初始含水量对传统酱香型大曲发酵活跃期挥发性风味物质与菌群结构的影响

杨儒洁1,2，刘晓彤1,2，魏阳1,2，冉茂芳1,2，毛雪婷1,2，汤涵岚1,2，杨阳1,2，马吾霞1,2，沈才洪1,2，王松涛1,2,*

（1.泸州品创科技有限公司，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

摘要：以低（36%）、中（38%）、高（40%）3种含水量的鲜坯为研究对象，采用常规检测方法、顶空固相微萃取气相色谱-质谱技术和宏基因组测序技术系统分析曲坯在发酵活跃期的理化指标、挥发性风味物质含量变化及微生物群落结构演替动态规律，并分析其相关性。结果表明，第2次翻曲时，3组曲坯酸度、淀粉和还原糖含量无显著差异；中、高含水量组挥发性物质种类及总含量均高于低含水量组（低含水量组：76种，786.13 μg/g；中含水量组：83种，884.91 μg/g；高含水量组：87种，880.12 μg/g）。鲜坯初始含水量越高，微生物群落多样性越低。3组曲坯微生物群落均以嗜热芽孢杆菌属（Caldibacillus）为主，但在中、高水分组中占比远高于低水分组。相关性分析表明，同为乳酸菌类群的黏液乳杆菌属（Limosilactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）和魏斯氏菌属（Weissella）可相互促进，共同推动并调控群落演替过程。同时，微生物对挥发性物质合成表现出潜在贡献，如糖单孢菌属（Saccharomonospora）、喜热裂孢菌属（Thermobifida）、魏茨曼氏菌属（Weizmannia）和梭菌属（Clostridium）等与庚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸己酯和三甲基吡嗪等含量呈正相关。综上，鲜坯初始含水量可通过调控微生物群落结构影响酱香型大曲风味物质的形成与积累，且含水量为38%和40%时有利于挥发性物质的形成，该研究为优化酱香型大曲生产工艺提供了科学依据。

关键词：酱香型大曲；含水量；理化性质；挥发性味物质；微生物群落；宏基因组

基金项目：四川省中央引导地方科技发展专项（2024ZYD0252）；泸州市科技计划资助项目（2024JYJ103）

第一作者简介：杨儒洁（1995—）（ORCID: 0009-0002-0244-6092），女，工程师，硕士，研究方向为发酵微生物。E-mail: yangrj@lzlj.com

*通信作者简介：王松涛（1977—）（ORCID: 0000-0002-6122-3721），男，正高级工程师，博士，研究方向为酿酒微生物与酿酒工艺、食品原料开发。E-mail: wangst@lzlj.com

Effects of Initial Moisture Content on Volatile Flavor Substances and Microbial Community Structure of Traditional Sauce-Flavor Daqu during Active Fermentation Period

YANG Rujie1,2, LIU Xiaotong1,2, WEI Yang1,2, RAN Maofang1,2, MAO Xueting1,2, TANG Hanlan1,2, YANG Yang1,2,MA Wuxia1,2, SHEN Caihong1,2, WANG Songtao1,2,*

(1. Luzhou Pinchuang Technology Co. Ltd., Luzhou 646000, China;2. National Engineering Research Center of Solid-State Brewing, Luzhou Laojiao Co. Ltd., Luzhou 646000, China)

