Screening, Identification and Fermentation Characteristics of High Glucoamylase-Producing Rhizopus Strain
WU Yue, LI Yuan, ZHANG Ruijing, et al. Screening, identification and fermentation characteristics of high glucoamylaseproducing Rhizopus strain[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 59-66. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.009. http://www.chinabrewing.net.cn
传统甜酒曲以大米等谷物为主要基质，通过自然接种、环境筛选等方式富集了霉菌、酵母菌等多种微生物[1]。在这个典型的自然多菌种共发酵体系中，微生物群落结构与酶系代谢功能存在紧密的协同关系：体系中的根霉在生长过程中大量分泌淀粉酶和糖化酶，将谷物基质中的大分子淀粉降解为小分子可发酵糖（如葡萄糖）；随后，酵母菌群以此为碳源进行发酵代谢及风味物质合成[2]。微生物产酶与酶促底物降解的协同作用直接影响米酒发酵速率、原料利用率及成品风味特征[3-4]，赋予传统米酒醇厚丰满的口感。
针对传统酒曲品质不稳定的局限性，从自然生态体系中挖掘并应用核心功能微生物已成为产业升级的关键。近年来，唐洁等[5]对米根霉发酵条件进行优化，麸曲糖化力达33.97%；王瑞鑫等[6]在糖化阶段添加根霉曲，可使基酒中的乙酸乙酯含量提升67.84%。南小华等[7]从米酒酒曲中筛选根霉并进行米酒发酵，所得产品中γ-氨基丁酸含量较高（73.75 mg/kg），感官品质较好。以上研究表明，根霉在米酒发酵中发挥关键作用。然而，不同产地、批次酒曲中的根霉种类及代谢能力存在差异，影响糖化能力及出酒率的稳定性。目前，鲜见关于从传统酒曲中筛选本土优良根霉的系统研究报道[8-9]。
基于此，本研究以传统甜酒曲为试材，以透明圈法和固态发酵实验筛选高产糖化酶的优良菌株，评估其环境耐受性，并进行发酵性能分析，旨在挖掘与保护传统微生物资源，为开发兼具高糖化力与优良发酵风味的纯种酒曲提供理论与技术支撑。
米根霉Q303菌株 中国工业微生物菌种保藏管理中心。
籼米米粉、糯米 市购；传统甜酒曲样品15份，7份取自酒曲酿造企业（湖北3份、江苏2份、四川1份、江西1份）、8份农户传统自制样品取自传统制曲农户的手工酒曲（湖北3份、湖南2份、四川2份、江西1份）。所有样品均在制曲成熟后收集。实地采集采用多点混合取样法，市售样品选取同批次混合取样，每份取样量均为200 g。取样后立即密封于自封袋中，清晰标记后置于4 ℃贮藏备用。
乙酸正戊酯标准品（色谱纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；DL-乳酸 上海麦克林生化科技股份有限公司；无水葡萄糖、可溶性淀粉、冰乙酸、无水乙酸钠、硫酸铜、氢氧化钠、氯化钠、酒石酸钾钠、碘、碘化钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar， PDA）培养基 青岛海博生物技术有限公司；真菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司。
淀粉筛选培养基[10]：可溶性淀粉0.2 g、氯化钠0.5 g、牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、琼脂粉2.0 g、加纯水定容至100 mL，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
LRH-250A恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-75SH高温高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；HH-4恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；TG16-WS高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；FA2204B分析天平 上海精科天美科学仪器有限公司；5977B-7890B气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）仪 美国Agilent公司；GeneAmp 9700聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司。
1.3.1 产糖化酶根霉的分离与纯化
