Optimization of Decolorization, Separation and Purification Process of Iturin A in Fermentation Broth
伊枯草菌素A（Iturin A）属于环脂肽类抗生素，其独特的两亲性结构赋予其优异的抗菌活性[1-2]。Iturin A对黑曲霉[3]、白色念珠菌[4]、青霉[5]、禾谷镰刀菌[6]等多数真菌具有抑制作用，常应用于植物病害防控领域，用于防治各类植物病原真菌[7-9]。
经有机试剂提取后得到的Iturin A粗提物含有植物蛋白、色素及多糖等杂质，需进一步纯化才能得Iturin A。目前Iturin A分离纯化方法主要包括溶剂萃取法[10]、大孔吸附树脂法[11-12]、硅胶柱层析法等[13-14]。如Zhang Dongliang等[15]利用CaCl2与Na2HPO4作为凝集剂，结合乙醇凝集获得高纯度表面活性肽，但所使用的发酵培养基营养单一、产量低，该方法不适合从复杂发酵培养基中分离纯化Iturin A；Dhanarajan等[12]研究表明，通过大孔树脂纯化策略纯化后，Iturin A纯度仅为68.3%；何强[16]运用离子树脂和大孔树脂层析方法分离纯化天然脂肽，但Iturin A、Surfactin等脂肽类物质难以被离子交换树脂吸附，难以采用该方法实现有效分离；Yuan Yuan等[17]利用大孔树脂纯化发酵产物，经核磁共振鉴定为伊枯草菌素同系物。
本研究以乙醇浸提液为基础，通过构建“活性炭脱色-正丁醇萃取-大孔树脂-硅胶柱精制”梯度纯化新工艺，以期为Iturin A规模化制备提供解决方案，为脂肽类化合物分离纯化提供实践指导。
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ND 中国典型培养物保藏中心（CCTCCM 2020983）。
胰蛋白胨、酵母粉、活性炭、豆粕粉（均为分析纯） 北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、L-谷氨酸钠、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾、七水合硫酸亚铁、乙酸铵、一水合硫酸锰、五水合硫酸铜（均为分析纯） 天津盛奥科技有限公司；Iturin A标准品（色谱纯≥95%） 美国Sigma公司；HZ816型大孔树脂、HP-20型大孔树脂、X-5型大孔树脂（均为分析纯） 郑州和成新材料科技有限公司；甘油、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、甲醇（均为分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司；甲醇、乙腈（均色谱纯） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；硅胶（生化试剂，200～300目）青岛海洋化工厂；实验用水为蒸馏水。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g（配制固体培养基时加琼脂18 g）、蒸馏水1 L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
发酵培养基：豆粕粉120 g、酵母浸粉16 g、L-谷氨酸钠1 g、甘油70 mL、七水合硫酸镁0.5 g、磷酸二氢钾1.0 g、七水合硫酸亚铁0.15 mg、一水合硫酸锰5 mg、五水合硫酸铜0.16 mg，pH 8，蒸馏水1 L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
PHS-25 pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配备可变波长检测器） 美国安捷伦公司；UV-1000紫外-可见分光光度计 翱艺仪器（上海）有限公司；MULTIFUGE X3R高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；EYEL4旋转蒸发蒸仪 东京理化器械株式会社。
1.3.1 Iturin A粗提物制备
将B. velezensis ND接种于LB固体培养基，37 ℃培养12 h后挑取单菌落转接至LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养19～20 h；随后以10%（V/V）接种量接入装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、180 r/min发酵5 d，获得Iturin A发酵液，将发酵液调至pH 3后，4 ℃静置1 h，10 000 r/min离心15 min收集沉淀，采用初始发酵液与无水乙醇（1∶7，V/V）重悬，76.5 ℃浸提72 min，再次经10 000 r/min离心15 min后收集上清液，最后在50 ℃、-0.1 MPa条件下旋蒸浓缩旋干，制得Iturin A粗提物，备用。
