白酒是世界6大蒸馏酒之一，凭借独特的风味特征与酿造工艺在蒸馏酒中点据重要地位。白酒以高粱、小麦等谷物为主要原料，通过微生物发酵生成各种风味物质[1]。在浓香型白酒酿造体系中，窖池固态发酵是其主要特点之一，窖池不仅是发酵的容器，也为营造独特的厌氧环境提供基础。通过密封隔绝氧气，并依靠微生物代谢消耗窖池残留氧气形成厌氧环境，窖泥中还富集梭菌、芽孢杆菌、甲烷杆菌和酵母菌等多种对白酒酿造至关重要的功能菌群[2]。微生物菌群通过代谢活动产生酯类、酸类、醇类等白酒主体香气成分，而此类风味物质的种类构成及比例关系在一定程度上影响着白酒的风格和品质[3]。由此可知，窖泥的品质对基酒的质量起着至关重要的作用[4]。窖泥的理化因子是影响和调控微生物群落多样性的关键因素。王艳丽等[5]对比不同品质窖泥理化因子与细菌群落的相关性，研究结果显示，水分、铵态氮、钙和铁含量与原核微生物的丰度显著相关。Han Baolin等[6]采用高通量测序结合气相色谱-质谱技术对不同年份窖泥进行分析，结果表明，厚壁菌门能代谢产生己酸等窖泥核心挥发性风味物质，产甲烷细菌与拟杆菌共生能促进己酸和其他有机酸的产生，从而提高窖泥中酯类物质含量，改善白酒质量。Wei Wenli等[7]利用纳米孔测序技术结合代谢组学对窖泥中挥发性代谢物及微生物多样性进行分析，结果发现，窖泥细菌中的梭菌属和乳酸菌数、真菌中的曲霉属与窖泥中的挥发性风味物质显著相关。在窖泥老熟过程中，窖泥微生物菌系的代谢能力会随着微生物丰度的增加不断增强，促使窖泥产生丰富多样的挥发性成分。Deng Bo等[8]以揭示菌群与窖泥质量的关联为目标，对比分析不同质量窖泥的微生物群落结构，发现微生物群落间存在着复杂的协作与拮抗关系，并据此提出可在酿造发酵阶段通过定向调控微生物群落结构，实现窖泥品质的优化提升。
目前关于窖泥的研究多聚焦于不同窖龄与空间位置，缺少从质量角度对窖泥理化因子、微生物群落与风味物质之间的相关性进行系统解析。因此，本研究采用16S rRNA基因扩增子测序及气相色谱-质谱技术解析浓香型白酒窖泥中的微生物群落与挥发性化合物，明确不同品质窖泥的代表性微生物分类群，并探究窖泥微生物与理化因子、挥发性化合物之间的相关性，以期为深入理解浓香型白酒窖泥提供理论支撑，为优化窖泥培养、评估窖泥质量、提升浓香型白酒品质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
窖泥取自宋河酒业窖池。从生产车间选取3类不同品质的窖池（窖泥颜色呈黑褐色、质地细腻、窖香浓郁的窖池为优质窖池；窖泥颜色呈褐色、质地细腻、稍有香气的窖池为普通窖池；窖池窖泥颜色异常，质地粗糙，具有酸败味、生泥味、腐臭味等异杂味的窖池为劣质窖池），每种品质窖池随机抽取5个作为平行样，采用5点取样法对每个窖池底部窖泥进行采集。优质窖池窖底泥样品标记为YD，普通窖池窖底泥样品标记为PD，劣质窖池窖底泥样品标记为WD，样品用无菌袋密封后，一部分保存在-80 ℃条件下，用于DNA提取，另一部分存放于4 ℃条件下用于其他指标测定。
氢氧化钠、重铬酸钾、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、硫酸钼锑、浓硫酸、盐酸 天津市科密欧化学试剂公司；邻菲罗啉 上海试剂三厂；七水合硫酸亚铁 洛阳市化学试剂厂；其他样品均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HH-1型数显恒温油浴槽 金坛市正基仪器有限公司；PHS-25型pH计、721型可见分光光度计 上海悦丰仪器仪表有限公司；TFY-IIF型多功能土壤分析仪北京市科益农土壤分析仪器厂；101型电热鼓风干燥箱 北京市永光明医疗仪器有限公司；SDZ-D真空抽滤装置、HH-6型电热恒温水浴锅 金坛市金南仪器制造有限公司；SHZ-D(III)型循环水式多用真空泵 天津市华鑫仪器厂；TSQ 9000型三重四极杆气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 理化指标测定
水分含量：电热烘干法；pH值：pH计直接测定法；铵态氮、有效磷、速效钾和有机质：参照李学思等[9]的方法；钙含量：乙二胺四乙酸滴定法；总酸：酸碱中和滴定法[9]。