Abstract: Using fresh raw Daqu of low (36%), medium (38%) and high (40%) initial moisture contents as research objects, physicochemical indexes, variations of volatile ﬂavor substances and succession dynamics of microbial community structure of Daqu samples during the active fermentation period were systematically analyzed by conventional detection methods, headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, and metagenomic sequencing. The results showed that there was no significant difference in acidity, starch and reducing sugar contents among the three groups at the second Fanqu. Both species quantity and total content of volatile compounds in medium and high moisture groups were higher than those in the low moisture group, with 76 species and 786.13 μg/g in the low moisture group, 83 species and 884.91 μg/g in the medium moisture group, and 87 species and 880.12 μg/g in the high moisture group. Microbial community diversity decreased with the increase in the initial moisture content of the fresh raw Daqu.Caldibacillus dominated microbial communities of all groups, and its relative abundance was markedly higher in medium and high moisture groups. Correlation analysis revealed that Limosilactobacillus, Pediococcus, Lactiplantibacillus and Weissella could mutually facilitate growth and regulate community succession. Meanwhile, microorganisms showed potential contribution to the synthesis of volatile substances. Genera including Saccharomonospora, Thermobifida, Weizmannia and Clostridium were positively correlated with ethyl heptanoate, ethyl hexanoate, hexyl octanoate and trimethylpyrazine.In conclusion, initial moisture content regulated microbial community structure and further affected the formation and accumulation of ﬂavor substances in the sauce-ﬂavor Daqu. Moisture content of 38% and 40% were beneficial to volatile compound production. This study provided scientific reference for technological optimization of sauce-ﬂavor (Jiangxiangxing)Daqu production.

Keywords: sauce-ﬂavor Daqu; moisture content; physicochemical property; volatile ﬂavor substance; microbial community;metagenomics

引文格式：
杨儒洁, 刘晓彤, 魏阳, 等. 初始含水量对传统酱香型大曲发酵活跃期挥发性风味物质与菌群结构的影响[J]. 中国酿造,2026, 45(6): 75-86. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.011. http://www.chinabrewing.net.cn

YANG Rujie, LIU Xiaotong, WEI Yang, et al. Effects of initial moisture content on volatile ﬂavor substances and microbial community structure of traditional sauce-ﬂavor Daqu during active fermentation period[J]. China Brewing, 2026, 45(6):75-86. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.011. http://www.chinabrewing.net.cn

酱香型大曲是以小麦为原料，曲坯经高温（＞60 ℃）发酵而成的一种固态发酵剂，是中国传统酱香型白酒酿造的核心糖化发酵剂[1]。高温环境下生成的美拉德反应产物及各类微生物代谢产物共同构建酱香型白酒标志性的“酱香突出、幽雅细腻”风味特征。大曲品质直接影响基酒中风味物质的种类与含量，是决定酱香型白酒独特风格的关键要素[2]。

在酱香型大曲的制作工艺中，加水拌料是调控发酵微环境的重要环节，直接影响后续发酵进程及最终大曲的质量[3]。大曲水分含量在发酵过程中呈动态变化，这种变化能够有效驱动微生物群落结构演替及其代谢活性变化。如Zhu Min等[4]研究发现，在大曲发酵初期，由于水分含量较高，酵母菌占主导地位，促进底物发酵和降解；随着水分降低，曲霉属（Aspergillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和根毛霉菌属（Rhizomucor）为代表的芳香物质主要产生菌逐渐占据主导地位。Ma Shiyuan等[5]的研究进一步指出，在浓香型大曲的发酵过程中，细菌群落的演替主要受酸度、水分和温度等环境因子的协同影响，而真菌群落的演替则主要受水分含量变化的驱动。此外，熊翔等[6]通过调节曲坯初始含水量，发现初始含水量对机械压制浓香型大曲的理化性质和微生物组成具有不同程度的影响：当初始水分质量分数为39%时，大曲表现出较高的糖化力和发酵力、较低的酸度水平，且感官品质优良，利于有益微生物生长。然而，目前关于曲坯初始含水量对酱香型大曲挥发性物质产生和微生物群落结构的影响及其相关性仍缺乏系统研究。这不利于深入阐明大曲发酵代谢机理，也阻碍了优质酱香型大曲生产工艺的优化升级。

本研究通过设置低、中、高3个初始含水量梯度，开展酱香型大曲的发酵实验，在入房前（第0天）、第1次翻曲（第8天）、第2次翻曲（第16天）3个关键时间点进行取样，结合顶空固相微萃取气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术和宏基因组测序技术，系统分析不同初始含水量条件下，曲坯在发酵过程中挥发性风味物质含量变化及微生物群落结构演替动态规律及其相关性，以期揭示鲜坯初始含水量对酱香型大曲发酵过程中风味物质形成及微生物群落构建的影响，为生产高品质酱香型大曲提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

