V4区通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′),真菌ITS rRNA基因ITS1~ITS2区通用引物ITS1F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)进行PCR扩增。PCR扩增体系:1×PCR缓冲液、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L脱氧核苷酸三磷酸盐、1.0 μmol/L正向和反向引物、0.5 U Ex Taq聚合酶以及10 ng模板DNA。PCR扩增条件:94 ℃ 预变性3 min;94 ℃变性40 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸 60 s,共30个循环;最后72 ℃终延伸10 min。大曲微生物检测委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。
对测序原始文件进行过滤,使用FLASH对过滤后的序列进行筛选,按照标签和引物进行拆分,去除有歧义的reads以获得有效序列。利用QIIME 2的DADA2获得扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASV),划分操作分类单元(operational taxonomic units,OTU);然后利用QIIME 2对每个OTU进行比对。选择Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数对微生物群落的丰富度和多样性进行评价。
大曲样品的理化指标结果以x±s表示,用SPSS 20.0进行显著性分析,使用Origin 2018绘图。采用Spearman秩相关性分析对大曲理化指标与主要微生物属的相关性进行分析。以P<0.05且相关系数绝对值|r|>0.6为强关联,采用igraph(v1.5.1)和ggraph(v2.1.0)、R语言(v4.3.2)进行网络可视化。
由表2可知,不同小麦品种中高温大曲液化力为0.38~0.85 U,糖化力为219.71~421.46 U,均符合QB/T 4259—2011《浓香大曲》要求(液化力≥0.20 U、糖化力100~1 000 U)[19]。M5的液化力最高,表明其α-淀粉酶活力强,能快速催化淀粉分子内部的α-1,4型糖苷键断裂,得到糊精和还原糖,提升淀粉分解速率;M7的糖化力最高,表明其糖化型淀粉酶活力强,能提高淀粉转化为葡萄糖的效率,液化力和糖化力表征大曲将淀粉转化为葡萄糖的能力[20]。液化力和糖化力的高低在一定程度上影响白酒生产的出酒率。
表2 不同品种小麦制备中高温大曲的理化指标
Table2 Physicochemical indicators of medium-high temperature Daqu prepared with different wheat varieties
编号液化力/U糖化力/U发酵力/U酯化力/U酸性蛋白酶中性蛋白酶纤维素酶半纤维素酶水分质量酸度/还原糖质量淀粉质量活力/(U/g)活力/(U/g)活力/(U/g)活力/(U/g)分数/%(mmol/10 g)分数/%分数/%M10.44±0.01g219.71±1.43h0.61±0.03ab182.68±7.38e17.66±0.75c21.54±1.24b25.81±0.69a10.62±0.51c11.30±0.21c0.66±0.08ab1.23±0.06f57.43±0.18f M20.47±0.01fg325.83±3.26e0.63±0.01a211.97±9.89bcd14.43±0.60e13.40±0.61g17.86±0.86cd16.38±0.93a11.58±0.15c0.68±0.05a0.81±0.04g56.62±0.21g M30.50±0.03f311.65±6.58fg0.38±0.01d179.22±9.07e11.44±0.43gh13.31±0.34g27.12±1.30a16.26±0.77a12.74±0.16b0.48±0.05cd1.74±0.04c62.46±0.37b M40.38±0.01h340.20±7.78d0.45±0.01c168.78±8.13e13.47±0.48ef21.38±1.12b15.51±1.26e15.30±1.13ab13.95±0.29a0.31±0.03e1.19±0.01f58.28±0.18e M50.85±0.01a348.52±2.19d0.36±0.01d208.67±10.62bcd16.07±0.67d19.05±0.89c11.39±0.56f10.93±0.51c10.26±0.15d0.69±0.03a1.19±0.02f57.48±0.23f