基于多维测序解析酒糟醋醅发酵前后微生物组成及功能
母 雨1,2，苏媛媛1，田梓又1，潘英东1，杨 惠1，雷义露1，黄 颖3，赵 驰1,2，张 洪1,2,*
（1.茅台学院食品工程学院，贵州 遵义 564507；2.贵州省保健酒酿造技术工程研究中心，贵州 遵义 564507；3.茅台学院酿酒工程学院，贵州 遵义 564507）
摘 要：借鉴保宁醋“回糟”工艺，以白酒糟替代醋糟发酵醋，检测醋醅发酵前后的理化指标，采用扩增子测序和宏基因组学解析微生物组成，并对微生物代谢功能进行注释。结果表明，发酵后醋醅中淀粉、蛋白质及脂肪含量显著降低，水分质量分数、总酸和氨基酸态氮含量分别显著提高至57.90%、5.08 mmol/10 g、1.80 g/kg（P＜0.05）。发酵前、后醋醅共有优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）和子囊菌门（Ascomycota），发酵前醋醅中泛菌属（Pantoea，11.69%）和链格孢菌属（Alternaria，23.07%）占主导，而发酵后醋杆菌属（Acetobacter，62.93%）和毕赤酵母属（Pichia，36.94%）占主导。发酵前、后醋醅差异菌属分别为9、7个。相关性分析表明，水分含量与泛菌属等多种细菌属呈极显著负相关（P＜0.01），而蛋白质和淀粉含量与毕赤酵母属呈极显著负相关（P＜0.01）。共现网络分析表明发酵前后醋醅微生物间互作模式发生改变。功能注释表明，发酵后醋醅菌群在大分子代谢、小分子合成与转化等主要功能类别上的基因丰度更高。
关键词：酒糟醋；发酵；微生物群落；宏基因组学
收稿日期：2025-10-27
基金项目： 贵州省发改委项目（黔发改高技[2019]613号）；仁怀市科技计划项目（仁科计划〔2025〕28号）；茅台学院大学生创新创业训练计划项目（S2025146252449）
第一作者简介： 母雨（1997—）（ORCID: 0000-0002-0697-6229），男，副教授，博士，研究方向为白酒酿造微生态。E-mail: mu_yu1997@163.com
*通信作者简介：张洪（1986—）（ORCID: 0000-0003-1894-8169），男，副教授，博士，研究方向为微生物学。E-mail: hongzhang1986@163.com
Analysis of Microbial Composition and Functions before and after Fermentation of Vinegar Grains from Distillers’Grains Based on Multi-dimensional Sequencing
MU Yu1,2, SU Yuanyuan1, TIAN Ziyou1, PAN Yingdong1, YANG Hui1, LEI Yilu1, HUANG Ying3, ZHAO Chi1,2, ZHANG Hong1,2,*
(1. School of Food Engineering, Moutai Institute, Zunyi 564507, China;2. Guizhou Health Wine Brewing Technology Engineering Research Center, Moutai Institute, Zunyi 564507, China;3. School of Brewing Engineering, Moutai Institute, Zunyi 564507, China)
Abstract: Referring to the ‘Huizao’process of Baoning vinegar, vinegar was fermented with distillers’grains instead of vinegar residues. The physicochemical indices of vinegar grains were determined before and after the fermentation, while microbial community composition was profiled via amplicon sequencing and metagenomics, with subsequent annotation of microbial metabolic functions. The results indicated that significant reductions in starch, protein, and fat contents were observed in the vinegar grains after the fermentation. Conversely, moisture content, total acid and amino acid nitrogen were significantly increased to 57.90%, 5.08 mmol/10 g, and 1.80 g/kg, respectively (P < 0.05). Proteobacteria and Ascomycota remained the dominant phyla in the vinegar grains throughout the fermentation. In contrast, Pantoea (11.69%)and Alternaria (23.07%) were the predominant genera before the fermentation, whereas Acetobacter (62.93%) and Pichia(36.94%) became the dominant genera after the fermentation. A total of nine genera were found to be differential in the vinegar grains before the fermentation, while the seven were identified after the fermentation. Correlation analysis indicated that moisture content was extremely significant negatively correlated with multiple bacterial genera such as Pantoea(P < 0.01), while protein and starch contents exhibited an extremely significant negative correlation with Pichia (P < 0.01).Co-occurrence network analysis indicated remarkable shifts in microbial interaction patterns in vinegar grains following fermentation. Functional annotation indicated that higher gene abundances in major functional categories associated with macromolecular metabolism, small-molecule biosynthesis and transformation were detected in the microbiota of vinegar grains after the fermentation.