1.3.2 高通量测序
采用16S rDNA基因V3～V4可变区特异性引物341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和860R（5′- GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR反应体系（30 μL）：Phusion®高保真PCR主混合物15 μL、上下游引物各1 μL、无Dnase水11 μL、模板DNA 2 μL。PCR扩增反应条件：98 ℃预变性60 s；30次循环（98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸300 s。分别使用2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，结合DNA凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行回收和纯化，并送北京诺禾致源科技股份有限公司测序，每个样本5个重复。
1.3.3 挥发性化合物测定
参照高江婧[10]的方法，取2 g窖泥，加入4 mL 60%乙醇饱和食盐溶液，并加入3 μL内标（乙酸正戊酯13.20 g/L、 2-甲基己酸13.76 g/L、叔戊醇10.06 g/L），涡旋振荡5 min，冰浴超声5 min。静置分层后取有机上层，重复萃取3次，合并所有上层萃取液，氮吹浓缩至250 μL。
气相色谱条件：TG-WaxMS色谱柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；载气为高纯度氦气（纯度99.999%），流速1.00 mL/min：进样口温度250 ℃；分流进样，分流比30∶1；溶液延迟2 min：升温程序：初始温度30 ℃保持2 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以15 ℃/min升至220 ℃，保持8 min。
质谱条件：电离能量70 eV；传输线温度230 ℃：离子源温度230 ℃；采用多反应监测模式，扫描时间300 ms，四极杆温度150 ℃；溶液延迟5 min。将样品总离子流图与NIST标准质谱谱库进行比对，选择匹配度大于800的物质完成挥发性化合物定性，采用内标法完成定量分析。
1.4 数据处理
基于Illumina测序平台，对群落DNA片段进行双端测序。使用QIIME 2软件中的DADA2模块对原始序列进行降噪处理，从而获得最终的扩增子序列变异（amplicon sequence variant，ASV）及特征表[11]。对于理化指标与α-多样性指数等数据，本研究采用SPSS Statistics 2022软件中的单因素方差分析进行显著性检验，P＜0.05被认为具有统计学意义。绘图与统计分析借助Excel 2021和Origin 2021软件完成，最终结果以x±s的形式呈现。基于诺禾云平台绘制门水平与属水平优势物种相对丰度图、线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）多级物种层级树图和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）柱形图。借助R语言的hmisc软件包对相对丰度大于1%的优势微生物与挥发性化合物进行关联性分析，得出Spearman相关系数（ρ）及显著性（P）。以|ρ|＞0.6且P＜0.05为标准构建共生网络后，采用Cytoscape软件（v.3.60）实现网络的可视化展示。
2 结果与分析
2.1 浓香型白酒不同品质窖泥理化性质