传统工艺生产酱香型大曲样品收集于四川泸州江阳区某制曲车间，生产过程中用稻草进行保温保湿。

葡萄糖、可溶性淀粉、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、浓硫酸成都市科龙化工试剂厂；土壤微生物DNA提取试剂盒德国QIAGEN公司；琼脂糖美国 Thermo Fisher Scientific公司；2-辛醇（色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

TL2010S中通量组织研磨破碎仪鼎浩源科技发展（天津）有限公司；DHG-9245A烘箱上海一恒科学仪器有限公司；DL-1电炉北京中兴伟业仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机、N13462C移液器德国Eppendorf公司；SP-756P紫外-可见分光光度计屹谱仪器制造（上海）有限公司；Sub System 70电泳槽美国 Labnet公司；JY600C电泳仪北京六一仪器厂；NanoDrop 2000超微量分光光度计美国Thermo Fisher Scientific公司；GC/MS-QP2020 GC-MS仪日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME头美国Supelco公司；MLS-375L全自动灭菌锅日本日立公司；NovaSeq 6000测序平台美国Illumina公司。

1.3 方法

在同一工艺同一批次酱香型大曲生产过程中，通过调整加水拌料环节的水分比例，将曲坯初始含水量设置为：低水分组（L，36%）、中水分组（M，38%）和高水分组（H，40%）。为确保实验的准确性和可重复性，每组曲坯在相同条件下制备，并在相邻的3间发酵房中进行发酵。

发酵过程中，分别在曲坯入房（第0天）、第1次翻曲（第8天）和第2次翻曲（第16天）进行样品采集。按照水分含量和发酵时间对所有样品进行编号，如低水分组的曲坯发酵至第8天的样品被编号为L-8。每次采样时，从每组曲堆靠中位置较深处随机抽取3块符合正常发酵感官规律的曲坯样本，经粉碎混匀后，放入无菌采样袋中，-20 ℃保存，以待后续理化性质、挥发性物质和微生物群落分析。

1.3.2 理化指标检测

曲坯中淀粉和还原糖含量采用Fehling试剂法[7]测定。曲坯水分、酸度及淀粉含量均按照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[8]进行测定。

1.3.3 挥发性物质测定

采用HS-SPME-GC-MS测定曲坯中挥发性代谢物及含量，将0.5 g样品和10 μL 0.164 4 g/L内标（2-辛醇）加入至20 mL顶空瓶中，60 ℃水浴平衡15 min，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME头萃取50 min，然后将其插入进样口解吸5 min进行GC-MS检测。GC-MS条件：20∶1分流模式进样，载气为纯度99.99%的氦气。起始温度为40 ℃保持5 min，以4 ℃/min速率升至100 ℃，再以6 ℃/min速率升至230 ℃，保持10 min。进样口温度270 ℃，电子电离源，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 35～400。将挥发性代谢物数据与标准谱库（NIST 2017）对比进行定性，根据保留指数选取正反匹配度均大于800的物质进行分析[9]。采用峰面积归一化法，基于内标2-辛醇质量浓度和峰面积对鉴定的挥发性化合物进行定量。

1.3.4 DNA提取与宏基因组测序及分析

将第0天采集的各组样品混合为D0，并将发酵过程中不同组的平行样品分别混合，最终获得7个样品，分别进行DNA提取和宏基因组测序。根据DNA提取试剂盒说明书提取曲坯样品中微生物总DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，使用超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度。将符合上机要求的DNA样品寄送至上海美吉生物医药科技有限公司，使用NovaSeq 6000平台进行宏基因组测序。所有原始数据均使用SOAPnuke v.1.5.2进行修剪[10]。使用SOAP2软件将修剪后的读数映射到宿主基因组，以识别和移除宿主衍生读数[11]。使用MEGAHIT v1.2.9对高质量读数进行从头组装[12]。使用MetaGeneMarker v2.10对等位基因进行预测[13]。使用CD-HIT去除冗余基因，同一性截止值为95%[14]。使用DIAMOND将基因的蛋白质序列与NR数据库进行比对[15]。根据MEGAN LCA算法分配分类注释[16]。蛋白质序列使用DIAMOND进行比对。使用Bowtie 2按默认设置将读数与基因进行比对[17]。本研究基于美吉云分析平台（https://cloud.majorbio.com/）完成上述分析和作图。