Keywords: distillers’grains vinegar; fermentation; microbial community; metagenomics
DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.012
中图分类号：TS264.2
文献标志码：A
文章编号：0254-5071（2026）06-0087-11
引文格式：
母雨, 苏媛媛, 田梓又, 等. 基于多维测序解析酒糟醋醅发酵前后微生物组成及功能[J]. 中国酿造, 2026, 45(6): 87-97.DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.012. http://www.chinabrewing.net.cn
MU Yu, SU Yuanyuan, TIAN Ziyou, et al. Analysis of microbial composition and functions before and after fermentation of vinegar grains from distillers’grains based on multi-dimensional sequencing[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 87-97.(in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.012. http://www.chinabrewing.net.cn
白酒是中华民族千百年来代代相传的文化瑰宝，多边固态发酵及多菌共酵模式赋予其别具一格的风味特征[1-2]。白酒糟作为主要酿造副产物，每年产量在2 000～3 000万 t之间，其富含淀粉、蛋白质及脂肪等物质[3]。然而，目前对酒糟的处理主要是作为饲料直接销售，未能充分发挥其潜在经济价值。因此，对酒糟进行精深加工具有重要意义。
酒糟醋是以酒糟为主料或辅料酿制的醋[4]。酒糟制醋凭借其工艺成熟、转化效率高等优势，可以有效实现酒糟的再利用，已开发酒糟泡醋[4]、酒糟淋醋[5]、酒糟发酵醋[6]等。正所谓“酒醋同源”，保宁醋作为固态发酵醋的代表，除了独特的药曲酿醋外，其最大的工艺特点便是“回糟配料”，醋糟用量可达原料的60%以上[7]。回糟的多次循环利用不仅有效提高了原料淀粉利用率，其具备的疏松物料功能还能促进微生物的生长代谢[8]。目前，国内外围绕食醋醋醅的研究主要集中在群落结构解析、功能微生物筛选及代谢机制解析等方面[9-11]。然而，关于酒糟醋发酵微生物组成及其代谢功能的系统探究鲜见报道。
本研究基于保宁醋“回糟”工艺，以白酒糟替代醋糟发酵酒糟醋，解析醋醅发酵前后的理化特性，结合扩增子测序和宏基因组学探究微生物组成及代谢功能的变化，并通过Spearman相关性分析和共现网络分析考察关键理化因子及群落互作模式，以期解析酒糟醋中的微生物菌群，为食醋品质的提升提供理论依据及技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料（麸皮、次粉、糠壳、曲粉、酒糟） 贵州省仁怀市某酒企；糖化酶（1×105 U） 河北万达生物工程有限公司；液化酶（1×105 U） 四川绿聘生物科技有限公司；酿酒高活性干酵母 安琪酵母有限公司；巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）沪酿1.01 中国工业微生物菌种保藏管理中心。
土壤DNA试剂盒 美国Omega Biotek公司；无水乙醇天津市北方天医化学试剂厂；氢氧化钠 天津市福晨化学试剂厂；可溶性淀粉 天津市江天化工技术股份有限公司；亚铁氰化钾 上海源叶生物科技有限公司；酒石酸钾钠、葡萄糖 上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醛、硫酸钾、盐酸、硫酸铜、硫酸 国药集团化学试剂有限公司；次甲基蓝 天津科密欧化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