M60.68±0.01c341.63±4.01d0.61±0.01ab237.86±10.78a13.37±0.54ef17.72±0.83cd20.81±1.68b6.78±0.71ef11.32±0.15c0.64±0.10ab1.70±0.06cd59.76±0.34d M70.77±0.01b421.46±5.34a0.26±0.01f200.77±9.46d28.25±1.25a29.20±1.38a9.88±0.47f10.76±0.51c13.03±0.20b0.54±0.06bc1.61±0.03e62.36±0.20b M80.59±0.04e314.44±6.70f0.33±0.01e215.75±11.03bcd12.67±0.37fg15.62±0.19f22.41±0.79b7.72±0.49e13.39±0.17ab0.41±0.08de1.63±0.05de62.53±0.40b M90.47±0.03fg408.96±5.44b0.64±0.04a225.60±8.11ab9.93±0.53i11.28±0.17h18.57±0.57c9.31±0.46d11.31±0.27c0.66±0.08ab1.70±0.04cd59.24±0.88d M100.47±0.02fg383.76±8.14c0.59±0.01b207.24±8.45cd11.03±0.78hi16.01±0.30ef17.65±0.59cd9.02±0.71d8.44±0.12e0.69±0.06a1.91±0.08b55.93±0.63h M110.62±0.02d306.56±9.21fg0.62±0.02ab202.28±10.17d20.57±0.61b17.08±0.46de15.63±1.01e5.99±0.45f10.05±0.17d0.68±0.10a1.95±0.05ab61.19±0.23c M120.64±0.03d302.25±2.83g0.43±0.02c224.50±9.45abc21.27±1.19b22.73±0.89b16.21±0.99de14.69±0.64b8.16±0.14e0.71±0.08a2.01±0.04a63.71±0.14a
注:同列小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)。下同。
大曲的发酵力为0.26~0.64 U,酯化力为168.78~ 237.86 U,均符合QB/T 4259—2011要求(发酵力≥ 0.20 U、酯化力≥150 U)[19]。大曲发酵力与酯化力分别关联乙醇生成和酯类合成,是影响发酵效率与酒体风味的关键指标。发酵力和酯化力的不同分别与发酵菌群和产酯酶菌群的组成有关,M9的发酵力最高,有利于乙醇生成,M6的酯化力最高,可使酒体香味浓郁、风味协调。酯化力和发酵力与大曲中微生物多样性及代谢密切相关,影响酒醅发酵过程中酯类物质的合成与乙醇 生成[21]。
酸性蛋白酶、中性蛋白酶活力均以M7最高,分别为28.25、29.20 U/g;M9最低,分别为9.93、11.28 U/g。 大曲中的蛋白酶通过降解蛋白质产生氨基酸及风味前体物质,同时蛋白酶介导的酶解反应产物可与还原糖发生美拉德反应,生成多种风味化合物,对大曲优雅纯正、曲香浓郁的特有香气轮廓形成具有重要作用[22]。
纤维素酶分解纤维素,半纤维素酶降解半纤维素,从而破坏细胞壁,使淀粉充分释放并转化成发酵所需的糖,加速其他酶及微生物对原料的利用,提高风味物质的生成与发酵效率。M3的纤维素酶活力最高,为27.12 U/g,M7最低,为9.88 U/g。M2的半纤维素酶活力最高,为16.38 U/g,M11最低,为5.99 U/g。纤维素酶与半纤维素酶协同作用可以将原料中的纤维素和半纤维素转化为可发酵性糖,再经酵母转化为乙醇,从而提高发酵效率和出酒率[23]。
大曲的水分质量分数为8.16%~13.95%,符合 QB/T 4259—2011要求(<14.0%)[19]。M4的水分质量分数(13.95%)最高,可能与制曲使用的小麦原料及微生物繁殖有关。水分含量影响微生物的代谢与大曲储存,较低水分含量可抑制微生物代谢,延长保存期,但水分含量过低会导致曲块变硬,影响大曲品质;水分含量较高有利于细菌和酵母菌的快速生长,但水分含量过高可能加速霉变,对大曲贮藏不利[24]。
大曲的酸度为0.31~0.71 mmol/10 g,符合QB/T 4259—2011要求(0.3~1.5 mmol/10 g)[19]。M12的酸度(0.71 mmol/10 g)最高,可能与产酸微生物的代谢活动相关。适宜的酸度可保证微生物在良好的条件下生长繁殖,对大曲微生物群落结构具有重要影响[25]。合适的酸度有利于淀粉的糊化和糖化,且有利于酯化作用,酸类物质是白酒中的一种重要呈味物质,也是形成浓香型大曲酒香味成分的前体物质[26]。