将酒曲粉碎至细粉状（过40目筛）后，取10 g样品加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，加入适量玻璃珠于150 r/min振荡10 min后进行梯度稀释，取10-3、10-4、10-5稀释液涂布于PDA培养基，30 ℃培养24 h后，挑选菌落形态典型的单菌落：菌落生长迅速，初期呈白色疏松的棉絮状或蜘蛛网状，气生菌丝发达，蔓延性极强，后期随着孢子囊的成熟，菌落表面逐渐呈现灰黑色或黑褐色斑点。初步筛选疑似根霉的单菌落转接至PDA培养基，30 ℃培养24 h，经反复划线纯化后于4 ℃斜面保存。
1.3.2 产糖化酶根霉的筛选
1.3.2.1 初筛
将纯化后的菌株点接于淀粉筛选培养基，30 ℃恒温培养36 h，向平板内倒入适量卢戈氏碘液浸没培养基表面，反应1～2 min后弃去多余碘液。分别测量透明圈直径（D）与菌落直径（d），以D/d值表征水解能力，根据D/d值初步筛选产糖化酶能力较强的菌株。 D/d值越大表明菌株对大分子淀粉的整体切割与利用效率越高[11]。
1.3.2.2 复筛
取100 g糯米，经纯水清洗、去杂后加入100 mL蒸馏水，115 ℃灭菌20 min，待冷却至30 ℃左右加入1%（V/V） 筛选菌株孢子悬液（105 CFU/mL），充分拌匀，30 ℃恒温培养24 h后，加入100 mL无菌水充分搅拌混匀继续培养24 h。培养结束后，将发酵醪液经4～6层纱布过滤后8 000 r/min离心10 min，取上清液，测定其还原糖含量。还原糖含量越高，表明该菌株在发酵过程中分泌的糖化酶活力越高，反之则越低[12]。
1.3.3 筛选菌株的鉴定
1.3.3.1 形态学观察
将纯化后的目的菌株点接于PDA平板中央，30 ℃倒置培养3 d，定时观察并记录菌落的生长速率、质地（如棉絮状等）、边缘特征及正反面颜色变化。挑取少量带有成熟孢子的气生菌丝于载玻片上，轻微拨散后盖上盖玻片。置于光学显微镜下，观察菌丝有无横隔、孢子囊及孢囊孢子形态，并观察是否具有根霉属关键分类特征：假根和匍匐菌丝[13]。
1.3.3.2 分子生物学鉴定
取PDA培养3 d的新鲜菌丝，液氮研磨破壁后，采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。以ITS1/ITS4通用引物进行PCR扩增。PCR扩增体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，以ddH2O补足体积。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳（120 V、30 min）检测，合格产物送交昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司进行Sanger双向测序。
测序结果利用SeqMan软件进行序列拼接与校正，随后在NCBI中采用BLAST进行同源性搜索，得到与待测物种序列相似性最大的同源序列，采用MEGA 11.0软件的邻接法构建系统发育树，并设定Bootstrap值为1 000次重复，以评估各分支节点的置信度。
1.3.4 筛选菌株的耐受性分析
为评价菌株在发酵环境中的稳定性，考察其对乳酸、乙醇、葡萄糖及NaCl的耐受性。将浓度为105 CFU/mL 的孢子悬液分别接种于含有不同乳酸体积分数（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）、不同乙醇体积分数（1%、2%、3%、4%）、不同葡萄糖质量分数（5%、10%、15%、20%、25%）及不同NaCl质量分数（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）的PDA液体培养基中，分别以未添加乳酸、乙醇、葡萄糖和NaCl的培养基培养孢子悬液为对照，30 ℃、120 r/min振荡培养2 d。培养结束后，将预先烘干至恒质量的定量滤纸置于布氏漏斗中，对发酵液进行真空抽滤。抽滤过程中用适量无菌水洗涤菌丝体2～3次，以充分洗去附着在菌丝表面的残留培养基成分。将收集到菌丝体的滤纸连同菌丝置于80 ℃烘箱中烘干至恒质量，采用差重法，按下式计算菌丝相对生物量[14]：
1.3.5 纯种根霉曲制曲工艺优化
准确称取40 g籼米米粉，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。待其冷却至30 ℃左右接种105 CFU/mL根霉孢子悬液，搅拌均匀后置于恒温培养箱中30 ℃培养60 h。培养结束后，将成曲于40～45 ℃烘箱中低温烘干至恒质量。采用单因素轮换法分别考察不同培养温度（28、30、32、34、36 ℃）、不同培养时间（24、36、48、60、72、84 h）及不同基质水分质量分数（20%、25%、30%、35%、40%）对成曲糖化力和液化力的影响。
1.3.6 纯种根霉曲发酵性能分析