BGG-9140A电热鼓风干燥箱 上海恒科仪器有限公司；FA2204N电子天平 上海菁海仪器有限公司；pHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；AM-3250C电磁搅拌器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；A1835080磁力转子 上海艾测电子科技有限公司；LDZF-30L立式高压蒸汽灭菌锅 上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酒糟醋的制备与样品采集
参考保宁醋的“回糟发酵”工艺[7]，使用酱香型白酒新鲜酒糟完全替代醋糟制备酒糟醋。称取10.0 kg酒糟121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后加入麸皮3.0 kg、次粉0.5 kg、大曲粉1.0 kg、糠壳1.0 kg、糖化酶30 g、液化酶30 g、干酵母10 g等辅料，加入适量水（煮沸后冷却至室温）调整初始水分质量分数为50%～53%，翻拌均匀后转入发酵坛自然发酵5 d，然后将3%经活化的巴氏醋杆菌沪酿1.01种子液（1×108 CFU/mL）继续发酵20 d，总酸达到5 mmol/10 g时停止发酵。在发酵前后从醋醅上、中、下层按5点法取样，混匀后置于无菌密封袋中，于-20 ℃保存备用。
1.3.2 理化指标测定
水分含量的测定：采用GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》直接干燥法；总酸含量的测定：采用GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中的电位滴定法；氨基酸态氮含量的测定：采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法；淀粉含量、还原糖含量的测定：采用斐林试剂法；脂肪含量的测定：采用索式抽提法；蛋白质含量的测定：采用凯氏 定氮法。
1.3.3 DNA提取、测序及宏基因组测序
利用土壤DNA试剂盒提取发酵前后醋醅的总基因组DNA，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，并通过分光光度计测定DNA浓度和纯度。分别用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）、806R（5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rDNA V3～V4区，引物ITS5（5′-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3′）、ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）扩增真菌ITS1区。PCR扩增条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。扩增子纯化和定量后，构建测序文库，在上海派森诺生物技术有限公司的Illumina NovaSeq平台上进行双端测序（2×250 bp）。对于宏基因组分析，利用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit构建插入片段大小为400 bp的鸟枪法测序文库，并在上海派森诺生物技术有限公司的Illumina HiSeq X-ten平台进行测序（PE 150）。
1.3.4 生物信息学分析
扩增子测序数据由QIIME 2（2019.4）处理，包括引物去除、质量过滤、去噪、合并和去除嵌合体等，最后利用Silva（v132）和UNITE（v8.0）数据库进行分类注释。对宏基因组学原始数据进行处理，包括测序数据质控、序列拼接组装、非冗余基因集的构建、基因预测、物种注释与分析及基因功能注释与分析，包括京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、MetaCyc、碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active enZYmes，CAZy）和基因进化谱系：非监督直系同源簇（evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups，eggNOG）数据库[12]。
1.4 数据处理