1.4 数据处理

使用GraphPad Prism 9和SPSS软件进行统计分析。采用方差分析计算P值。使用GraphPad Prism 9和R软件（v3.4.1）对数据进行可视化。理化指标或挥发性物质与微生物相对丰度之间的相关性采用Spearman相关分析法进行评估。

2 结果与分析

2.1 鲜坯初始含水量对发酵活跃期传统酱香型大曲理化性质的影响

如表1所示，不同初始含水量的鲜坯在发酵过程中表现出各异的理化性质变化趋势。在第0天时，各组大曲鲜坯的水分呈现梯度分布，符合实验设定的初始条件。随着发酵的进行，各组曲坯含水量均出现显著降低。在第8天时，低、中、高水分组曲坯水分质量分数分别为（35.63±1.27）%、（37.00±1.20）%、（38.79±0.38）%。这可能是由于堆放过程中温度迅速升高，水分迅速流失，且曲房环境干燥通风造成的[18-19]。在第16天时，低、中、高水分组曲坯水分质量分数分别降至（34.92±1.42）%、（33.78±1.08）%、（29.75±2.76）%，其中低水分组含水量反而显著高于其他2组（P＜0.05）。这一现象可能是由于低水分组初始水分含量过低，抑制了微生物的生长繁殖，从而减缓了发酵进程，减少了热量产生，最终导致曲坯含水量下降较慢[20]。

不同的初始含水量未对发酵曲坯的酸度造成显著影响（P＞0.05），经过16 d的发酵，各组曲坯的酸度均出现显著上升（P＜0.05）。在发酵前8天，水分高且温度适宜，产生大量微生物，此时伴随着产酸菌的迅速繁殖，代谢产生酸类物质，使酸度迅速增加。适宜的酸度不仅有助于抑制杂菌的生长，还为酯类物质的合成提供必要前体，创造有利于其他微生物正常生长的环境[21]。从第8天到第16天，随着发酵温度的不断升高，低水分组曲坯的酸度出现小幅度下降，这可能是由于曲坯中水分大量挥发导致微生物代谢活动减弱，同时温度升高引起不耐热的微生物大量死亡所致[6]。

在发酵过程中，各组曲坯中的淀粉含量先快速降低后趋于稳定。低水分组的淀粉质量分数从（73.82±0.46）%降至（67.16±2.26）%；中水分组从（74.51±0.36）%降至（67.83±1.33）%；高水分组从（72.94±0.50）%降至（65.93±1.26）%。这可能是由于发酵前期，微生物生长代谢旺盛，快速消耗淀粉转化为还原糖。而发酵后期，随着大曲品温升高，酵母菌逐渐减少，可能导致液化酶等水解酶系活力降低，使得淀粉利用度降低[22]。

经过16 d的发酵，3组还原糖含量均出现显著升高（P＜0.05），表明大曲具有较高的糖化能力，可有效分解淀粉产生还原糖。入房时温度较低，霉菌等微生物生长代谢快，糖化力较高，第一次翻曲后温度快速上升，霉菌数量减少，糖化力显著降低。在第16天时，各组曲坯中的还原糖含量未出现显著差异（P＞0.05）。这说明在发酵过程中，不同含水量曲坯中微生物对淀粉的分解利用效率相似。