1.3.2 Iturin A含量测定
样品中Iturin A含量测定参照Tang Zhongmin[18]、石举然[19]等的方法进行。采用HPLC法测定Iturin A含量。色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm）。流动相为10 mmol/L乙酸铵-乙腈（65∶35，V/V），流速1.0 mL/min，检测波长210 nm。样品用甲醇溶解，涡旋振荡10 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，按上述方法测样品峰面积。根据标准曲线方程计算样品中Iturin A含量。
1.3.3 脱色率、回收率、纯度、吸附率及解吸率测定
使用紫外-可见分光光度计测量Iturin A脱色前后297 nm波长处吸光度，根据式（1）计算脱色率，测定每次处理前后的Iturin A质量，按照式（2）计算回收率：
式中：A0为脱色前吸光度；A1为脱色后吸光度；m0为 处理前Iturin A质量/g；m1为处理后Iturin A质量/g。
按式（3）计算纯度：
式中：m2为处理后样品质量/g。
分别按式（4）（5）计算吸附率与解吸率：
式中：m3为原始样液中Iturin A质量/g；m4为吸附后溶液中的Iturin A质量/g；m5为解吸后溶液中的Iturin A 质量/g。
1.3.4 熵权法计算加权综合评分
采用熵权法对脱色率与回收率、纯度与回收率进行客观赋权与综合评价。熵权法是一种基于信息熵理论的客观赋权方法，首先，对脱色率与回收率或纯度与回收率的原始数据进行标准化处理；其次，计算各指标的信息熵与差异系数；最后，根据差异系数确定各指标的客观权重，并据此计算各工艺的加权综合评分。该方法完全由数据驱动，可避免主观设定权重可能带来的偏差，从而保证评价结果的客观性与科学性[20]。
1.3.5 活性炭脱色工艺优化
为系统优化活性炭对Iturin A粗提液的脱色工艺，本研究采用经典单因素试验法，取Iturin A粗提物，加适当蒸馏水充分溶解得到Iturin A提取液，分别考察活性炭用量、脱色温度、脱色时间、脱色pH值4个因素对Iturin A提取液脱色率、Iturin A回收率的影响，在确定某一因素的最优水平后，将其固定为后续因素考察的基准条件。固定脱色时间30 min、脱色温度50 ℃、pH 8、考察活性炭用量（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，以提取液质量计）对Iturin A提取液脱色率和Iturin A回收率的影响；固定活性炭用量1%、脱色温度50 ℃、pH 8，考察脱色时间（10、20、30、40、50、60、70 min）对Iturin A提取液脱色率和Iturin A回收率的影响；固定活性炭用量1%、脱色时间40 min、pH 8，考察脱色温度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）对Iturin A提取液脱色率和Iturin A回收率的影响；固定活性炭用量1%、脱色时间40 min、脱色温度40 ℃，考察脱色pH值（2、3、4、5、6、7、8）对Iturin A提取液脱色率和Iturin A回收率的影响[21-22]。
1.3.6 溶剂萃取工艺优化
利用Iturin A在有机试剂和水中的分配特性不同，将脱色后提取液分别与有机试剂（二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇）按4∶1（V/V）混合，振荡萃取静置30 min，利用分液漏斗进行分离，计算样品的回收率、纯度，获得萃取效果最优的有机试剂。最终选择工艺为脱色后处理液∶最优萃取剂＝4∶1（V/V），连续萃取3次，合并有机相，计算总纯度、总回收率[23]。
1.3.7 大孔树脂纯化工艺优化
将3种树脂（HZ816、HP-20、X-5）浸入95%乙醇中过夜，并用超纯水冲洗至不含乙醇，分别用100 mL 5%（V/V）HCl和5%（V/V）NaOH溶液冲洗，使用超纯水洗脱，使pH值中性。大孔吸附树脂物理性质见表1。
表1 大孔树脂型号及其参数
Table1 Types and parameters of macroporous resins
型号平均孔径/Å粒径/mm类别比表面积/（m2/g）HZ816100～1200.315～1.25非极性≥680 HP2075～800.315～1.25非极性≥500 X-5290～3000.315～1.25非极性500～600