窖泥理化因子不仅与微生物群落结构紧密关联，更是直接调控白酒发酵过程的关键因素，同时也是直观反映窖泥品质的核心指标[12]。由表1可知，优质窖泥、普通窖泥和劣质窖泥在水分含量、铵态氮、速效钾、钙、pH值及总酸含量上存在显著差异（P＜0.05），而有效磷和有机质含量则不存在显著差异（P＞0.05）。较高的含水量代表较高的微生物代谢活性[12]，优质窖泥水分含量显著（P＜0.05）高于普通窖泥和劣质窖泥，表明优质窖泥中的微生物代谢活性较高。铵态氮是窖泥微生物生长繁殖所需的主要氮源，但若铵态氮含量过高会导致窖泥酸度下降，影响微生物活性[13]，劣质窖泥铵态氮含量显著（P＜0.05）高于优质窖泥和普通窖泥，表明劣质窖泥中的微生物代谢活性低于其他2种窖泥。有效磷是指可被微生物利用的水溶性磷和吸附态磷，速效钾是指可以被微生物利用的水溶性钾元素，有机质是窖泥微生物的主要营养物质，它们在劣质窖泥中的含量较低，可能是导致劣质窖泥质量不高的主要原因[14-16]；窖泥中适量的钙有助于微生物的生长繁殖，有助于提高窖泥质量，不同品质窖泥中钙含量差异显著，其中优质窖泥中钙含量高于其他窖泥；窖泥的pH值会直接或间接影响微生物的生长和繁殖，适当的pH值有利于富集产酸菌，但过高的pH值会影响微生物细胞膜电荷变化，从而抑制窖泥微生物的生长代谢[17]。劣质窖泥pH值显著（P＜0.05）高于普通窖泥和优质窖泥，这说明劣质窖泥中微生物的生长繁殖和代谢可能受到抑制，从而使窖泥质量下降。在固态发酵过程中，微生物产生的有机酸会影响窖泥总酸含量，并使窖泥呈酸性，优质窖泥与普通窖泥中总酸含量高于劣质窖泥。
表1 浓香型白酒不同品质窖泥理化指标比较
Table1 Comparison of physicochemical indices of pit mud with different qualities for strong-flavor Baijiu
理化指标YDPDWD水分质量分数/%54.76±2.61a44.31±2.96b47.65±2.83b铵态氮含量/（mg/kg）276.4±13.94b268.12±13.3b322.76±20.01a有效磷含量/（mg/kg）430.42±7.94ab430.42±7.95ab213.36±20.83b速效钾含量/（mg/kg）161.68±22.07ab126.16±3.88c130.28±6.54b有机质含量/（g/kg）149.5±14.46a184.06±23.23a150.66±22.58a钙质量分数/%1.76±0.19a0.54±0.04b1.47±0.67a pH5.99±0.46b4.74±0.41c7.34±0.48a总酸质量浓度/（g/L）3.39±0.95ab4.01±0.87a2±0.65b
注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.2 浓香型白酒不同品质窖泥微生物群落结构
2.2.1 微生物测序
本研究通过Illumina MiSeq平台对窖泥微生物群落开展测序分析，同时依据各样本在不同测序深度下的Shannon指数构建稀释曲线。由图1可知，随着测序深度提升，曲线逐渐趋于平稳，微生物多样性未再出现上升趋势，这一现象表明表明微生物多样性已得到充分覆盖，后续测序基本不再产生新信息，证明本次数据集足以支撑后续的深入分析。
图1 基于Shannon指数的样品细菌稀释曲线
Fig.1 Bacterial rarefaction curves of all samples based on Shannon index
2.2.2 群落结构α-多样性
由表2可知，测序深度指数均为1，表明样本未被检出的物种点比极低，测序结果能真实反映样品中原核生物群落的物种多样性和丰富度。Pielou均匀度指数表示物种均匀度，物种越均匀，Pielou均匀度指数越大，优质窖泥和普通窖泥的物种均匀度均大于劣质窖泥。观测到的物种数表示直观观测到的物种数目，Chao1指数代表样品中物种丰富度，Shannon指数和Simpson指数代表样品中物种多样性，优质窖泥原核微生物的多样性和丰富度均低于普通窖泥，这可能是优质窖泥中微生物经过驯化后已形成稳定的微生物群落，而普通窖泥中微生物尚处在酿酒微环境的驯化适应阶段，菌群中包含大量与白酒风味代谢无关的非功能微生物；劣质窖泥微生物多样性和丰富度均低于其他窖泥，推测该现象由窖泥过高酸度胁迫微生物生长代谢所致。
表2 窖泥原核微生物α-多样性指数
Table2 α-Diversity indices of prokaryotic microorganisms in pit mud
