中高温大曲为白酒发酵提供丰富多样的酶系和庞大微生物群落，赋予白酒独特的风味和品质特征[1]。特定的发酵温度可塑造微生物独特的代谢途径和功能特性，使其在发酵过程中发挥着不可替代的作用。乳酸菌、醋酸菌和芽孢杆菌等细菌能够产生乳酸脱氢酶、蛋白酶和β-甘露聚糖酶等多种酶类，分解原料中的大分子物质[2]，代谢产生多种有机酸、醇类和氨基酸等白酒风味前体物质[3]；霉菌和酵母菌等真菌则参与糖化过程，通过分泌淀粉酶和糖化酶等酶类，将原料中的淀粉分解为可发酵性糖，并将其转化为酯类和醛类等风味物质[4]。因此，深入解析中高温大曲微生物群落的结构组成和功能特征，对于优化大曲生产工艺、提升白酒生产稳定性及推动区域特色白酒产业创新具有重要的意义。
宏基因组测序技术能够直接从土壤、水体、人体肠道和酒曲等复杂环境中提取全部微生物的DNA并开展测序，既能完整解析样本微生物群落组成，亦可系统解析菌群整体基因功能[5]。基于宏基因组测序技术，Zhang Zhendong等[6]对安徽省滁州、山东省菏泽、河南省商丘3个地区中高温大曲的微生物群落和功能特性进行研究发现，巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）和米醋杆菌（Acetobacter oryzoeni）可作为滁州中高温大曲的生物标志物，库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和敏捷联合乳杆菌（Ligilactobacillus agilis）可作为商丘中高温大曲的生物标志物，食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）是菏泽中高温大曲的生物标志物；其中L. agilis含有丰富的淀粉降解酶、乙酸和乳酸代谢途径功能基因。尽管宏基因组测序技术可以解析样品中微生物的群落结构及主要功能特征，但无法从酒曲样品中获取活体菌株资源；而纯培养技术能够分离单一微生物，为后续优质菌株的筛选和应用奠定基础。因此，宏基因组测序和纯培养技术相结合，不仅能深入探究酒曲中微生物群落的结构与功能，还可为优良菌株资源挖掘与酿造实际生产应用提供理论基础。江苏地区浓香型白酒以柔和、细腻、回味悠长而著称，现有文献集中于该地区高温大曲真菌组成和大曲发酵升温机理研究[7-8]，而针对中高温大曲微生物群落结构和功能微生物的系统性解析仍较为匮乏。
本研究从江苏省淮安市某酒厂收集中高温大曲样品，采用宏基因组测序技术对其微生物群落结构和功能进行解析，然后采用纯培养技术对其蕴含的可培养细菌进行分离鉴定，深入认识中高温大曲的微生物群落结构和功能特征，以期为中高温大曲的制作工艺优化提供数据支持，并为强化大曲的开发提供菌株支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中高温大曲于2025年10月采集自江苏省淮安市某酒厂，从曲房A与曲房B的曲堆中，分别于上、中、下3层随机挑选10块大曲，并将其完全粉碎后充分混合均匀，-20 ℃保存备用。曲房A和B的曲块为同一批次生产，使用原料与制作工艺完全一致，将得到的2个大曲样品分别命名为ZGW1和ZGW2。
平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、MRS培养基、LB培养基、0.85%无菌生理盐水 青岛海博生物技术有限公司；革兰氏染色液 湖南比克曼控股有限责任公司；DNeasy PowerSoil Pro Kit 德国QIAGEN公司；10×PCR缓冲液、2.5 mmol/L dNTP、Taq酶、pMD18-T 北京天一辉远生物科技有限公司；琼脂糖 西班牙Biowest公司；氨苄青霉素钠盐 福州飞净生物科技有限公司；DH5α大肠杆菌感受态细胞 实验室自制。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台 江苏苏净集团有限公司；CHA-S气浴恒温振荡器 上海昔今生物集团有限公司；Gilson迷你涡旋混匀仪 吉尔森实验仪器（上海）有限公司；5810R离心机（冷冻型） 德国Eppendorf公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；S220超声波破碎仪 美国Covaris公司；AATI高通量NGS核酸片段分析仪 美国Advanced Analytical公司；BMC50生物显微镜 凤凰光学股份有限公司；Veriti FAST梯度聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；PowerPacTM Basic电泳仪电源 美国Bio-Rad公司；CDS8000凝胶成像分析系统 美国UVP公司； Xten高通量测序平台 美国Illumina公司。