糯米经8 h浸泡、蒸煮、冷却后，按原料质量0.8%接入菌株A2、Q303制备的根霉曲，同时添加50%（以糯米质量计）的纯水，30 ℃恒温发酵72 h，每隔12 h取样，测定发酵液的糖化力、液化力、总酸及还原糖含量；每隔24 h取样，测定挥发性风味物质。
1.3.6.1 理化指标检测
参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》测定糖化力、液化力；参考GB/T 13662—2018《黄酒》测定总酸、还原糖。
1.3.6.2 挥发性风味物质检测
顶空固相微萃取条件：准确量取6 mL样品置于30 mL顶空瓶中，加入3.0 g NaCl及磁力搅拌转子，随后加入内标乙酸正戊酯（88 mg/L）。密封后，50 ℃、450 r/min恒温磁力搅拌平衡10 min。随后插入装有萃取纤维的手柄，推出纤维头顶空吸附40 min。萃取结束后，取出萃取头并立即插入GC进样口解 吸2 min。
GC条件：DB-WAX石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温条件为初始温度45 ℃保持1.5 min，以6 ℃/min升至85 ℃，再以4 ℃/min升至225 ℃，225 ℃保持15 min；载气为高纯度氦气（99.999%）；采用不分流进样模式，载气流速保持0.7 mL/min。
MS条件：采用电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线（接口）温度250 ℃；溶剂延迟时间3 min；质量扫描范围m/z 35～400。
定量分析：采用内标法定量。根据样品中各挥发性化合物的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积之比，结合内标物质量浓度计算各挥发性风味物质含量。
实验数据采用Excel 2020进行初步整理，利用SPSS 24.0软件进行统计学分析：采用单因素方差分析结合多重比较法进行组间差异显著性检验（显著性水平设为P＜0.05），使用Origin 2021及Adobe Illustrator 2020软件绘图。
2.1.1 菌株的分离
从15份传统甜酒曲样品中分离出若干株菌落形态存在差异的菌株，其中12株疑似根霉菌株。挑选蔓延生长迅速、气生菌丝发达、呈蓬松絮状且菌落颜色由初期的纯白色逐渐向灰黑色（或褐黑色）过渡的单菌落，初步筛选得到疑似根霉的单菌落。
2.1.2 菌株的初筛
由图1可知，在分离得到的12株菌株中，共有8株菌株（A1、A2、A4、B1、B2、B3、C2、C3）的D/d值超过1.5，产糖化酶能力较强。其中，菌株A2表现出的产糖化酶能力最强，D/d值高达1.92，显著优于其他菌株；菌株A1 D/d值为1.78；而菌株A3、B4、C1和C4的产糖化酶活力相对较弱，D/d值均低于1.5。基于初筛结果，本研究选取D/d值超过1.5的8株初筛菌株进行复筛。
图1 菌株透明圈实验结果
Fig.1 Results of the strain transparent halo assay
2.1.3 菌株的复筛
在初筛基础上，本研究选取8株产酶潜力较大的菌株进行复筛，测定48 h发酵液中的还原糖含量。如图2所示，不同菌株的糖化能力差异明显。菌株A2产糖化酶能力最强，其发酵液中还原糖质量浓度高达91.86 g/L，显著高于其他菌株（P＜0.05），表明该菌株具有极高的糖化能力。菌株A1与B2的产糖化酶活力较强，发酵液中还原糖质量浓度分别为83.22 g/L和80.47 g/L，均显著高于其他菌株（P＜0.05）。菌株C3发酵液中的还原糖质量浓度最低（35 g/L），说明其糖化能力较弱。基于上述复筛结果，选择复筛菌株A2、A1和B2进行鉴定。
图2 不同菌株固态发酵上清液还原糖含量对比
Fig.2 Comparison of reducing sugar content in supernatants from solid-state fermentation by different strains
2.2.1 形态学观察
由图3A可知，3株菌均具有典型的根霉菌落形态特征，但差异明显。菌株A1的菌落主要呈灰白色，气生菌丝发达，但黑色孢子堆积较少且分布不均；菌株A2的气生菌丝生长迅速并覆盖整个平板，菌落表面呈现均匀致密的灰黑色，说明其孢子囊发育成熟，产孢能力强且生长周期短；菌株B2的菌落则被厚实的白色气生菌丝覆盖，质地湿润，仅在局部区域观察到聚集的黑色孢子，表明该菌株主要处于营养生长阶段，生殖生长（产孢）相对滞后。由图3B可知，3株菌具有典型的根霉显微结构：菌丝粗壮、无隔膜，顶端形成球形孢子囊，并由长而直的孢子囊梗支撑。菌株A1孢子囊呈球形，部分成熟破裂后释放出表面光滑的椭圆形孢囊孢子；菌株A2顶端孢子囊呈规则的球形或近球形，孢囊孢子形态均一、呈椭圆形且表面光滑；菌株B2的孢子囊孢子体积相对较小。综上，初步判断菌株A1、A2及B2均为根霉。