实验重复3次，结果以
±s表示，并利用SPSS 23.0进行显著性分析。采用R v4.1.1软件（https://www.r-project.org/）进行数据可视化。采用vegan包进行α-多样性分析（Shannon指数和Chao1指数），并基于Bray-Curtis 距离算法进行主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）以评价β-多样性。在开放网页（http://huttenhower.harvard.edu/galaxy/）中进行线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析以确定生物标志物，阈值为线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）得分＞4.0和P＜0.05。Hmisc和pheatmap软件包分别用于计算和可视化优势微生物属与理化因子间的Spearman相关性。基于Spearman算法（相关系数|ρ|＞0.6和P＜0.05），利用Cytoscape（v.3.60）软件进行相关性网络图可视化分析。使用Krona软件（https://github.com/marbl/Krona/wiki）对宏基因组学数据在门、属、种水平上的细菌分类学组成可视化。Origin 2021用于多数据库的基因功能丰度可视化。
2 结果与分析
2.1 醋醅发酵前后理化指标
由表1可知，发酵前淀粉、蛋白质量分数和脂肪含量分别由15.11%、21.36%、10.41 g/kg显著降低至发酵后的8.62%、15.80%、5.54 g/kg（P＜0.05）。淀粉利用率（43%）与传统麸醋（45%）接近[13]，可能是由于糖化酶（α-淀粉酶与葡萄糖淀粉酶）的水解作用；蛋白质含量下降与醋酸菌、芽孢杆菌等微生物分泌的蛋白酶密切相关[14]；脂肪被脂肪酶分解成游离脂肪酸和甘油，导致脂肪含量下降。发酵前、后还原糖质量分数均较低（0.017%、0.013%），可能是因为发酵前期积累的葡萄糖在中后期会被微生物生长代谢所消耗[15]。
表1 醋醅发酵前后理化指标变化
Table1 Changes in physicochemicalindicators of vinegar grains before and after fermentation
水分质量分数/%53.02±0.47b57.90±2.12a总酸含量/（mmol/10 g）3.90±0.35b5.08±0.17a氨基酸态氮含量/（g/kg）1.40±0.17 b 1.80±0.15a指标发酵前（0 d）发酵后（25 d）淀粉质量分数/%15.11±0.59a8.62±0.94b还原糖质量分数/%0.017±0.00a0.013±0.00b蛋白质量分数/%21.36±1.02a15.80±1.24b脂肪含量/（g/kg）10.41±0.27a5.54±0.41b
注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
发酵前醋醅水分、总酸、氨基酸态氮分别由53.02%、3.90 mmol/10 g、1.40 g/kg显著增加至57.90%、5.08 mmol/10 g、1.80 g/kg，与四川麸醋发酵趋势[13]一致。水分含量变化符合固态发酵特征，可能与微生物代谢产水分及麸皮等原料吸水性有关[13]。总酸含量增加可能是由于醋酸菌将乙醇氧化为乙酸，丙酮酸可通过多种代谢途径生成乙酸、丙酸和丁酸[16]。氨基酸态氮含量增加可能与蛋白质分解和游离氨基酸积累有关。
2.2 醋醅发酵前后扩增子测序结果
2.2.1 醋醅发酵前后微生物多样性
由图1A1、B1可知，当细菌序列数＞4 000条、真菌序列数＞40 000条时，扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）数趋于稳定，足够反映发酵前后醋醅样品中细菌及真菌的群落多样性特征。α-多样性中Chao1指数反映物种丰富度，而Shannon指数评估群落的物种多样性，其数值越大，表明物种丰富度及多样性越高。发酵后醋醅样品细菌群落的Chao1指数显著增加，而Shannon指数显著下降（P＜0.05）（图1A2、A3），真菌群落的Chao1指数和Shannon指数均降低（图1B2、B3），表明发酵减少了醋醅样品细菌及真菌多样性，增加了细菌丰富度。这与张雅琳等[17]在四川麸醋发酵过程中细菌多样性和真菌丰富度降低的研究结果一致。由图1A4、B4可知，PCo1、PCo2分别解释了细菌72.0%、12.2%的变异度，发酵前醋醅样品集中在PCo1负半轴，而发酵后醋醅样品集中在PCo1正半轴；PCo1、PCo2分别解释了真菌32.3%、23.6%的变异度，发酵前醋醅样品集中在PCo2正半轴，而发酵后醋醅样品集中在PCo2负半轴。这可能是因为发酵环境抑制了不耐酸细菌的生长代谢，而真菌因细胞壁特殊结构受环境影响较小[18]。