组别测序指深数度观物测种到数的Pielo指u均数匀度Chao1指数Sh指an数nonSi指mp数son YD1±0a426.00±39.97a0.59±0.01ab440.86±39.54a5.17±0.13ab0.93±0.01ab PD1±0a506.00±140.51a0.62±0.04a531.70±149.15a5.52±0.58a0.95±0.02a WD1±0a362.00±29.53a0.57±0.01b379.19±32.96a4.81±0.13b0.91±0.02b
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
2.2.3 群落组成
基于获得的ASV在门分类水平的物种分类信息分析样品中门分类水平的群落结构。所有窖泥样品中共检测到33个菌门。将相对丰度大于1%的微生物菌门定义为优势菌门，共检测出6个优势菌门。由图2a可知，3种不同品质窖泥样品中的优势菌门主要集中于厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、广古菌门（Euryarchaeota）、原核生物门（Halobacterota）、Cloacimonadota、互养菌门（Synergistota）。厚壁菌门在3种不同品质窖泥样品细菌群落中均点据主导地位，在优质窖泥（43.97%）和普通窖泥（46.75%）中的相对丰度总体高于劣质窖泥（31.18%），与Li Jinyang等[18]的研究结果相符。厚壁菌门是窖泥中产香生酸的关键微生物群，其丰度是窖泥质量评定的重要指标[19]，其相对丰度较高表明优质窖泥整体质量更佳。拟杆菌门在劣质窖泥（26.83%）中的相对丰度高于优质窖泥（21.92%）和普通窖泥（24.76%），其具有代谢糖类物质产生小分子酸的能力，是窖泥微生态中主导碳循环的重要微生物，其相对丰度随着窖池质量的下降呈现上升趋势。广古菌门在优质窖泥（14.06%）中的相对丰度高于普通窖泥（12.03%）和劣质窖泥（12.61%），这与先前研究报道的结果[20]较一致。原核生物门在劣质窖泥（13.25%）中的相对丰度高于优质窖泥（9.73%）和普通窖泥（7.95%）。Cloacimonadota在劣质窖泥（7.17%）中的相对丰度高于优质窖泥（1.64%）和普通窖泥（0.03%）。互养菌门在3类窖泥中的相对丰度也存在差异，其在优质窖泥（6.55%）和普通窖泥（6.46%）中的相对丰度高于劣质窖泥（5.46%）。互养菌门具有降解氨基酸的能力，主要通过与其他微生物的种间互作产生己酸乙酯等对白酒风味形成有益的代谢物。该菌门在优质窖泥中的较高丰度印证了其功能对提升白酒酒质的关键作用[21]。
图2 酱香型白酒不同品质窖泥细菌门水平（a）、属水平（b）群落结构组成分布
Fig.2 Distribution of bacterial community composition at phylum (a) and genus (b) levels in pit mud with different qualities for strong-flavor Baijiu
在属水平上共检测到369个微生物属。其中，104个属存在于所有品质等级的窖泥中，分别点优质窖泥微生物相对丰度的89.38%、普通窖泥微生物相对丰度的87.26%及劣质窖泥微生物相对丰度的92.83%。此外，26个属仅存于优质窖泥，点其微生物丰度的0.02%；143个属仅存于普通窖泥，点其微生物丰度的0.43%；10个属仅存于劣质窖泥，点其微生物丰度的0.01%。将相对丰度大于1%的微生物菌属定义为优势菌属，共检测出20个优势菌属。由图2b可知，3个品质等级窖泥样品中的优势菌属主要集中在产己酸菌属（Caproiciproducens，16.78%～8.97%）、甲烷杆菌属（Methanobacterium，12.78%～7.37%）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum，13.70%～10.87%）、理研菌属（Petrimonas，9.82%～8.92%）、甲烷囊菌属（Methanoculleus，6.52%～2.31%）、LNR_A2-18（7.17%～0.003%）、 甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter，9.45%～1.27%）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina，7.39%～4.08%）、氨基酸属（Aminobacterium，6.40%～5.41%）、RumEn_M2 （2.38%～0.10%）、乳杆菌属（Lactobacillus，2.81%～0.13%）、氢孢菌属（Hydrogenispora，4.28%～2.37%）、Syntrophaceticus（2.41%～0.55%）、共养单胞菌属（Syntrophomonas，3.85%～3.14%）、Caldicoprobacter（1.66%～0.56%）、Sporanaerobacter（1.13%～0.09%）、Anaerosporobacter（1.50%～0.01%）、Fermentimonas（2.16%～0.62%）、严格厌氧中度嗜热菌（Lutispora，1.19%～0.29%）、Sedimentibacter（1.52%～1.01%）等。优质窖泥（16.78%）和普通窖泥（12.29%）中产己酸菌属的相对丰度高于劣质窖泥（8.97%），产己酸菌属以乳酸作为底物，在己酸、丁酸等中长链脂肪酸的生成中起着关键作用；甲烷菌与己酸菌通过协同作用增加有机酸产生；嗜蛋白菌属能产乙酸，其代谢物是构成白酒风味物质或前体物质的重要组成[22]。优质窖泥（12.78%）中甲烷杆菌属的相对丰度远高于普通窖泥（2.58%）和劣质窖泥（7.37%），甲烷杆菌属是浓香型白酒发酵窖池中丰度点比最高的古菌群类，主要在厌氧发酵末端代谢较为活跃，能够有效利用己酸菌产生的氢气，抑制脂肪酸降解。窖泥中甲烷杆菌属主要与氢孢菌属和产己酸菌属呈正相关关系[23]。劣质窖泥（6.52%）中甲烷囊菌属的相对丰度高于优质窖泥（2.30%）和普通窖泥（3.86%），作为氢营养型甲烷菌，甲烷囊菌属能利用氢或甲酸生成甲烷，是四川浓香型白酒窖泥中的关键功能甲烷菌，其可通过与梭菌属共生互作生成乙酸、丙酸等关键风味前体物质[24]。甲烷囊菌属、甲烷杆菌属和甲烷八叠球菌属在劣质窖泥中相对丰度均较高。
2.2.4 差异微生物组成
由图3可知，在属水平从各窖泥样品中共检测出7种差异原核微生物（lg LDA＞3），其中优质窖泥中的差异物种为甲烷杆菌属；普通窖泥中的差异物种为Anaerosporobacter、泰氏菌属（Tissierella）、Clostridium_sensu_stricto_12；劣质窖泥中的差异物种LNR_A2_18、Fermentimonas、严格厌氧中度嗜热菌、Blvii28_wastewater_sludge_group、HN_HF0106、Candidatus_Methanogranum；对各样本差异微生物的分析显示，原核差异微生物在不同窖泥样品中的分布存在差异：部分微生物仅存在于个别样品中，如优质窖泥中的甲烷杆菌属；同时各窖泥样本中包含相对丰度低的差异微生物，如劣质窖泥中的Candidatus_Methanogranum；也包含相对丰度高的差异微生物，如优质窖泥中的甲烷杆菌属，普通窖泥中的Anaerosporobacter等。上述差异微生物对白酒风味形成起着至关重要的作用，如甲烷杆菌属等甲烷杆菌，在发酵阶段能产生大量乙醇、有机酸和多种酯类，这些成分对提高白酒风味具有积极 意义[24]。综上，不同品质窖泥富集了各自特有的差异微生物类群，菌群结构的差异化致使酿造代谢产物组成存在显著区别；代谢产物的差异进一步影响窖泥微生态环境与窖泥品质，最终造成成品白酒风味及品质出现明显 差异。
图3 不同品质窖泥LEfSe多级物种层级树图（a）和LDA柱形图（b）
Fig.3 Linear discriminant analysis (LDA) effect size multi-level species cladogram (a) and LDA bar plot (b) of pit mud with different qualities
2.3 浓香型白酒不同品质窖泥挥发性风味物质组成与比较