图3 筛选菌株的菌落形态（A）及显微结构（B）
Fig.3 Colony morphology(A) and microscopic structure(B) of the screened strains
2.2.2 分子生物学鉴定
由图4可知，菌株A1与少根根霉（OW987071.1 Rhizopus arrhizus）聚于同一分支，同源性高达99%；菌株A2与米根霉（HQ285718.1 Rhizopus oryzae）聚于同一分支，同源性为98%；菌株B2与小孢根霉（KF709998.1 Rhizopus microsporus）聚为一支，同源性达100%。结合形态学和分子生物学鉴定结果，最终将菌株A1鉴定为少根根霉（Rhizopus arrhizus），菌株A2鉴定为米根霉（Rhizopus oryzae），菌株B2鉴定为小孢根霉（Rhizopus microsporus）。
图4 基于菌株18S rDNA基因的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree based on the18S rDNA gene of the strains
由图5A可知，随着乙醇体积分数在0%～4%范围内的升高，菌株A1、A2和B2的相对生物量均呈显著下降趋势。乙醇体积分数为2%时，菌株A2相对生物量最高；当乙醇体积分数为4%时，菌株A1和B2的相对生物量均低于10%，而菌株A2相对生物量为18.5%。这表明菌株A2在高浓度乙醇环境下能更好地维持细胞膜完整性与基础代谢活性，有助于防止发酵后期的菌体自溶[15]。
图5 菌株对乙醇（A）、乳酸（B）、葡萄糖（C）及NaCl （D）的耐受性
Fig.5 Tolerance of the strains to ethanol(A),lactic acid(B),glucose(C),and sodium chloride(D)
由图5B可知，随着乳酸体积分数在0%～0.8%范围内的升高，菌株A1、A2和B2的相对生物量均呈下降趋势，但菌株间的耐受性存在差异。其中，菌株A1的生物量下降速率最快，而菌株A2和B2耐酸性较高。当乳酸体积数为0.8%时，3株菌均受到强烈抑制，相对生物量均降至10%左右。其中整体来看，菌株A2在乳酸积累的环境中具有更强的生长耐受性。
由图5C可知，随着葡萄糖添加量在0%～25%范围内升高，菌株的相对生物量先上升后下降；在葡萄糖添加量为5%时，可促进菌株生长。其中，菌株A2的相对生物量最高（153%），显著高于A1和B2。当葡萄糖添加量为20%时，菌株A2仍维持27.3%的相对生物量，显著优于A1和B2。这说明菌株A2兼具高效的底物利用能力与优异的抗高渗特性，能适应米酒发酵的高糖环境[16]。
由图5D可知，随着NaCl质量分数在0.5%～2.0%范围内增加，菌株A2相对生物量先升高后降低，但当NaCl质量分数在0.5%～1.0%范围内时，菌株A2相对生物量仍保持在100%以上；NaCl质量分数为1.5%时，菌株A2的相对生物量仍较高（48.6%）。
综上，菌株A2耐受性最好，可耐受乙醇体积分数4%、乳酸体积分数0.6%、葡萄糖质量分数20%和NaCl质量分数1.5%。
如图6A所示，随着培养温度在28～36 ℃范围内增加，糖化力与液化力均呈先升后降趋势；当培养温度为30 ℃时，糖化力与液化力均达到最高值，分别为530.3 mg/（h∙g）和0.667 g/（h∙g）。当温度低于30 ℃时，菌体生长缓慢，产糖化酶与液化酶不足；而当温度超过30 ℃时，糖化酶与液化酶活力显著衰退，其原因可能是高温抑制了菌体生长，导致产酶量下降[17]。因此，确定最佳培养温度为30 ℃。
图6 培养温度（A）、培养时间（B）及水分质量分数（C）对根霉曲糖化力和液化力的影响
Fig.6 Effects of culture temperature(A),culture time(B),and moisture content(C) on saccharifying power and liquefying power ofRhizopus Jiuqu
如图6B所示，随着培养时间在24～84 h范围内延长，糖化力与液化力均呈先上升后下降的趋势；当培养时间为60 h时，糖化力与液化力均达到最高值，分别为543.38 mg/（h∙g）和0.686 g/（h∙g）。当培养时间低于60 h时，菌丝体仍处于大量增殖的生长阶段，胞外酶积累尚不充分；当培养时间超过60 h，培养基营养物质耗尽，导致菌体自溶并释放蛋白酶，降解了已合成的糖化酶和淀粉酶[18]。因此，确定最佳培养时间为60 h。