1.3 方法
1.3.1 宏基因组测序
称取10.0 g大曲样品于已灭菌50 mL离心管中，加入30 mL 0.85%无菌生理盐水和3颗直径4 mm玻璃珠，充分振荡5 min后，500 r/min离心10 min，取上清液。沉淀中加入10 mL生理盐水后重复上述操作2次，收集上清液。合并上清液后，5 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀。参照DNeasy PowerSoil Pro Kit说明书提取DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度法进行DNA质量和浓度检测，将条带形态清晰单一，A260 nm/A280 nm＝1.8， A260 nm/A230 nm≥2.0的样本于-20 ℃保存备用。
大曲基因组DNA使用超声波破碎仪打断为350 bp的片段后，经末端修复、加A尾、加测序接头和纯化等步骤后，完成文库构建[9]。随后使用AATI检测文库片段的完整性及插入片段大小（长度为300～500 bp），准确定量文库有效浓度（＞3 nmol/L）以保证文库质量，库检合格后进行宏基因组测序，测序模式为PE150，测序深度目标值为每个样品原始测序数据不低于6 G。
使用Fastp v0.23.2软件对获得的原始测序数据进行质量控制和预处理。主要数据清洗步骤：自动检测并切除双端测序接头及末端poly-G序列；过滤掉合格碱基（Q≥20）点比低于70%的低质量序列；剔除含有超过 5个未知碱基（N）的序列；去除序列复杂度低于30%的读段；最后，丢弃修剪后长度短于90 bp的序列，使用软件Bowtie 2 v2.5.5 比对并去除可能来源于植物和人体的潜在污染序列[10]，使用MEGAHIT v1.2.9软件的默认参数进行宏基因组数据的组装。
1.3.2 微生物群落结构和功能分析
使用软件MetaGeneMark v2.10对序列组装结果进行开放阅读框预测，采用CD-HIT v4.8.1软件对预测出的基因序列进行聚类、去冗余，构建非冗余基因集[11]。为计算基因丰度，使用Bowtie 2软件将各样本的高质量质控序列重新比对至非冗余基因集，最终获得用于后续分析的基因丰度矩阵。在物种注释方面，使用DIAMOND v2.1.8软件将非冗余基因集对应的蛋白质序列与NCBI的NR数据库进行比对，以确定各序列的物种分类信息，从而获得各样本在不同分类水平上的丰度信息。在功能注释方面，使用HUMAnN3 v3.0.0软件将序列比对至UniRef 90蛋白数据库，并结合其与MetaCyc数据库的映射关系统计不同功能层级的相对丰度。
1.3.3 酒曲中可培养细菌分离纯化
准确称取10 g酒曲于装有90 mL已灭菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中，37 ℃、180 r/min摇床振荡培养30 min。吸取1 mL混匀液进行10倍梯度倍比稀释[12]，取100 μL 10-5～10-2梯度稀释液分别涂布于PCA和MRS固体培养基，PCA培养基37 ℃倒置培养1 d分离需氧或兼性厌氧菌，MRS培养基37 ℃倒置厌氧培养3 d分离厌氧或兼性厌氧菌。根据菌落大小、颜色、形态等特征的不同挑选菌株，并在培养基上进行3次划线纯化。收集纯化后的菌株进行革兰氏染色和镜检。
1.3.4 可培养细菌的DNA提取、PCR扩增和测序