酯、酸、醇是构成白酒风味的3类重要呈味物质，窖泥中含有的各类风味物质会通过窖泥与酒醅间的物质交换过程转移至酒醅内部，经蒸馏工艺进入白酒，从而影响浓香型白酒的风味和品质[25]。在全部窖泥样本中共检测到50种挥发性化合物（图4a），包括酯类（29种）、酸类（12种）、醇类（4种）、酚类物质（2种）及其他物质（3种）。在这些化合物中，酯类、酸类与醇类点据主导地位。酯类物质是窖泥挥发性风味化合物中的主要成分，具有较强的水果香、花香和甜香气味，含量高低直接影响浓香型白酒的品质[26]。己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯在优质窖泥（1.545、0.038、0.034 mg/g）和普通窖泥（1.143、0.030、0.035 mg/g）中的含量高于劣质窖泥（0.406、0.000、0.019 mg/g）。酸类物质在调节白酒口感方面发挥着重要作用，其核心功能在于削弱酒体中的苦味与辛辣感，同时提升白酒的甜润口感，让整体风味更显协调。在浓香型白酒中，己酸和乙酸是定味效果显著的酸类物质[27]。己酸、丁酸和乙酸在优质窖泥（5.769、0.461、0.008 mg/g）和普通窖泥（3.604、0.555、0.070 mg/g）中的含量普遍高于劣质窖泥（4.278、0.083、0.002 mg/g）。醇类物质具有沸点低、易挥发的特性，在挥发过程中“拖带”出其他组分物质挥发，这一特性有助于更好地衬托窖泥中酯类物质的香气，增强风味层次感[28]。乙醇在优质窖泥（0.238 mg/g）和普通窖泥（0.275 mg/g）中的含量高于劣质窖泥（0.076 mg/g）；戊醇在优质窖泥（0.009 mg/g）中的含量高于普通窖泥（0.008 mg/g）。酯类、酸类和醇类物质作为窖泥中的主要风味物质成分，它们在劣质窖泥中的含量远低于其他窖泥。
图4 浓香型白酒不同品质窖泥主要挥发性风味物质对比
Fig.4 Comparison of major volatile flavor compounds in pit mud with different qualities for strong-flavor Baijiu
基于OPLS-DA的VIP值对不同品质窖泥样品之间的差异挥发性化合物进行分析。由图4b可知，3组窖泥样品明显分离，基于OPLS-DA秩和检验的
和Q2值分别为0.411和0.944，说明模型具有很好的准确性和预测性。由图4c可知，采用200次置换检验对构建的OPLS-DA模型开展过拟合验证，所有随机置换得到的R2值均低于原始模型R2，随机置换生成的Q2截距小于0，表明模型不存在过拟合现象，分组判别结果可靠，可用于后续筛选区分不同品质窖泥的关键挥发性标志物。由图4d可知，基于VIP＞1.0鉴定出17种差异挥发性化合物，主要包括10种酯类、3种酸类、2种醇类及2种其他化合物。其中，除2,6-二叔丁基对甲苯外，其他大多数挥发性化合物在劣质窖泥中的含量均低于优质窖泥和普通窖泥。上述结果进一步阐明了各类挥发性组分对窖泥品质形成的贡献规律。
2.4 浓香型白酒窖泥理化指标与微生物的相关性分析
理化指标的差异是驱动窖泥微生物生长代谢及功能分化的潜在关键因素。为探明二者间的内在关联，本研究采用典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）系统解析窖泥理化因子、优势菌属与不同品质窖泥的耦合关系。相对丰度前11的窖泥优势微生物菌属与窖泥理化指标的CCA双序图如图5所示，CCA1与CCA2的累计解释度为40.30%，可较好反映理化因子与微生物群落的分异规律。在3种品质窖泥共有的11种优势菌属中，Methanobacterium、Sedimentibacter、Methanosarcina、Syntrophomonas和Caproiciproducens与优质窖泥存在较强的正相关；其他微生物菌属与普通窖泥和劣质窖泥呈正相关。优质窖泥与有效钾、pH值、水分、钙含量和铵态氮密切相关，普通窖泥和劣质窖泥与有效磷、有机质相关。水分、pH值、有效钾和钙离子对微生物群落的影响较为相似，并且影响程度较大，其次是有效磷、有机质。
图5 原核微生物与理化指标的CCA双序图