称取2.0 g预处理后的HZ816、HP20和X-5大孔树脂于250 mL锥形瓶中，与在最佳脱色条件下获得的25 mL提取液混合，120 r/min、25 ℃持续摇动锥形瓶24 h。达到平衡后，将提取物与树脂分离，然后在相同振荡条件下用25 mL 100%甲醇解吸树脂24 h。比较不同大孔树脂之间的吸附率、解吸率。基于此，考察萃取后提取液pH值（4、5、6、7、8、9）、解吸液甲醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%、100%）、解吸液pH值（4、5、6、7、8、9）对目标物解吸率的影响，实验中使用的树脂质量为2 g，吸附和解吸温度固定为25 ℃，振荡速率120 r/min。
1.3.8 HZ816大孔树脂与硅胶柱层析分离Iturin A
采用HZ816大孔树脂（3 cm×30 cm），柱体积50 mL，上样前调节样液pH值至8，上样体积2 BV，流速1 mL/min，依次用2.4 BV水、2.4 BV 50%甲醇、2 BV 90%甲醇梯度洗脱，收集洗脱液20 mL/管，减压蒸馏浓缩旋干，测每管中Iturin A含量，计算样品回收率和纯度，合并高纯度组分。
采用硅胶柱（200～300目、3 cm×30 cm），柱体积50 mL（乙酸乙酯平衡），上样后采用乙酸乙酯-甲醇（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1，V/V）流动相分别进行洗脱，每个比例洗脱6 BV，并以每50 mL为一个馏分进行收集[1,24]。所有馏分均经HPLC在210 nm波长下进行分析，确定可洗脱出Iturin A为洗脱目标成分的最佳比例为1∶1。采用硅胶柱（200～300目、3 cm×30 cm），柱体积50 mL（乙酸乙酯平衡），上样后依次用2.8 BV乙酸乙酯∶甲醇＝3∶2（V/V）、4.8 BV乙酸乙酯∶甲醇＝1∶1（V/V）、2 BV乙酸乙酯∶甲醇＝2∶3（V/V）、2 BV甲醇洗脱剂分段洗脱，收集洗脱液 20 mL/管，减压浓缩以蒸干洗脱剂，然后用甲醇溶解，定容至合适的体积，测定每管中Iturin A含量，计算样品回收率和纯度，合并高纯度组分。
所有实验均重复进行3次操作，利用Origin 2025软件对各组数据进行描述性统计分析、绘图，利用Excel软件对分离纯化数据进行处理，计算综合评分。
2.1.1 活性炭脱色条件单因素试验结果
如图1a所示，活性炭用量对脱色率与Iturin A回收率呈现竞争性吸附效应。脱色率随用量增加呈先升后降趋势，在1.0%时达到峰值，超过该用量因吸附位点饱和导致吸附效率下降；而Iturin A回收率在活性炭用量大于1%时，由于其对目标产物的不可逆结合增强而显著降低。基于熵权法计算加权综合评分，脱色率与回收率的客观权重分别为50.21%和49.79%。基于此权重计算活性炭用量0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的加权综合评分分别为0.231 5、0.244 2、0.269 6、0.254 7、0.240 9、0.232 2、0.226 9。活性炭用量为1.0%时，综合评分最高，可实现脱色率（52.37%）与回收率（72%）的协同优化。
图1 Iturin A提取液脱色工艺条件单因素试验结果
Fig.1 Single-factor test results ofdecolorization conditions foriturinAextract
如图1b所示，脱色过程呈现典型吸附-解吸动态平衡。脱色率在10～40 min缓慢上升，40 min达峰值后因色素解吸加速而下降；而Iturin A回收率由于活性炭对环脂肽的非特异性吸附增强及吸附稳定性提升，因此随脱色时间延长而持续降低（10～70 min下降16.44%）。基于熵权法计算加权综合评分，脱色率与回收率的客观权重分别为50.09%和49.91%。基于此权重计算脱色时间10、20、30、40、50、60、70 min的加权综合评分分别为0.243 2、0.247 7、0.252 8、0.256 2、0.230 5、0.221 3、0.216 0。脱色40 min时综合评分最高，此时脱色率为54.57%、回收率为82.22%。
如图1c所示，在20～40 ℃区间，由于热运动加速色素分子扩散与碰撞效率，脱色率随温度升高显著提升（增幅20%）；40 ℃时脱色率（63.98%）与Iturin A回收率（90.22%）同时达到最高。温度高于60 ℃后，脱色率因活性炭孔隙坍塌而下降，同时Iturin A回收率降低，表明肽键发生热降解。基于熵权法计算加权综合评分，脱色率与回收率的客观权重分别为50.47%和49.53%。基于此权重计算脱色温度20、30、40、50、60、70、80 ℃的加权综合评分分别为0.220 4、0.253 2、0.264 6、0.261 7、0.254 1、0.244 8、0.236 8。发现40 ℃时综合评分最高，此时脱色率为63.98%、回收率为90.22%。