采用十六烷基三甲基溴化铵法提取纯化菌株DNA[13]，采用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′）和1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）进行PCR扩增[14]。PCR扩增体系：10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板0.5 μL、Taq酶 0.2 μL，无菌水补至25 μL；PCR扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环30次；最后72 ℃延伸2 min；使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将合格的PCR产物纯化后与T-载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，吸取100 μL感受态细胞转化液涂布于含有氨苄青霉素钠的LB固体培养基，37 ℃倒置培养12 h，挑取阳性克隆子进行测序，通过BLAST工具将测序序列在NCBI数据库中进行同源性比对，筛选序列相似度不小于99%的匹配参考序列并下载；利用MEGA 7.0软件完成多重序列比对，采用邻接法构建系统发育树。
1.4 数据处理
基于物种丰度表，使用R 4.3.0的vegan程序包计算Chao1指数和Shannon指数；使用Origin 2024绘制门、属和种水平堆积柱状图和分离株条形图，使用Excel 2019绘制代谢通路蝴蝶图。
2 结果与分析
2.1 基于宏基因组测序技术的中高温大曲微生物群落 结构分析
2.1.1 测序结果
本研究首先对中高温大曲进行宏基因组测序，测得的下机数据分别为10.22 G和9.92 G，经过序列质控后用于分析的数据量分别为10.15 G和9.86 G，表明测序深度充足、数据质量高，后续多样性分析结果可信。微生物α-多样性结果显示，样品ZGW1和ZGW2的Chao1指数分别为4 931和3 368，Shannon指数分别为4.35和3.92，表明ZGW1菌群丰富度与多样性均优于ZGW2。
2.1.2 菌群结构
对微生物群落组成进行注释，在门、属和种水平分别注释到的物种数量为45、1 420个和4 664个。将相对丰度大于1.00%的门、属和种定义为优势微生物。由图1a可知，2个样品中优势菌门分别为子囊菌门（Ascomycota）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和担子菌门（Basidiomycota），相对丰度分别为37.23%、34.34%、18.44%、7.63%和1.21%。由图1b可知，曲霉属（Aspergillus）、毕赤酵母属（Pichia）、泛菌属（Pantoea）、明串珠菌属（Leuconostoc）和魏斯氏菌属（Weissella）相对丰度较高，分别为17.72%、10.67%、10.13%、8.27%和5.47%；酵母属（Saccharomyces）、乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和伴生乳杆菌属（Companilactobacillus）相对丰度为2.00%～5.00%，高温放线菌属（Thermoactinomyces）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、广泛乳杆菌属（Latilactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、果实乳杆菌属（Fructilactobacillus）、醋杆菌属（Acetobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、欧文氏菌属（Erwinia）和乳酪杆菌属（Lacticaseibacillus）相对丰度均低于2.00%。
图1 基于门（a）、属（b）和种（c）水平中高温大曲微生物菌群结构
Fig.1 Microbial community structure of medium-high temperature Daqu at phylum (a), genus (b) and species (c) levels
由图1c可知，优势菌种谢瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和成团泛菌（Pantoea agglomerans）相对丰度较高，分别为11.08%、10.75%、9.21%；柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳植物杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa）相对丰度为2.00%～7.00%，普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）、面包伴生乳杆菌（Companilactobacillus crustorum）、清酒广泛乳杆菌（Latilactobacillus sakei）、旧金山果实乳杆菌（Fructilactobacillus sanfranciscensis）和黄曲霉（Aspergillus flavus）相对丰度均低于2.00%。