Fig.5 Canonical correspondence analysis biplot illustrating the relationship between prokaryotic microorganisms and physicochemical indices
2.5 浓香型白酒窖泥微生物和挥发性风味物质相关性分析
风味物质的产生离不开窖泥微生物的参与，为进一步探究窖泥微生物和挥发性风味物质的关联，对15个不同品质窖泥样本中的优势菌属与酯类、酸类、醇类等风味物质进行Spearman相关性分析，结果如图6所示。
图6 原核微生物与风味物质相关性网络图
Fig.6 Correlation network between prokaryotic microorganisms and flavor compounds
共有15个细菌属与38种挥发性风味物质之间表现出显著的相关性。其中Lactobacillus与己酸丁酯、棕榈酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸、正戊酸、乙醇等挥发性风味物质呈强正相关，而这些挥发性化合物在普通窖泥和优质窖泥中含量较高，说明Lactobacillus对窖泥挥发性化合物的形成有贡献作用。研究指出，乳酸菌是新窖泥中的主要细菌之一，与白酒中多种风味化合物的形成有关[29]， 与本研究结果一致；Caproiciproducens是老窖泥中的主要功能菌，在白酒风味特征方面起重要作用，本研究中Caproiciproducens在优质窖泥中相对丰度较高，其与正戊酸、异戊酸、正己酸和己酸戊酯呈正相关，说明Caproiciproducens对窖泥质量有着至关重要的作用[30]； Methanobrevibacter与9-十六碳酸乙酯和亚油酸乙酯呈正相关，与辛酸、对甲酚和庚酸乙酯呈负相关；Methanobacterium为优质窖泥中的差异菌属，与正壬酸和正癸酸呈正相关；Methanoculleus与正己酸、丁酸乙酯、戊酸乙和对甲酚呈负相关；古细菌多为严格厌氧菌，多分布在优质老窖泥中，该类群无法直接合成挥发性风味物质，但可与乙酸氧化菌、水解菌群形成互营代谢体系，消耗乙酸、乳酸、丁酸等挥发性脂肪酸并缓解体系氢胁迫，在白酒酿造厌氧发酵系统中对维持发酵性能和复杂微生物群落稳定性起到关键调控作用[31]。LNR_A2-18为劣质窖泥中的差异微生物菌属，与苯乙酸乙酯、丁酸、十四酸乙酯、乳酸乙酯和乙醇呈负相关，与1,3-二叔丁基苯呈正相关；Proteiniphilum是窖泥中除Caproiciproducens和Methanobacterium外相对丰度较高的菌属，能够产生乙酸和丙酸[32]，在本研究中，其与对甲酚呈负相关。Petrimonas与己酸辛酯、辛酸辛酯和己酸正庚酯等5种挥发性化合物呈负相关，与Li Jinyang等[18]的研究相一致。
3 结 论
本研究对不同品质窖泥理化因子、微生物群落结构与挥发性风味物质及其间相关性进行分析，发现优质窖泥水分含量显著高于普通窖泥和劣质窖泥，而劣质窖泥铵态氮、pH值则显著高于优质窖泥和普通窖泥。微生物群落分析表明，3种不同品质窖泥样品中的优势菌门主要为厚壁菌门、拟杆菌门、广古菌门、原核生物门、Cloacimonadota、互养菌门等；优势菌属主要为产己酸菌属、甲烷杆菌属、嗜蛋白菌属、理研菌属、甲烷囊菌属等。优质窖泥中产己酸菌属、甲烷杆菌属、理研菌属等微生物相对丰度较高，劣质窖泥中嗜蛋白菌属、甲烷囊菌属和甲烷短杆菌属等微生物相对丰度较高。在全部窖泥样本中共检测到50种挥发性化合物，主要的酯类、酸类和醇类物质在优质窖泥中的含量均高于其他窖泥。相关性分析表明，Lactobacillus与己酸丁酯、棕榈酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸、正戊酸、乙醇等挥发性风味物质呈显著正相关，Caproiciproducens与正戊酸、异戊酸、正己酸和己酸戊酯呈显著正相关，两者在优质窖泥中的含量均高于劣质窖泥。综上，本研究深化了对不同品质窖泥理化因子、微生物及挥发性风味物质的认识，进一步揭示了窖泥微生物对风味物质的影响，为窖泥产香微生物的挖掘提供理论依据，有助于提升白酒品质的优化效率。
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