2.2 鲜坯初始含水量对发酵活跃期传统酱香型大曲挥发性物质的影响

采用HS-SPME-GC-MS从各组曲坯中共鉴定出134种挥发性物质，包括36种醇类、32种酯类、19种酮类、18种醛类、16种酸类、8种含氮类和5种酚类化合物（图1a）。经过2次翻曲操作后，各组曲坯挥发性物质种类均呈现出上升趋势，且中、高水分组曲坯挥发性物质种类比低水分组更加丰富（低水分组：76种；中水分组：83种；高水分组：87种），分别较0 d增加47、54、52种（图1b）。

如图2所示，随着发酵的进行，各组挥发性物质含量呈现上升趋势，其中低水分组由534.30 μg/g升至786.13 μg/g，增长251.83 μg/g；中水分组由517.36 μg/g升至884.91 μg/g，增长367.55 μg/g；高水分组由625.38 μg/g升至880.12 μg/g，增长254.74 μg/g。Deng Yuke等[23]的研究结果与本研究结果一致，在浓香型大曲发酵过程中，大曲中的102种挥发性物质的总含量呈现上升趋势。本研究检出挥发性物质，醇类物质种类最丰富且含量最高，其中含量排名前5的醇类物质分别是正己醇、2,6-二甲基-4-庚醇、苯乙醇、糠醇和异戊醇。醇类是酯类的前体物质，能够赋予白酒花香特征[24]。正己醇可为白酒带来果香、青草香[25]。2,6-二甲基-4-庚醇具有强烈的薰衣草香、木香[26]。苯乙醇是酱香型大曲中的主要醇类物质之一，具有玫瑰样花香[27]。糠醇是糠醛的衍生物，在酱香型白酒中呈现出焦糖香气[28]。异戊醇则具有发酵香、果香、酒香[25]。中、高水分组的曲坯中正己醇、2,6-二甲基-4-庚醇、苯乙醇和异戊醇等醇类化合物含量均高于低水分组。

低水分组曲坯挥发性物质总含量为786.13 μg/g，其醇类和酮类化合物含量在3组大曲中均为最高。醇类对赋予白酒绵柔口感具有重要意义[29]。酮类等含有羰基的化合物能够赋予酒体刺激感和辛辣感，还具有助香和提香的作用[30]。中水分组曲坯挥发性物质总含量为884.91 μg/g，醛类和酚类化合物的含量高于其他2组。醛类化合物是缩醛类的前体，主要表现为典型的草油、苦杏仁等复合香气，可使白酒更加飘逸，赋予白酒清香柔和之感[31]。如苯乙醛因其玫瑰香和花香特征成为酱香型大曲的关键香气成分。高水分组曲坯挥发性物质总含量为880.12 μg/g，酯类、酸类和含氮类化合物含量在3组中最高。大部分酯类成分都具有较强花果香气，己酸乙酯、丁酸乙酯等酯类成分能通过香气与味觉的交互作用增强甜味感知[32]。适量的酸类化合物对提升酒体的丰满度和馥郁感至关重要，己酸、戊酸、异戊酸已被证实为高温大曲中的重要挥发性成分[33]。含氮类化合物是大曲发酵中最主要的一类挥发性化合物，三甲基吡嗪具有焙烤、焦香、咖啡等香气特征，四甲基吡嗪又称川芎嗪，是酱香型白酒中的重要风味物质[34]。

综上所述，曲坯含水量会影响挥发性物质形成，是塑造酱香型白酒独特风味的关键条件，曲坯水分的升高可能有利于挥发性物质形成。

2.3 鲜坯初始含水量对发酵活跃期传统酱香型大曲菌群结构的影响

宏基因组测序共获得1 995 929 676条Reads，经过质控后，共获得1 918 981 786条高质量Clean Reads。利用MEGAHIT v1.2.9组装获得≥300 bp的Contigs共1 883 417条。对组装结果中的Contigs进行开放阅读框（open reading frame，ORF）预测，共预测得1 931 673个ORF，通过CD-HIT软件聚类分析，构建了一个包含2 298 726个非冗余基因的基因集。