A. chevalieri能够产生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多种酶类，可分解原料中的淀粉、蛋白质和脂肪等大分子物质，为后续的发酵提供可利用的小分子物质[15]。作为浓香型白酒发酵核心酵母之一，P. kudriavzevii的耐高温特性使其在发酵后期仍能持续发挥作用，代谢产生乙酸乙酯和四甲基吡嗪等关键风味物质，能够提升白酒的香气复杂度与层次感[16]。在酒醅模拟发酵实验中，接种该强化菌株后酒醅中酯类、醇类、酸类及其他风味物质的种类及含量增加，其中乙酸苯乙酯含量约为未接种组的 2倍[17]。Pantoea属菌株与1-辛烯-3-酮、2-甲基丁醛和苯乙醛等白酒风味化合物的生成相关[18]，且P. agglomerans是初始曲醅中含量最丰富的微生物之一，能够分泌淀粉酶和蛋白酶等降解酶，分解大曲原料中的大分子物质[19]。此外，本研究中A. flavus相对丰度为1.22%，是黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）主要产生菌，AFs已被列为I类致癌物。然而，黄曲霉产毒需特定温湿度条件，中高温大曲发酵高温期通常超过50 ℃，可能抑制其产毒基因表达[20]； 且白酒蒸馏可利用AFs与乙醇显著的沸点差异[21]，使大部分AFs留存于酒糟中，降低酒液残留，但无法完全消除。因此，在大曲生产中仍需加强对A. flavus种群及毒素的动态监测，以防范潜在风险。
2.2 基于宏基因组测序技术的中高温大曲功能分析
本研究进一步对中高温大曲微生物的功能进行解析，从2种中高温大曲中共检测到470条代谢通路，选取相对丰度＞0.010%的代谢通路进行分析。如图2所示，中高温大曲中代谢通路PWY-3781（有氧呼吸I（细胞 色素c））、PWY-7229（腺苷核苷酸从头生物合成的超途径I）和PWY-7663（11-二十碳一烯酸生物合成（厌氧））相对丰度较高，分别为0.018%、0.014%和0.013%。其中，PWY-3781通路在2个中高温大曲中相对丰度均最高，表明该中高温大曲内好氧微生物生长与代谢活动旺盛，这一现象与该中高温大曲中的优势菌属多数偏好在有氧环境中生长的特性高度吻合。PWY-7229通路是嘌呤核苷酸的主要合成途径，而嘌呤核苷酸是生物体内重要的能量分子和信号分子，参与多种生物化学反应和生理过程，可能有助于大曲中微生物的能量代谢和信号传导[22]；PWY-7663通路生成的11-二十碳一烯酸（C20:1）是一种长链脂肪酸，能够抑制乙醇的挥发，促进丁酸乙酯等少数风味化合物的挥发，降低酒体嗅闻刺激性并增加酒体醇厚感 [23]。
图2 中高温大曲微生物优势代谢通路
Fig.2 Dominant metabolic pathways of microorganisms in medium-high temperature Daqu
除上述代谢通路外，其他相对丰度较高的代谢通路分别为NONOXIPENT-PWY（戊糖磷酸途径（非氧化分支）I）、PWY-6126（腺苷核苷酸从头生物合成的超途径Ⅱ）、PENTOSE-P-PWY（戊糖磷酸途径）、PWY-6277（5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成的超途径）和PWY-6122（5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成II），相对丰度分别为0.013%、0.013%、0.012%、0.012%和0.012%。研究表明，NONOXIPENT-PWY和PENTOSE-P-PWY通路是细胞内重要的代谢途径，参与糖的分解代谢，为微生物生长和代谢提供大量的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和糖中间体[24]；PWY-6277和PWY-6122通路中5-氨基咪唑核糖核苷酸是嘌呤核苷酸生物合成的重要中间产物，是生物体内能量代谢和信号传导的基础[25]。这些途径产生的物质可以作为微生物生物合成的原料，促进其代谢活动和生长繁殖，同时微生物在酒曲中的代谢活动可能产生了更多的底物或酶，从而激活了这些代谢途径，产生多种风味物质，赋予酒曲独特的风味。由此可见，中高温大曲内好氧微生物展现出旺盛的生长与代谢活动，在氨基酸与嘌呤核苷酸合成、能量代谢与氧化还原平衡代谢方面具有较强的能力。