大曲M12的还原糖质量分数最高(2.01%),M2最低(0.81%)。淀粉质量分数为55.93%~63.71%,符合QB/T 4259—2011要求(50.0%~65.0%)[19]。还原糖是白酒风味成分的前体物质,其制曲过程中在一定条件下发生美拉德反应形成香气物质。淀粉含量反映微生物对淀粉的利用程度,大曲中的淀粉含量与淀粉水解酶活力有密切关系[27]。淀粉水解酶的活力高,则淀粉利用率较高,大曲的淀粉含量就低。不同小麦原料淀粉含量不同,导致大曲淀粉含量差异。M12的还原糖和淀粉含量均为最高,可能的原因是小麦原料淀粉含量较高或制曲过程微生物分解淀粉的能力较弱。
2.2.1 微生物群落的α-多样性
由表3可知,中高温大曲测序覆盖率均大于99%,说明测序序列覆盖大部分基因组序列,能反映微生物群落组成的真实信息。Chao1指数反映微生物的物种丰富度,Shannon指数反映微生物的物种多样性,Chao1指数和Shannon指数越大表明中高温大曲中微生物群落的丰富度和多样性越高;Simpson指数越大表明微生物群落内不同种类微生物数量的分布越不均匀,越能突出优势微生物[28]。由表3可知,对于细菌群落,不同中高温大曲Chao1指数为108.06~256.49,Shannon指数为0.09~2.85,Simpson指数为0.11~0.98。对于真菌群落,不同中高温大曲Chao1指数为122.16~462.39,Shannon指数为1.11~2.77,Simpson指数为0.12~0.47。对于真菌群落,M1的Chao1指数(448.97)较高,但Shannon指数(1.52)相对较小,Simpson指数(0.46)相对较高。对于细菌和真菌群落,Chao1指数和Shannon指数相对较高,Simpson指数相对较小的中高温大曲为M4、M6和M8。这说明中高温大曲M4、M6和M8的细菌和真菌丰富度、多样性高于其他中高温大曲且分布均匀。中高温大曲的微生物物种丰富度和多样性较高且分布均匀有利于白酒中风味物质的形成,对白酒酿造有利。
表3 不同品种小麦制备中高温大曲细菌、真菌群落的α-多样性
Table3 α-Diversity of bacterial and fungal communities in mediumhigh temperature Daqu prepared with different wheat varieties
微生物样品编号Chao1指数Shannon指数Simpson指数覆盖率/%M1188.24±1.17 e1.50±0.02 e0.43±0.01 e99.94 M2132.35±0.39g0.77±0.00f0.55±0.01c99.89 M3126.82±1.83h0.75±0.01f0.51±0.01d99.97 M4241.18±2.51 b 2.81±0.02 b 0.13±0.00 h 99.85 M5133.12±0.62g0.16±0.01h0.96±0.03a99.96 M6256.49±1.70a2.36±0.03c0.19±0.01g99.91细菌M7108.06±0.46i0.09±0.00i0.98±0.03a99.82 M8203.54±0.98 d2.85±0.03 a0.11±0.01 h99.93 M9206.96±1.45c1.66±0.02d0.25±0.01f99.94 M10108.23±0.84i0.09±0.00i0.98±0.03a99.97 M11124.39±0.95h0.14±0.00h0.96±0.03a99.98 M12182.67±2.51 f 0.41±0.02 g 0.86±0.03 b 99.81 M1448.97±4.16b1.52±0.02g0.46±0.01a99.94 M2122.16±0.75i1.11±0.00j0.43±0.01b99.81 M3122.85±0.93i1.67±0.02f0.25±0.02d99.78 M4462.39±3.20 a 2.59±0.04 b 0.17±0.01 e 99.87 M5144.38±0.31g1.24±0.01i0.46±0.03a99.91 M6433.24±5.41 c2.77±0.03 a0.12±0.01 f99.89真菌M7141.53±0.75g2.07±0.01d0.27±0.02cd99.97 M8416.52±6.24 d2.63±0.03 b0.15±0.01 e99.96 M9337.61±2.04e2.45±0.05c0.18±0.02e99.87 M10122.35±0.82i1.39±0.01h0.47±0.03a99.64 M11131.18±0.67 h 1.70±0.03 f 0.30±0.01 c 99.93 M12279.73±1.59f1.79±0.02e0.27±0.01cd99.84
2.2.2 细菌群落结构