曲坯微生物群落的α-多样性指数如表2所示，入房前曲坯（D0）Simpson指数和Shannon指数分别为0.062和3.84。随着曲坯发酵的进行，在第8天时，低、中和高水分组Simpson指数分别为0.076、0.120和0.510，Shannon指数分别为3.52、3.20和1.86。在第16天时，低、中和高水分组Simpson指数分别为0.044、0.150和0.065，Shannon指数分别为4.52、3.61和3.97。由此可见，在发酵过程中，微生物多样性呈现先降低后上升的趋势。这可能归因于发酵初期曲坯温度迅速升高，导致细菌丰富度和多样性降低。而发酵后期，随着嗜热菌属等耐高温菌群的活跃增殖，微生物多样性逐渐增长[35]。此外，曲坯含水量的增加也可能在一定程度上限制了微生物的繁殖与适应性，从而导致发酵后期中、高水分组中微生物多样性低于低水分组。

基于Bray-Curtis距离矩阵，对酱香型曲坯样本进行主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA），如图3 所示，不同含水量的曲坯在第8天和第16天时的微生物组成明显分离；而同一时间点，尽管曲坯含水量不同，其微生物群落结构仍表现出较高的相似性。这说明发酵时间是影响曲坯中微生物群落组成的主导因素。在发酵后期，与低水分组相比，中、高水分组的曲坯更倾向于聚到一起。

在种水平上分析各组中共有和特有微生物种类。如图4所示，所有样品中共鉴定出1 772个种。在曲坯发酵过程中，不同时间段间存在大量的特有微生物种类。此外，不同含水量的曲坯相比，低水分组的特有微生物种类较多，而中、高水分组的特有微生物种类较少。这表明随着曲坯含水量增加，水分对微生物组成的影响逐渐减小，这与PCoA结果一致。

如图5a所示，从不同初始含水量传统酱香型大曲中共鉴定出32个门，D0主要优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria，55.85%）和厚壁菌门（Firmicutes，36.47%）。这与Li Pan等[36]的研究结果类似：在发酵开始后，Firmicutes成为绝对优势菌门，其相对丰度达到约90%。孟镇等[37]对湖南地区酱香型白酒各轮次酒醅发酵样品进行检测，共检出25个菌门，其中Firmicutes为第一优势菌门，相对丰度在86.70%～98.29%，其次是Proteobacteria，相对丰度为1.51%～10.86%。这可能是由于Firmicutes含有大量厌氧细菌，可适应高酸、缺氧等极端环境。此外，随着曲坯中含水量的增加。Firmicutes和放线菌门（Actinomycetota）相对丰度呈现上升趋势。已经有研究表明，Actinomycetota在酯类、吡嗪类等风味化合物的合成过程中发挥着重要作用[38]。这提示，较高的含水量可能有利于曲坯中挥发性物质的产生。

如图5b所示，从不同初始含水量传统酱香型大曲中共鉴定出604个属，嗜热放线菌属（Thermoactinomyces）、魏斯氏菌属（Weissella）和芽孢杆菌属（Bacillus）在发酵前期占据主要地位。随着发酵的进行，嗜热芽孢杆菌属（Caldibacillus）相对丰度明显升高，Weissella相对丰度下降显著。这可能是由于曲坯发酵过程中温度逐渐升高，使得具有耐热或嗜热的生理特性的微生物发生富集[39]。这说明曲坯的菌群组成受高温等环境因素影响。在第8天时，在低水分组中，Weissella（31.22%）和Thermoactinomyces（17.31%）相对丰度较高。在中水分组中，Thermoactinomyces相对丰度高达53.68%，但Weissella相对丰度却仅有7.03%。而在高水分组中，Bacillus（71.64%）则是绝对优势菌株。Thermoactinomyces对高温、潮湿等环境具有较强的抵抗力，能产生多种耐热酶，如α-淀粉酶、丝氨酸蛋白酶和脂肪酶，是酱香型白酒特征风味化合物的重要贡献者[40]。Bacillus具有的耐热特性使得其在发酵过程中能够占主导地位[41]，并通过分泌多种水解酶，生成如吡嗪类、酸类等风味物质，是产酱香风味的重要贡献菌株[42]。在第16天时，低水分组Caldibacillus（14.89%）、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）（13.82%）、克罗彭斯特德菌属（Kroppenstedtia）（13.63%）和Bacilus（6.42%）是主要优势菌属。值得注意的是，在中、高水分组中Caldibacillus则分别占到49.03%和47.39%，远高于低水分组。已有研究证实，Virgibacillus能够促进吡嗪类化合物生成[43]。Zhu Chutian等[44]研究报道，Kroppenstedtia与萜烯类风味化合物及多种氨基酸的合成呈正相关。以上结果提示，曲坯含水量可能通过改变微生物组成影响挥发性物质产生。