微生物群落组成与群落功能息息相关，进一步对优势代谢通路中的高贡献菌种的种类和点比进行统计，选取相对丰度前10的菌种作为分析对象。由图3可知，排除未分类类群的功能贡献后，代谢通路有氧呼吸I（细胞色素c）中高贡献菌种主要为S. cerevisiae，相对丰度为0.001%；代谢通路腺苷核苷酸从头生物合成的超途径I中高贡献菌种主要为L. citreum，相对丰度为0.002%；代谢通路11-二十碳一烯酸生物合成（厌氧）中高贡献菌种主要为P. agglomerans和W. cibaria，相对丰度分别为0.001%和0.001%；代谢通路戊糖磷酸途径（非氧化分支）I和腺苷核苷酸从头生物合成的超途径Ⅱ中高贡献菌种主要为L. citreum，各点0.002%；代谢通路戊糖磷酸途径中高贡献菌种主要为P. agglomerans，相对丰度为0.001%；代谢通路5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成的超途径和5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成II中高贡献菌种主要为 L. citreum和L. plantarum，在各自通路中点比分别为0.002%和0.001%。
图3 优势代谢通路中高贡献菌种的分布
Fig.3 Distribution of high-contribution strains in dominant metabolic pathways
由此可见，排除未分类类群的功能贡献后，L. citreum 和P. agglomerans在优势代谢通路中属于高贡献菌种，尤其是L. citreum在多个代谢通路中均属于高贡献菌种，主要与其代谢特性、生态适应性和功能需求相关。 L. citreum作为异型发酵乳酸菌，通过磷酸戊糖途径代谢糖类生成NADPH和ATP，支持该菌快速生长和抗氧化需求[26]；NADPH的供应和嘌呤代谢支持其合成胞外多糖、细菌素和核苷类物质，增强其生物被膜形成、抗菌活性和风味调节能力，使其适应大曲发酵环境中的复杂生 态位[27]。
2.3 基于纯培养技术的可培养细菌分离鉴定
本研究进一步对大曲中可培养细菌进行分离鉴定，共分离得到了73株细菌菌株，在对其16S rDNA进行测序的基础上，选取代表性菌株进行系统发育树分析。由图4可知，73个分离株隶属于3个属和11个种，分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、阿亚塔农业芽孢杆菌（Bacillus ayatagriensis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、W. cibaria、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）、副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和阿氏芽孢杆菌（Bacillus albus）。
图4 代表性菌株系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of representative strains
由图5可知，菌株B. subtilis和E. faecium分别有41株和17株，点比分别为56.16%和23.29%，是中高温大曲中的优势菌。作为高温大曲中的优势菌种，B. subtilis凭借其耐高温特性，在60～70 ℃的极端发酵环境中稳定存活并主导代谢活动[28]；其分泌的淀粉酶和葡萄糖苷酶等关键酶类，能够高效分解原料中的淀粉为葡萄糖，代谢产生吡嗪类和醇类等芳香类物质，为后续发酵提供基础底物的同时，赋予酒体独特的香气[29]。研究显示，B. subtilis与B. velezensis协同作用时，可提升大曲中醇类、酯类、吡嗪类风味物质的含量，两者代谢产生的多种酶可提高大曲液化能力、糖化能力和酯化能力[30]。作为Enterococcus的一种菌种，E. faecium能够通过代谢产生乳酸等有机酸，从而降低曲块局部pH值，抑制腐败菌繁殖，同时促进蛋白质降解为氨基酸，为风味物质合成提供原料[31]。然而，E. faecium的某些菌株具有携带毒力因子和抗生素耐药基因的风险[32]，因而本研究分离的E. faecium菌株应逐株开展毒力基因筛查和耐药表型的系统筛查后使用，以明确其作为发酵剂的适用性或作为潜在公共卫生隐患的风险等级。