如图1所示,从中高温大曲中共检出17个细菌门,其中厚壁菌门(Firmicutes,相对丰度13.24%~91.05%)、变形菌门(Proteobacteria,2.86%~60.17%)和放线菌门(Actinobacteria,0.48%~22.91%)是大曲中的优势细菌门(相对丰度>1%),其中厚壁菌门为共同优势菌门,但各大曲样品间存在显著差异。本研究结果与文献报 道[9,29-30]的主要优势细菌门(厚壁菌门、变形菌门、放线菌门)结果一致。
图1 基于门水平的大曲细菌群落结构
Fig.1 Bacterial community structure of Daqu at phylum level
如图2所示,从中高温大曲中共检出25个优势细菌属(相对丰度>1%),相对丰度较高的优势属为醋乳杆菌属(Acetilactobacillus;相对丰度2.06%~70.19%)、乳杆菌属(Lactobacillus;1.04%~56.52%)、魏斯氏菌属(Weissella;0.15%~34.81%)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus;0.12%~18.46%)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus;0.34%~13.09%)、克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia;0.14%~12.62%)、醋杆菌属(Acetobacter;0.12%~8.65%)和芽孢杆菌属(Bacillus;0.06%~4.37%)等。不同中高温大曲优势菌属不同,共有优势细菌属为乳杆菌属。中高温大曲M1、M6、M8与M9的优势菌属主要为魏斯氏菌属和乳杆菌属;M2与M3主要为醋乳杆菌属、乳杆菌属和醋杆菌属;M4主要为魏斯氏菌属、乳杆菌属、芽孢杆菌属,M5、M7、M10、M11与M12主要为醋乳杆菌属、乳杆菌属和魏斯氏菌属,其中醋乳杆菌属点绝对优势。不同大曲在醋乳杆菌属、魏斯氏菌属上存在差异。不同小麦原料所携带的微生物群落结构与物种丰富度存在显著差异,进而造成大曲在细菌属水平群落组成及菌群丰度上出现分化,最终导致成品大曲品质各不相同。
图2 基于属水平的大曲细菌群落结构
Fig.2 Bacterial community structure of Daqu at genus level
乳杆菌通过糖酵解途径代谢产生乳酸及多种风味前体物质,从而调控体系pH值、减弱酵母菌好氧代谢速率,延长前发酵期,有利于微生物的生长和香味物质积累,与酯化酶协同作用可促进酯类物质形成[31-32]。魏斯氏菌通过磷酸酮醇酶途径将原料中的糖类转化生成乳酸、乙酸等有机酸,与乙醇在酯化酶催化下反应生成乙酸乙酯和乳酸乙酯,提升基酒风味层次感[33]。克罗彭斯特菌有独特的胞外酶分泌系统,具有产纤维素酶、淀粉酶、几丁质酶能力,可在原料预处理阶段有效分解谷物细胞壁结构,释放淀粉等营养物质以供后续发酵利用[34]。芽孢杆菌可产α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种水解酶,分解淀粉和蛋白质等大分子物质,显著提高原料利用率。此外,芽孢杆菌与酵母菌的共生关系可激活特定代谢通路,促进白酒风味物质的生物合成[35-36]。
2.2.3 真菌群落结构
如图3所示,从中高温大曲中共检出8个真菌门,其中优势真菌门(相对丰度>1%)分别为子囊菌门(Ascomycota;相对丰度48.23%~91.86%)、毛霉菌门(Mucoromycota;2.58%~50.42%)和担子菌门(Basidiomycota;1.36%~1.72%)。子囊菌门为所有大曲的优势菌门,点比较高,但不同品种小麦制备大曲样品间存在显著差异。毛霉菌门是中高温大曲M7的优势菌门,毛霉菌门产蛋白酶、淀粉酶能力较强,这与M7的糖化力、酸性蛋白酶、中性蛋白酶活力最高结果一致 (表2)。优势真菌门与河套地区中高温大曲的真菌 结构[37]类似。子囊菌门中的嗜热子囊菌属和曲霉菌属能够分泌淀粉酶和蛋白酶,降解发酵原料大分子底物,释放可溶性糖类及游离氨基酸,为后续发酵过程提供基础营养物质;毛霉菌门参与原料的初步分解与结构调控,其菌丝体可增强大曲疏松性,促进氧气和水分分布,还可与子囊菌门协同调控酯化力;担子菌门也对乙醇发酵和风味多样性有重要贡献[38]。
图3 基于门水平的大曲真菌群落结构
Fig.3 Fungal community structure of Daqu at phylum level