如图1d所示，在pH＜4时，活性炭表面高正电荷密度通过强静电作用实现高效色素脱除，但导致带正电的Iturin A回收率受限；随着pH值升至4～6，色素吸附机制转向疏水相互作用主导，使脱色率趋于稳定（63%左右），同时Iturin A电性转为弱负电，与带正电活性炭的静电排斥增强，推动回收率提升；在pH＞7时，色素胶体稳定性破坏引发的疏水效应促使脱色率回升至64%以上，而Iturin A与活性炭表面强负电荷间的静电排斥作用使产物回收率突破89%。基于熵权法计算加权综合评分，脱色率与回收率的客观权重分别为49.40%和50.60%。基于此权重计算脱色pH 2、3、4、5、6、7、8的加权综合评分分别为0.233 5、0.233 0、0.264 9、0.268 7、0.271 1、0.291 7、0.292 7，脱色pH 8时综合评分最高，因此最终确定脱色pH 8为最优。
综上，以活性炭用量1%、脱色时间40 min、脱色温度40 ℃、脱色pH 8进行Iturin A提取液脱色处理，可得脱色率为65.37%，回收率为89.48%。
2.1.2 溶剂萃取工艺的优化
如表2所示，以正丁醇∶水（4∶1，V/V）为萃取体系可高效富集水相多肽。单次萃取纯度达24.50%、回收率59.27%，优于二氯甲烷、乙酸乙酯及正己烷（纯度＜ 4%、回收率＜1%）。经3次连续萃取[25]，Iturin A总收率达92.98%（与脱色工艺累计回收率为83.19%)，合并纯度为19.23%（较初始提升约4.9倍）。尽管后续萃取纯度递减（2次16.8%、3次9.8%），但萃取3次后总回收率可达90%以上。综上，正丁醇体系在Iturin A分离中具有较高选择性与较高回收率优势。
表2 萃取试剂及萃取次数对Iturin A纯度与回收率的影响
Table2 Effects of extraction solvent and extraction times on purity and recovery rate ofiturin A
萃取试剂萃取次数纯度/%回收率/%二氯甲烷13.000.85乙酸乙酯10.800.96正己烷10.760.42正丁醇124.5059.27正丁醇216.8024.10正丁醇39.809.60
2.2.1 大孔树脂筛选
如图2a所示，HZ816大孔树脂的静态吸附率（81.56%）与解吸率（80.40%）明显高于HP20、X-5，因此选择HZ816进行后续实验。
图2 大孔树脂纯化工艺优化结果
Fig.2 Optimization results ofthe macroporous resin purification process
2.2.2 大孔树脂纯化工艺条件单因素试验结果
如图2b所示，当pH值从4升至6时，吸附率由83.56%降至71.33%，因Iturin A羧基解离增强导致负电荷密度上升，分子内极性作用促使疏水链折叠、疏水性降低，削弱了与树脂的疏水相互作用；当pH值从6升至9时，吸附率由71.33%回升至82.44%，由于负电荷密度进一步升高引发强烈电荷排斥，使分子构象伸展、疏水链暴露，显著增强疏水性并强化吸附作用。鉴于pH 4（83.56%）与pH 8（82.22%）吸附率接近且均处高位，考虑到大量处理液回调至中性会产生盐分，不利于后续纯化操作，且前期体系pH值接近8，故直接采用浓缩液进行上样处理，以此简化整体工艺。
如图2c所示，甲醇体积分数通过双重作用调控解吸率：甲醇体积分数由70%升至90%时，解吸率从39.84%激增至89.43%，源于洗脱液极性降低竞争性削弱疏水吸附作用，同时Iturin A在甲醇中溶解度上升，二者协同促进目标物质解吸；甲醇体积分数升至100%时，解吸率降至80.76%，因纯甲醇环境导致亲水肽环溶解度下降，且分子间作用增强阻碍有效扩散。因此，确定90%甲醇为最优体积分数，其峰值解吸率达89.43%。
如图2d所示，pH 4～6时解吸率持续上升，因pH＞pI时，Iturin A所带负电荷密度增加、分子极性增强，不仅削弱疏水作用，还可提升其在甲醇中的溶解度；pH 6～8时解吸率维持90%左右，此时疏水作用持续减弱与溶解度饱和达成动力学平衡；pH＞8后，强碱性环境易形成氢键缔合结构，降低物质溶解性与扩散效率，最终导致解吸率回落。90%甲醇自身pH值（6.5～7.5）恰好处于高解吸率稳定区间（pH 6～8），故无需调节pH值即可直接用作洗脱剂。
2.2.3 大孔树脂柱层析纯化及产物纯度