2.2.2 醋醅发酵前后细菌群落结构分析
由图2A可知，醋醅发酵前后共检出20个细菌门，其中优势细菌门（相对丰度＞1%）有3个，包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota），其在发酵前、后的平均相对丰度均较高，Proteobacteria的平均相对丰度由发酵前（42.16%）增加至发酵后（72.24%），而Firmicutes和Actinobacteriota分别由发酵前（38.33%、16.94%）降低至发酵后（23.71%、3.66%）。此外，而拟杆菌门（Bacteroidota）和粘菌门（Myxococcota）等菌门仅在发酵前检出。
由图2B可知，醋醅发酵前后共检出263个细菌属，平均相对丰度前10的优势细菌属包括醋杆菌属（Acetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、泛菌属（Pantoea）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）、甲基杆菌属-甲基红菌属（Methylobacterium-Methylorubrum）、根瘤菌属（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、黄单胞菌属（Xanthomonas）和假单胞菌属（Pseudomonas）。其中，Acetobacter、Bacillus、Weissella及Pantoea等在多种传统发酵食醋中也被定义为优势微生物[19]。发酵前，Pantoea、Weissella、Bacillus平均相对丰度较高（11.69%、11.11%、8.88%），其次为Saccharopolyspora、Lactiplantibacillus和Methylobacterium-Methylorubrum。发酵后，Acetobacter平均相对丰度高达62.93%，Weissella和Bacillus平均相对丰度变化不大（9.86%、5.93%），但Pantoea、Saccharopolyspora和Xanthomonas平均相对丰度明显降低，分别从11.69%、6.73%和4.19%降至1.84%、0.49%和0.34%。类似地，在四川麸醋、镇江香醋和山西老陈醋醋酸发酵后观察到Acetobacter占绝对优势[17,19-20]。Acetobacter是食醋醋酸发酵优势菌，能将乙醇转化为乙酸和乳酸等，赋予产品酸味。Weissella和Bacillus也能产生多种有机酸，并在多种发酵食品中与酸度密切相关。
2.2.3 醋醅发酵前后真菌群落结构分析
由图3A可知，醋醅发酵前后共检出4个真菌门，其中优势真菌门（相对丰度＞1%）为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），这与刘稼鑫等[9]研究结果一致。
由图3B可知，醋醅发酵前后共检出103个真菌属，前10种优势真菌属包括曲霉属（Aspergillus）、毕赤酵母属（Pichia）、链格孢菌属（Alternaria）、马拉色菌属（Malassezia）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、耐干霉菌属（Xeromyces）、布氏白粉菌属（Blumeria）、表皮三棘孢菌属（Cutaneotrichosporon）和念珠菌属（Candida）。发酵前Alternaria、Malassezia、Blumeria的平均相对丰度较高（23.07%、20.23%、3.12%），但发酵结束后逐渐消亡，而Aspergillus和Pichia逐渐富集，平均相对丰度分别由15.62%、5.05%增加至27.28%、36.94%。类似地，Pichia也是四川麸醋和山西老陈醋发酵末期最丰富的真菌[10,17]。Pichia是典型的非酿酒酵母，是麸醋核心功能微生物，能产生丰富的风味物质。Aspergillus在食醋发酵中则主要通过分泌淀粉酶和蛋白酶等促进大分子物质转化为小分子代谢物，为其他微生物的生长代谢提供底物[21]。