如图5c所示，发酵过程显著改变了大曲的菌群结构。在D0样品中，奇异变形菌（Proteus mirabilis）、艰难梭菌（Clostridioides difficile）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）等相对丰度较高。而Thermoactinomyces、Bacillus、热淀粉芽孢杆菌属（Caldibacillus）等相对丰度较低。随着发酵的进行，到第8天时，融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）和发酵黏液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）等乳酸菌成为优势菌种，且在低水分组中的相对丰度高于中、高水分组。中水分组的优势菌群为Thermoactinomyces，如普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）和大曲高温放线菌（Thermoactinomyces daqus）。史密斯芽孢杆菌（Bacillus smithii）和黄热厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus flavithermus）等耐热芽孢杆菌在高水分组中相对丰度显著上升，这可能是由于发酵过程中温度逐渐升高，推动菌群演替造成的[45]。有研究表明，在大曲发酵过程中，Weissella和黏液乳杆菌属（Limosilactobacillus）的代谢活动可产生大量乳酸、乙酸等有机酸，导致pH值在发酵初期快速下降，这有助于微生物群落进行自我驯化，抑制致病菌的生长[46]。在第16天时，Caldibacillus如帕辛勒热芽孢杆菌（Caldibacillus pasinlerensis）、嗜热淀粉芽孢杆菌（Caldibacillus thermoamylovorans）成为主要的优势菌群。在低水分组中Kroppenstedtia中象牙色克罗彭施泰特氏菌（Kroppenstedtia eburnea）、广州克罗彭施泰特氏菌（Kroppenstedtia guangzhouensis）相对丰度升高，而在中、高水分组中相对丰度下降。高水分组中Thermoactinomyces相对丰度高于其他2组。

曲坯中微生物群落具有高度的多样性与复杂性，其组成受环境与自身相互作用的共同驱动，最终在制曲过程中达到稳定[47]。对曲坯中微生物相对丰度进行Spearman相关性分析，如图6所示，变形菌属（Proteus）和耐碱芽孢杆菌属（Alkalihalobacillus）与其他16个属具有显著相关性。乳杆菌目（Lactobacillales）的Limosilactobacillus、片球菌属（Pediococcus）、乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）和Weissella之间也表现出显著正相关。这说明，同类种属的微生物间可以相互促进，形成共生微生物群落。综上所述，曲坯中微生物存在广泛的相关性，它们可能通过协同或拮抗等方式，共同推动并调控微生物群落结构的演替过程[48]。