如图3所示，大孔树脂柱层析洗脱液中Iturin A质量出现2个洗脱峰，第1个峰（0.4～1.6 BV）是由于上样Iturin A 总量略高于该特定条件下大孔树脂的动态吸附载量。因此，一部分Iturin A未能被树脂有效吸附，而是随着蒸馏水直接流出大孔树脂柱。这部分产物在洗脱曲线上形成了1个较早的峰。第2个主峰（6～7.6 BV），当洗脱剂为90%甲醇时，成功吸附在树脂上的Iturin A被解吸附，形成1个洗脱峰，在洗脱液6.4 BV时，Iturin A质量迅速下降。对6～7.6 BV洗脱液进行合并，其纯度由19.23%提升至35.36%，回收率为66.21%。
图3 大孔树脂柱层析动态洗脱曲线
Fig.3 Dynamic elution curve of macroporous resin column chromatography
2.2.4 硅胶柱柱层析纯化及产物纯度
如图4所示，硅胶柱层析纯化后的Iturin A周围杂质峰数目及高度明显减少，硅胶柱层析洗脱液中Iturin A质量在2.8～3.6 BV时迅速上升，在3.6～6.0 BV时较为平稳，在6.0 BV后Iturin A质量迅速下降。合并3.2～6.8 BV高纯度组分，得到纯度84.66%、回收率46.91%的Iturin A。
图4 硅胶柱层析纯化工艺优化结果
Fig.4 Optimization results of silica gel column chromatography purification process
2.2.5 基于熵权法的纯化工艺综合评价
为更客观地确定纯度与回收率在综合评分中的相对重要性，进一步采用熵权法进行客观赋权并计算综合评分，结果表明纯度与回收率的客观权重分别为89.49%和10.51%。依托该权重计算得出，正丁醇1次萃取、正丁醇3次萃取和正丁醇3次萃取结合大孔树脂纯化及正丁醇3次萃取结合大孔树脂、硅胶纯化的综合评分分别为0.158 3、0.139 3、0.220 5及0.481 9。从综合得分来看，正丁醇3次萃取结合大孔树脂、硅胶纯化工艺显著优于其他3种方案，也进一步验证了正丁醇萃取-大孔树脂层析-硅胶柱精制3级纯化体系具备良好可行性与实际应用价值。
Iturin A因其独特的分子结构，在抑菌活性和分离难度上形成鲜明对比，其工业化生产长期面临回收率低和成本高的双重挑战。现阶段活性炭脱色已广泛应用于发酵液预处理领域，但针对伊枯草菌素A发酵液的脱色工艺研究仍较为匮乏，本研究首先通过调节活性炭脱色 pH值至8，使Iturin A分子表面羧基充分电离而携带负电荷，与活性炭表面含氧基团产生同电荷排斥效应，成功将脱色率与产物回收率协同优化至65.37%与89.48%。在此基础上，建立正丁醇萃取-大孔树脂层析-硅胶柱精制三级纯化体系：首先采用正丁醇进行3次萃取，使产物纯度从3.91%提升至19.23%，回收率83.19%；利用HZ816大孔树脂的超高比表面积特性与优化孔径结构，通过90%甲醇洗脱，产物纯度增至35.36%，回收率达66.21%；最后通过硅胶柱多梯度洗脱获得纯度为84.66%的产物，回收率46.91%。产物纯度约为初始浸提液的21.4倍（表3）。 与现有方法相比，本工艺可在营养成分复杂的培养基（豆粕质量较高）中获得较高纯度的Iturin A，并具有操作简便、设备要求低等优势，为Iturin A的工业化制备提供思路，可推动Iturin A在农业生物防治[26]、医药开发[27]和食品保鲜[28]等领域的应用。
表3 Iturin A分离纯化工艺过程参数
Table3 Process parameters ofiturin A separation and purification
步骤纯度/%步骤回收率/%累计回收率/%初始提取液3.96100100活性炭脱色后3.9189.4889.48正丁醇萃取后19.2392.9883.19大孔树脂纯化后35.3679.5866.21硅胶柱纯化后84.6670.8646.91
本研究构建了以活性炭脱色、多级纯化联用的Iturin A 高效制备工艺。以脱色率与回收率为双目标，通过正丁醇萃取及梯度纯化，实现纯度从3.91%升至84.66%（约为初始样品的21.4倍），突破现有Iturin A纯度为68.3%瓶颈。在活性炭脱色阶段脱色率65.37%、回收率89.48%；正丁醇萃取纯度升至19.23%、回收率83.19%；HZ816树脂提纯后纯度升至35.36%、回收率66.21%；硅胶柱精制终纯度达84.66%、回收率46.91%。该工艺在保证高纯度的同时兼顾了各阶段的回收率，所建立的工艺流程为Iturin A的规模化制备提供参考。
[1] 出晓铭. 生防菌解淀粉芽孢杆菌LY-1抗菌脂肽IturinA的纯化鉴定及抑菌机理研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2016. DOI:10.27018/d.cnki.gfjnu.2016.000313.