2.2.4 醋醅发酵前后微生物差异分析
为对比醋醅发酵前后微生物群落差异性，采用LEfSe结合LDA得分＞4.0进行分析，结果见图4。由图4A1、A2可知，发酵前、后醋醅分别筛选出Actinobacteriota、Proteobacteria 2个差异细菌门。在属水平上，发酵前醋醅的差异细菌属为Saccharopolyspora、Lactiplantibacillus、黏液乳杆菌属（Limosilactobacillus）、Methylobacterium-Methylorubrum、罗尔斯通菌属（Ralstonia）、Pantoea、Xanthomonas和Pseudomonas，而发酵后醋醅的差异细菌属为Acetobacter、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、狭义梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）和副球菌属（Paracoccus）。其中，大部分差异细菌属常在食醋发酵过程中检出[9]。类似地，Pantoea/Xanthomonas和Acetobacter分别被鉴定为山西老陈醋发酵初期和末期的细菌标志物[22]。Pantoea的主要来源可能是大曲，因不耐受高温和高酸，其相对丰度常随发酵逐渐降低[18,23]。此外，Thermoactinomyces和Clostridium_sensu_stricto_1是酿造微生态常见功能菌，可分别促进酯类物质和酸类物质形成，有助于食醋品质的形成[24-25]。
由图4B1、B2可知，发酵前后醋醅未筛选出差异菌门，Blumeria被鉴定为发酵前醋醅差异真菌属，而厚丝孢菌属（Spissiomyces）、Pichia和皮肤毛孢菌属（Cutaneotrichosporon）为发酵后醋醅差异真菌属。Pichia亦被鉴定为山西老陈醋的真菌标志物，盔形毕赤酵母（Pichia manshurica）可赋予食醋花果香[11]。此外，厚丝孢菌属在酱油发酵末期显著富集，并与总酸显著正相关[26]， 这可能是其能在醋醅发酵后期富集的原因。然而，Blumeria和Cutaneotrichosporon可能引起植物白粉病或人类机会性感染，其来源和功能需进一步探究。
2.3 相关性分析
2.3.1 优势微生物属与理化指标的相关性分析
平均相对丰度排名前10优势细菌属、优势真菌属与理化指标的相关性分析热图见图5。由图5A可知，水分含量与Pantoea、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、Xanthomonas呈极显著负相关（P＜0.01），与Saccharopolyspora、Methylobacterium-Methylorubrum和Pseudomonas呈显著负相关（P＜0.05）；脂肪含量与Methylobacterium-Methylorubrum呈极显著正相关 （P＜0.01），与Xanthomonas呈显著正相关（P＜0.05）， 与Acetobacter呈显著负相关（P＜0.05）；还原糖含量与Methylobacterium-Methylorubrum、Xanthomonas呈极显著正相关（P＜0.01），与Pseudomonas呈显著正相关（P＜ 0.05），与Acetobacter呈显著负相关（P＜0.05）；蛋白质含量与Pantoea呈显著正相关，与Acetobacter呈显著负相关；总酸、氨基酸态氮含量与Pantoea呈显著负相关，淀粉含量与Pseudomonas呈显著正相关（P＜0.05）。由图5B可知，蛋白质及淀粉含量与Pichia呈极显著负相关（P＜0.01），与Candida呈显著负相关（P＜0.05），脂肪含量与Pichia呈极显著负相关（P＜0.01），而水分、总酸与氨基酸态氮含量与Pichia呈显著正相关（P＜0.05）。