2.4 传统酱香型大曲发酵活跃期微生物与理化性质相关性分析

曲坯的理化性质可能会影响微生物组成[49]，因此，基于Spearman相关系数进一步对优势菌属（相对丰度排名前50）与理化性质进行相关性分析。如图7所示，Weissella、明串珠菌属（Leuconostoc）、Pediococcus、乳酪杆菌属（Lacticaseibacillus）、Lactiplantibacillus和Limosilactobacillus等Lactobacillales的细菌与曲坯中还原糖含量和酸度呈正相关，而与淀粉含量呈负相关。一般认为，Lactobacillales是曲坯中主要产酸细菌，能够通过糖代谢生成有机酸，可为酯质合成提供前体物质[5]。Zhu Min等[35]研究发现，中高温大曲中与糖化和乙醇发酵相关的功能基因编码的酶可能主要来源于Weissella。这说明Lactobacillales的细菌在将淀粉分解代谢成酸和还原糖的过程中发挥重要作用。同时，酸度与希瓦氏菌属（Shewanella）、克雷伯菌属（Klebsiella）、假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）等杂菌的相对丰度呈显著负相关。综上所述，曲坯中的产酸菌能通过代谢淀粉生成乳酸等有机酸，同时抑制发酵过程中杂菌的生长。此外，这些有机酸也为后续酯质类风味物质的合成提供了重要前体，进而赋予白酒独特风格。霉菌属（Lichtheimia）、曲霉属（Aspergillus）、Virgibacillus、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、Kroppenstedtia与水分成负相关，说明过高的水分可能会抑制霉菌类微生物的生长繁殖，影响菌丝生长及曲坯升温。Virgibacillus、Oceanobacillus和Kroppenstedtia为高温大曲优势菌属，能耐受高温发酵，且为大曲提供特殊的风味物质[50]。因此。提供曲坯最佳的水分条件可有效调控大曲微生物的演替。

2.5 传统酱香型大曲发酵活跃期微生物与挥发性物质相关性分析

对优势菌属与主要挥发性物质（至少在3个样品中均被检出的挥发性物质）进行相关性分析。如图8所示，糖单孢菌属（Saccharomonospora）、喜热裂孢菌属（Thermobifida）、Weizmannia、Caldibacillus和厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）等与庚酸乙酯、己酸乙酯、辛酸己酯和三甲基吡嗪等含量呈正相关。温暖厌氧杆菌属（Tepidanaerobacter）、地芽孢杆菌属（Geobacillus）和大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）等与2-庚醇、戊酸乙酯含量成正相关。已经有研究报道，芽孢杆菌具有分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和葡萄糖淀粉酶能力，能够快速将原料中的碳水化合物转化为醇类、酯类及多种有机酸，在风味形成中起着关键作用[51]。以上结果表明，不同属的细菌在挥发性物质的产生过程中发挥着不同的作用。酱香型大曲中丰富的微生物种类通过复杂的代谢途径与相互作用共同塑造其独特而复杂的风味特征。

3 结论

本研究通过测定酱香型大曲的理化性质和挥发性物质含量，结合宏基因组测序，揭示含水量对曲坯发酵效果的影响。结果表明，含水量会影响曲坯的理化性质。随着发酵的进行，曲坯挥发性物质的种类数量呈现上升趋势（低水分组：增加47种；中水分组：增加54种；高水分组：增加52种）。值得注意的是，在同一时间点，中、高水分组中的挥发性物质的种类数量高于低水分组。宏基因组测序结果表明，在发酵过程中，微生物多样性呈现出先下降后上升的趋势，且不同时间点的微生物群落结构明显不同。曲坯的含水量升高会略微降低微生物多样性，但对微生物群落结构的影响较小。相关性分析结果显示，曲坯中的微生物通过复杂的相互作用共同推动微生物群落的演替，Proteus、Alkalihalobacillus和Lactobacillales在其中发挥重要作用。本研究还发现，相较于低水分组（增长251.83 μg/g），中水分组（增长367.55 μg/g）与高水分组（增长254.74 μg/g）中挥发性物质含量随发酵时间显示出更高的增长幅度，同时，曲坯微生物组成与理化性质和挥发性物质含量间存在显著相关性，这表明微生物可能通过复杂的代谢活动将淀粉等碳水化合物转化成为丰富的挥发性物质，赋予酱香型大曲独特的风味。综上所述，本研究揭示了曲坯含水量通过调控理化性质和微生物群落组成影响大曲发酵效果，提高鲜坯含水量可能有利于挥发性物质的形成，阐明了曲坯发酵过程中微生物群落的演替规律，为生产高质量酱香型大曲提供了理论基础。

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