[2] 蔡勋超. 生防贝莱斯芽孢杆菌CC09菌株的基因组学转录组学及其合成iturin A的调控机理[D]. 南京: 南京大学, 2017. DOI:10.27235/d.cnki.gnjiu.2017.000664.
[3] WANG S Y, XU M, HAN Y, et al. Exploring mechanisms of antifungal lipopeptide iturin a from Bacillus against Aspergillus niger[J]. Journal of Fungi, 2024, 10(3): 172. DOI:10.3390/jof10030172.
[4] LEI S Z, ZHAO H B, PANG B, et al. Capability of iturin from Bacillus subtilis to inhibit Candida albicans in vitro and in vivo[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103(11): 4377-4392.DOI:10.1007/s00253-019-09805-z.
[5] AMBRICO A, TRUPO M. Efficacy of cell free supernatant from Bacillus subtilis ET-1, an iturin A producer strain, on biocontrol of green and gray mold[J]. Postharvest Biology and Technology, 2017,134: 5-10. DOI:10.1016/j.postharvbio.2017.08.001.
[6] 栾鹏宇. B. amyloliquefaciens ZK-9防治禾谷镰刀菌的作用及其产物Iturin A的抑菌机制研究[D]. 郑州: 河南工业大学, 2024.DOI:10.27791/d.cnki.ghegy.2024.000441.
[7] YARAGUPPI D A, BAGEWADI Z K, PATIL N R, et al. Iturin:a promising cyclic lipopeptide with diverse applications[J].Biomolecules, 2023, 13(10): 1515. DOI:10.3390/biom13101515.
[8] ZENG P, WANG H L, ZHANG P F, et al. Unearthing naturallyoccurring cyclic antibacterial peptides and their structural optimization strategies[J]. Biotechnology Advances, 2024, 73: 108371.DOI:10.1016/j.biotechadv.2024.108371.
[9] DENG L Z, XU R R, ZHANG S Q, et al. Calcium alginateencapsulated Propolis microcapsules: optimization, characterization,and preservation effects on postharvest sweet cherry[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 282: 137473.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2024.137473.
[10] YUAN J, RAZA W, HUANG Q W, et al. Quantification of the antifungal lipopeptide iturin A by high performance liquid chromatography coupled with aqueous two-phase extraction[J]. Journal of Chromatography B,2011, 879(26): 2746-2750. DOI:10.1016/j.jchromb.2011.07.041.
[11] 张婷, 杨杰, 周金燕, 等. 大孔吸附树脂分离提取发酵液中伊枯草菌素A的研究[J]. 广东农业科学, 2012, 39(8): 94-96. DOI:10.3969/j.issn.1004-874X.2012.08.030.