水分含量与Pantoea、Saccharopolyspora等6种细菌显著相关，而还原糖和脂肪含量分别与4种和3种细菌显著相关。水分含量变化在多种传统发酵食品中驱动细菌群落演替，可能是因为细菌更需要自由水维持生理活动，而真菌更能适应水分变化[27-28]。还原糖含量对调节白酒发酵细菌群落的组装模式和多样性亦具有重要作用，尤其是丰富细菌类群，可能是充足碳源促进优势菌群的快速繁殖[29-30]。相比之下，真菌群落则对碳、氮源具有特异性适应，蛋白质和淀粉含量与Pichia和Candida呈显著负相关。蛋白质、淀粉可被Pichia分泌的淀粉酶和蛋白酶降解为氨基酸、葡萄糖用于其生长代谢，导致这类大分子含量降低而Pichia相对丰度增加[31]。综上，醋醅细菌和真菌群落演替均受理化因子驱动，但细菌群落所受的影响更大。
2.3.2 优势细菌属与优势真菌属间的共现网络分析
共现网络分析可探究优势微生物菌属间的相互作用[26]。 基于Spearman算法（相关系数|ρ|＞0.6和P＜0.05），对醋醅发酵前、后的优势微生物菌属进行共现网络分析。由图6A可知，醋醅发酵前群落由18个节点和53条边组成， 包括34种显著正相关和19种显著负相关（P＜0.05）。其中，5种细菌属（Acetobacter、Bacillus、Pseudomonas、Xanthomonas、Methylobacterium-Methylorubrum）与6种真菌属（Thermoascus、Saccharomycopsis、Xeromyces、Blumeria、Candida、Pichia）之间存在显著的协同作用，但Aspergillus、Weissella和Lactiplantibacillus与大多优势微生物间呈拮抗作用。另外，Alternaria和Malassezia分别与Pantoea和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium呈正相关和负相关。由图6B可知，醋醅发酵后群落由19个节点和32条边组成，包括19种显著正相关和13种显著负相关（P＜0.05），网络模块化程度更高。值得注意的是，发酵前后群落互作模式发生了明显改变，Weissella和Lactiplantibacillus与Thermoascus、Candida、Pichia之间的关系由拮抗转变为协同。类似地，在山西老陈醋发酵前、中、后期观察到群落互作模式的明显演替，这可能与营养条件和发酵环境的剧烈变化有关[22]。
2.4 醋醅发酵前后宏基因组学的测序结果分析
由于细菌群落在发酵前后变化更明显，进一步对细菌群落在门、属、种水平进行宏基因组分析。由图7A可知，醋醅发酵前，Proteobacteria相对丰度最高（74%），占绝对优势，其次为Bacteroidota（7%）和Firmicutes（7%）；由图7B可知，醋醅发酵后，Proteobacteria相对丰度增加至94%，而其余优势菌门被Actinobacteriota（4%）取代。在属和种水平上对Proteobacteria的微生物属进行分析。由图7C可知，醋醅发酵前，在属水平上，主要优势细菌属为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、固氮弓菌属（Azonexus）、Pantoea、Xanthomonas、Acetobacter、土壤杆菌属（Agrobacterium），相对丰度分别为51%、15%、6%、3%、2%、2%；在物种水平上，慢生根瘤菌sp003020115（51%）、固氮弓菌sp009469615（15%）、QFNRO1 sp003248485（9%）、菠萝鲍曼氏菌（Bowmanella ananatis，5%）、醋酸杆菌sp013009345（2%）、成团泛菌（Pantoea agglomerans，2%）、泛菌sp003512445（1%）占优势。由图7D可知，醋醅发酵后，主要优势细菌属为Acetobacter，占Proteobacteria总相对丰度的80%，其优势物种包括稻生醋酸杆菌（Acetobacter oryzoeni，38%）、稻生发酵醋酸杆菌（Acetobacter oryzifermentans，4%）、巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus，3%）、苹果醋酸杆菌（Acetobacter pomorum，2%）和印度尼西亚醋酸杆菌（Acetobacter indonesiensis，2%）。稻生醋酸杆菌和巴氏醋酸杆菌是山西老陈醋发酵过程中的优势物种，前者与甲硫醇、甲硫醛、3-甲基丁醛和3-甲基丁醇的形成密切相关，而后者在乙酸生产中起关键作用，并能将其进一步转化为醛和酯[21]。此外，巴氏醋酸杆菌在四川麸醋发酵末期相对丰度超过80%[17]，但其与苹果醋酸杆菌仅在镇江香醋发酵初期富集[32]，表明不同食醋间的醋酸杆菌存在种间差异。