图5 分离株中各菌群的构成
Fig.5 Composition of each bacterial group among isolated strains
由图5可知，B. ayatagriensis和B. coagulans点总分离株的6.85%和4.11%，其他7个种各分离1株，各点1.37%。统计发现，Bacillus属菌株共55株，点比为75.34%，而其他属菌株共18株，点比为24.66%，这一结果与宏基因组测序中Bacillus相对丰度结果存在明显偏差。该现象在Ge Dongying等[33]对青州产区不同颜色高温大曲的研究中亦有报道。其原因可能与大曲特殊生境下微生物的生理特性有关，大曲顶温阶段的高温胁迫与低水分环境可致大量不耐热营养体细胞死亡或休眠，如乳酸菌和根霉、毛霉等多数不具备高耐热性休眠结构的真菌等，而芽孢杆菌凭借耐热芽孢大量存活[34]；接种至PCA培养基后，芽孢杆菌凭借快速复苏与短生长周期在营养竞争中点据绝对优势，从而掩盖了原位环境处于生理胁迫状态及体外生长缓慢的类群。因此，纯培养中芽孢杆菌的极高点比更多是环境与菌株快速生长特性共同导致的“放大效应”，而宏基因组数据则更客观地反映了其在大曲原位固态发酵体系中的真实相对丰度。基于此，后续可通过厌氧罐倒置培养和培养基添加0.05%半胱氨酸与0.1% VC等措施解决乳酸菌分离种类及数量偏低的问题，同时使用PDA或YPD培养基并加入抗生素分离真菌。
值得注意的是，本研究通过传统纯培养仅鉴定出3个属73株细菌，而宏基因组测序在相同样本中共检测到1 420个细菌属，纯培养细菌的属级多样性实际覆盖率较低。这与已报道的传统纯培养仅能捕获环境中0.1%～1.0%微生物[35]的结论一致，也揭示了常规纯培养技术在模拟大曲固态发酵原位微环境时的局限性。其他未培养群体虽未能通过培养基获得，但其在宏基因组中的高丰度表明它们是大曲发酵功能网络中不可或缺的组成部分。例如，L. citreum、L. plantarum、 W. confusa、C. crustorum、L. sakei和F. sanfranciscensis均属于乳酸菌类群，能够产生乳酸和乙酸等，通过调控大曲酸度、降低环境pH值抑制杂菌，并参与氨基酸代谢生成风味前体物质；S. cerevisiae属于经典酿酒酵母，主导乙醇发酵，能够产生乙醇和多种风味酯类；A. oryzae能够高效产α-淀粉酶和糖化酶，是白酒酿造中“以曲代酶”的核心菌种；T. vulgaris可分泌淀粉酶、纤维素酶、耐高温蛋白酶及脂肪酶等多种酶系，促进淀粉、蛋白质和纤维素降解，生成醇类和吡嗪类物质，是大曲复杂香气形成的重要贡献者[36-40]。因此，单凭纯培养结果极易低估这些难培养核心菌群的原位贡献，而将宏基因组测序与传统培养组学相结合，不仅能精准还原大曲微生物群落的真实结构，更是深度解码这超过99%的未培养群体潜在代谢网络及风味调控机制的关键手段。
3 结 论
淮安产区中高温大曲微生物群落优势属主要为Aspergillus、Pichia和Pantoea，优势种主要为A. chevalieri和P. kudriavzevii，优势代谢通路主要为PWY-3781、PWY-7229和PWY-7663，其中高贡献菌种除未分类类群外，主要为L. citreum和P. agglomerans；可培养细菌以B. subtilis和E. faecium为主。本研究宏基因组解析不可培养微生物的真实生态位与功能潜力，纯培养获得了可直接应用的功能菌株，弥补了宏基因组“只见DNA不见活性”的局限。然而，本研究仅采集淮安产区2个中高温大曲样品，且未对其真菌菌种资源进行挖掘，可能无法完全代表该地区大曲微生物群落特征。未来应扩大样本量，开展多季节、多厂区的比较研究，运用选择培养基定向分离宏基因组中的优势菌群，并结合宏转录组和代谢组验证优势代谢通路的实际功能贡献，为大曲品质调控提供更完整的理论依据。
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