如图4所示,从中高温大曲中共检出50个真菌属,有23个优势真菌属(相对丰度>1%),相对丰度较高的有毕赤酵母属(Pichia;相对丰度2.04%~61.98%)、拟青霉属(Paecilomyces;0.11%~60.87%)、有孢圆酵母属(Torulaspora;0.12%~46.47%)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces;0.11%~29.30%)、酵母属(Saccharomyces;0.13%~20.91%)、管囊酵母属(Pachysolen;0.12%~12.48%)、曲霉属(Aspergillus;0.86%~11.61%)、根霉属(Rhizopus;0.14%~7.63%)和毛霉属(Mucor;0.10%~15.32%)等。中高温大曲制曲阶段最高曲温可达50 ℃,仅耐热、嗜热真菌能够耐受高温环境并定殖存活[39]。共有的优势真菌属为毕赤酵母属。不同大曲间微生物多样性差异与小麦品种有关,在拟青霉属、有孢圆酵母属上存在差异。样品M1中的优势菌属主要为毕赤酵母属、拟青霉属和曲霉属;M3主要为毕赤酵母属、威克汉姆酵母属和酵母属;M2和M5主要为酵母菌属和毕赤酵母属;M12主要为拟青霉属、毕赤酵母属和曲霉属;M4、M8、M9、M10和M11主要为毕赤酵母属、拟青霉属和有孢圆酵母属,它们的群落结构相似度较高,但丰度存在差异。有孢圆酵母属、酵母属、毕赤酵母属、拟青霉属、曲霉属和根霉属是M6的主要优势菌属,可保障乙醇生成效率、风味物质形成及发酵体系稳定。毛霉属、曲霉属、拟青霉属和毕赤酵母属是M7的主要优势菌属,可通过代谢产香、调控酶活力和维持菌群稳定,增强大曲品质和塑造白酒风味[40-41]。
图4 基于属水平的大曲真菌群落结构
Fig.4 Fungal community structure of Daqu at genus level
如图5所示,大曲主要微生物菌属与理化指标相关性网络共包含48个节点和163条边,其中,正相关边139条、负相关边24条。其中,存在一个以乳酸菌及相关属为核心的高度协同模块,包括Weissella、Levilactobacillus、Lactiplantibacillus、Lentilactobacillus、Pediococcus和Limosilactobacillus等菌属,这些菌属之间存在极强的正相关关系(r>0.8)。例如,Lactiplantibacillus与Lentilactobacillus之间的相关系数高达0.991,Limosilactobacillus与Pediococcus之间的相关系数为0.958,表明这些微生物在生态位或代谢功能上具有高度一致的协同性,可能共同构成驱动发酵过程的核心功能菌群。此外,Staphylococcus与Virgibacillus(r=0.992)之间存在极强的正相关,提示二者可能存在紧密的共生关系。同时,相关性网络中还存在一些关键的负相关关系,反映微生物与理化指标之间的潜在拮抗作用。例如,Leuconostoc(r=-0.71、P=0.01)、Caldibacillus(r=-0.72、P=0.01)和Pichia(r=-0.63、P=0.03)均与液化力呈显著负相关,提示这些微生物可能抑制该功能的表达;Torulaspora(r=-0.78、P=0.003)与酸性蛋白酶活力亦呈强负相关,可能暗示竞争或抑制关系。酸度与水分表现出极强的负相关,真菌属Rhizopus(r=-0.61、P=0.03)和Talaromyces(r=-0.62、P=0.03)的相对丰度与酸度呈负相关,而Talaromyces(r=0.73、P=0.01)的相对丰度则与水分呈正相关,说明高水分、低酸度的环境可能更有利于Talaromyces的生长。
图5 中高温大曲微生物菌属与理化指标的相关性分析
Fig.5 Correlation analysis between microbial genera and physicochemical indexes of medium-high temperature Daqu
本研究系统分析了12个品种小麦所制中高温大曲的理化指标及微生物群落结构差异。研究发现不同曲样间理化指标差异显著,其中M5的液化力最高;M7的糖化力、酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力最高;M9的发酵力最高;M6的酯化力最高;M4的水分含量最高;M12酸度、还原糖和淀粉含量最高。M4、M6和M8的细菌和真菌丰富度、多样性高于其他中高温大曲且分布均匀。共有优势细菌门及细菌属分别为厚壁菌门、乳杆菌属;共有优势真菌门及真菌属分别为子囊菌门、毕赤酵母属。相关性分析表明,Leuconostoc、Caldibacillus和Pichia与液化力呈显著负相关,Torulaspora与酸性蛋白酶活力呈显著负相关,Talaromyces与酸度呈显著负相关、与水分呈显著正相关。研究结果揭示了不同小麦品种对大曲理化指标及微生物群落结构的影响,为选择适宜生产中高温大曲的优质小麦品种提供理论依据。
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