2.5 基于宏基因组的醋醅群落功能分析
为解析醋醅发酵前后微生物群落在功能特征和代谢途径上的差异，采用KEGG、MetaCyc、CAZy、eggNOG数据库对宏基因组数据进行注释。由图8A可知，在KEGG第1层级水平上，代谢相关基因最丰富，但各类基因的每一百万个转录本的数量（transcripts per million，TPM）在发酵前远低于发酵后。因此，进一步分析了代谢相关功能基因在第2层级水平上的分布。由图8B可知，碳水化合物代谢和氨基酸代谢是主要生物学功能，基因丰度分别占总丰度的18.5%和11.7%，表明发酵后群落具有很强的底物降解和风味形成潜力。类似地，在红曲米醋发酵过程中，观察到代谢功能的主导地位，尤其是碳水化合物代谢和氨基酸代谢[33]。
由图8C可知，在MetaCyc第1层级水平上，发酵后醋醅菌群的功能基因丰度亦高于发酵前，以生物合成为主要功能。由图8D可知，在与生物合成相关的第2层级中，核苷与核苷酸合成（20.0%）、辅因子、载体与维生素合成（14.1%）、氨基酸生物合成（10.8%）以及脂肪酸和脂质生物合成（10.1%）占主导地位。核苷酸和氨基酸的合成有助于形成独特口感，而氨基酸和脂肪酸可通过Strecker降解和氧化/酯化反应形成大量挥发性物质，以提升风味品质[34]。
鉴于碳水化合物代谢的高丰度和淀粉含量的显著降低，基于CAZy数据库揭示醋醅发酵前后群落在碳水化合物利用能力上的差异，结果如图8E所示。糖基转移酶和糖苷水解酶占主导地位，与麸醋醋醅微生物功能研究结果一致[35]。糖基转移酶主要参与寡糖和多糖的生物合成，而糖苷水解酶包括与淀粉液化、糖化和纤维素降解相关的酶[23]。该结果与KEGG结果一致，发酵后群落的碳水化合物代谢基因丰度明显高于发酵前，这是因为醋醅发酵伴随着大量底物降解。
eggNOG数据库注释表明发酵后醋醅中菌群在大多功能类别上的基因丰度更高，如复制、重组和修复、氨基酸转运和代谢、能量产生与转换以及转录等（图8F），表明发酵通过生态位分化增强了群落对环境的耐受能力及代谢物形成与转化效率。然而，发酵前醋醅中菌群在信号转导机制和RNA加工与修饰等功能基因丰度更高，表明其可能依赖复杂的群体感应适应未发酵环境的资源竞争。此外，未知功能的基因丰度在发酵前后都最高，表明未来仍需通过高通量筛选和培养组学探索各种微生物的潜在功能。
3 结 论
以酱香型白酒糟替代醋糟，借鉴保宁醋回糟工艺制备酒糟醋，结合扩增子测序与宏基因组学技术，解析了醋醅发酵前后理化特性、微生物群落结构及代谢功能的变化。结果表明，发酵过程可显著降解原料中淀粉、蛋白质、脂肪等大分子物质，使醋醅水分、总酸、氨基酸态氮含量显著提升，实现了酒糟营养物质的有效转化，为食醋品质形成奠定物质基础。醋醅发酵前后鉴定出20个细菌门、4个真菌门以及263个细菌属、103个真菌属，其优势微生物类群在发酵过程中发生明显演替。Proteobacteria和Ascomycota为发酵过程中优势菌门，发酵后Acetobacter（62.93%）和Pichia（36.94%）成为绝对优势属，而Pantoea、Alternaria等不耐酸类群相对丰度大幅降低。细菌群落对发酵过程中理化因子的变化更为敏感，特别是水分含量；发酵改变了优势微生物属间的互作模式，Weissella、Lactiplantibacillus与真菌类群的关系由拮抗转为协同，提升了群落网络模块化程度。宏基因组分析显示，发酵后群落中与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、小分子合成转化相关的基因丰度显著升高，微生物代谢潜能被充分激活。
综上，通过对酒糟醋发酵前后理化指标分析以及多维测序分析，初步解析了发酵过程中微生物-理化因子-代谢功能的关联特征，明确了酒糟醋发酵的核心微生物及关键代谢功能，为酒糟醋工艺优化、地域特色食醋开发及产业化应用奠定了理论基础。
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