[12] DHANARAJAN G, RANGARAJAN V, SEN R. Dual gradient macroporous resin column chromatography for concurrent separation and purification of three families of marine bacterial lipopeptides from cell free broth[J]. Separation and Purification Technology, 2015, 143:72-79. DOI:10.1016/j.seppur.2015.01.025.
[13] 顾康博. 细菌源脂肽的规模化制备和BM脂肽毒理及其防治灰霉病药效的研究[D]. 上海: 华东理工大学, 2018.
[14] FANG Y Y, LI L L, ZHENG Y L, et al. Extraction, isolation and identification of antimicrobial substances from Bacillus amyloliquefaciens CMN1308[J]. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 2017, 45(1): 308-315. DOI:10.15835/nbha45110654.
[15] ZHANG D L, WANG Y F, LU Y J, et al. An efficient method for separation of surfactin from Bacillus amyloliquefaciens fmb50 broth by flocculation[J]. Process Biochemistry, 2014, 49(7): 1182-1188.DOI:10.1016/j.procbio.2014.03.021.
[16] 何强. 达托霉素的分离纯化研究[D]. 杭州: 浙江工业大学, 2017.
[17] YUAN Y, CHU D P, FAN J J, et al. Production of antifungal iturins from vegetable straw: a combined chemical-bacterial process[J]. Bioresource Technology, 2023, 378: 129010. DOI:10.1016/j.biortech.2023.129010.
[18] TANG Z M, ZHANG H L, XIONG J, et al. Enhanced iturin a production in a two-compartment biofilm reactor by Bacillus velezensis ND[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2023, 11: 1102786. DOI:10.3389/fbioe.2023.1102786.
[19] 石举然. 解淀粉芽孢杆菌iturinA的分离纯化及其对橙汁中酿酒酵母抑制作用的研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2017. DOI:10.7666/d.Y3539831.
[20] 田彦芳, 万海同, 朱紫烨, 等. 基于熵权法的多目标筛选甘草黄酮类成分纯化工艺[J]. 中草药, 2016, 47(7): 1118-1125. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2016.07.010.
[21] KORKMAZ V, ONDER ERGUVEN G, TANYOL M, et al.Decolorization of Remazol Brilliant Violet 5R and Brilliant Green dyes by Hypnum cupressiforme using response surface methodologycentral composite design methodology: toxicity assessment studies by Daphnia magna[J]. Desalination and Water Treatment, 2022, 278:251-262. DOI:10.5004/dwt.2022.29082.
[22] SI X S, LI J C, ZHAO T B, et al. Effective decolorization of poly-γ-glutamic acid fermentation broth by integrated activated carbon adsorption and isoelectric point precipitation of glutamic acid[J]. Molecules, 2024, 29(23): 5769. DOI:10.3390/molecules29235769.
[23] HU M Z, YU J S, ZHANG H Q, et al. An efficient method for the recovery and separation of surfactin from fermentation broth by extraction-back extraction[J]. Process Biochemistry, 2022, 114: 59-65.DOI:10.1016/j.procbio.2022.01.014.
[24] LE N T, HO H T T, DUONG T D, et al. Optimization of ultrasonicassisted extraction and purification of flavonoids from Sophorajaponica L.with macroporous resins[J]. Separation Science and Technology, 2024,59(3): 419-435. DOI:10.1080/01496395.2024.2320714.
[25] 顾康博, 管成, 许家慧, 等. 中试规模纯化海洋芽孢杆菌源脂肽类化合物[J]. 生物工程学报, 2016, 32(11): 1549-1563. DOI:10.13345/j.cjb.160126.
[26] JIANG M X, PANG X Y, LIU H W, et al. Iturin a induces resistance and improves the quality and safety of harvested cherry tomato[J].Molecules, 2021, 26(22): 6905. DOI:10.3390/molecules26226905.
[27] JIANG J P, HAN M N, FU S Q, et al. Enhanced production of iturin A-2 generated from Bacillus velezensis T701 and the antitumor activity of iturin A-2 against human gastric carcinoma cells[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 2021, 28(1): 27.DOI:10.1007/s10989-021-10340-7.
[28] LI Z M, BI X F, XIE X Y, et al. Preparation and characterization of iturin A/chitosan microcapsules and their application in post-harvest grape preservation[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2024, 275: 134086. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2024.134086.