如图6C所示，随着基质水分质量分数在20%～40%范围内增加，糖化力与液化力呈先上升后下降的趋势；当水分质量分数为30%和35%时，糖化力和液化力均处于较高水平且差异不显著（P＞0.05），当水分质量分数为35%时，糖化力与液化力最高，分别可达551.86 mg/（h∙g）和0.670 g/（h∙g）。当水分质量分数低于30%时，水分不足限制了物料中营养物质的传输与微生物的代谢，导致产酶水平较低；而当水分质量分数超过35%时，过量的水分导致基质粘结，孔隙度降低，限制了氧气供应，进而抑制了好氧根霉的呼吸代谢与产酶[19]。研究表明，优良根霉B1和B2的糖化力最高分别为162 mg/（h∙g）和130 mg/（h∙g）[20]，低于本研究根霉曲糖化力，提示本研究筛选获得的菌株具有较强的淀粉降解能力，在糖化工艺中可能具备更优的应用潜力。因此，确定最佳水分质量分数为35%。
由图7A、B可知，随着发酵的进行，2种根霉曲糖化力和液化力均呈先上升后下降的趋势，菌株Q303根霉曲的糖化力和液化力分别在发酵36 h和48 h达到最高值，分别为476.7 mg/（h∙g）和0.356 g/（h∙g）；菌株A2根霉曲在发酵48 h时两者均达到最高值，分别达到506.0 mg/（h∙g）和0.418 g/（h∙g），较菌株Q303根霉曲分别提升6.2%和17.4%。这表明菌株A2在发酵中期具有更强的淀粉液化能力，有利于底物的初步降解[21]。
图7 2种根霉曲在发酵过程中理化指标变化
Fig.7 Changes in physicochemicalindexes of two kinds ofRhizopus Jiuqu during the fermentation
由图7C、D可知，随着发酵的进行，2种根霉曲总酸与还原糖含量整体呈先上升后下降的趋势。菌株A2根霉曲的总酸质量浓度在发酵48 h达到最高，发酵至72 h时降低至3.13 g/L；菌株Q303根霉曲的总酸质量浓度在发酵36 h达到最高值（3.76 g/L）。其原因可能是，发酵后期酸类物质大量转化为酯类风味物质，有效减弱了酒体的酸涩感[22]。菌株Q303、A2根霉曲的还原糖质量浓度均于48 h达到最高值，分别为316.7、333.66 g/L，菌株A2根霉曲发酵液还原糖含量提高5.36%，其原因可能是，根霉在发酵前期可分泌大量游离糖化酶，在致密的糖分子网络中产生了底物保护效应[23-24]。综上，菌株A2发酵性能良好。
菌株A2、Q303根霉曲发酵过程中挥发性风味物质含量变化见表1。共检出28种挥发性风味物质，包括醇类10种、酯类8种、酸类5种、醛类4种及酮类1种。随着发酵时间的延长，2种根霉曲产生的挥发性风味物质总质量浓度均呈上升趋势，戊酸乙酯仅在菌株A2根霉曲发酵72 h检出（0.012 0 mg/L），赋予发酵液果香风味[25]。2种根霉曲的醇类物质含量均在72 h达到最高。苯乙醇是米酒的特征芳香成分，其在菌株A2根霉曲发酵液中的质量浓度（4.306 5 mg/L）高于菌株Q303（3.964 8 mg/L）， 赋予米酒典型的甜润感和优雅的花香[26]。菌株A2根霉曲发酵液酯类物质的质量浓度在48 h即达到最高值（0.362 8 mg/L），菌株Q303根霉曲发酵液的酯类物质在发酵72 h含量最高。因此，菌株A2有利于缩短发酵周期并获得浓郁的酯香[27]。
表1 根霉曲发酵液挥发性风味物质含量变化
Table1 Changes in contents of volatileflavor compounds in fermentation broth ofRhizopus Jiuqu
mg/L序号种类化合物保留时间/3异戊醇7.925 80.582 90.802 11.755 60.704 1—2.256 76蘑菇醇14.376 50.056 20.018 60.024 20.040 10.020 4—醇类10表蓝桉醇39.943 20.009 70.017 10.021 20.009 5——13壬酸乙酯16.832 2—0.010 3—0.006 70.008 1—酯类乙酯25.219 4—0.020 2——0.006 9—19乙酸14.187 30.021 50.005 20.028 0—0.005 80.054 622己酸26.276 5—0.006 6——0.004 6—23辛酸33.049 8—0.061 40.024 2—0.029 00.060 024羟基丙酮10.060 10.018 4————0.147 125癸醛15.759 3—0.014 6—0.005 60.012 5—27苯甲醛16.180 90.005 5——0.015 00.005 8—醛酮类糠醛44.826 70.084 70.017 30.030 40.006 70.017 20.098 7小计0.205 80.050 90.056 80.027 30.051 50.601 0菌株A2菌株Q303 min24 h48 h72 h24 h48 h72 h 1乙醇1.570 50.069 30.086 70.288 10.253 00.252 00.278 92异丁醇4.920 70.042 30.072 90.228 20.057 30.066 10.134 04正戊醇8.943 40.005 3——0.011 9——5正己醇11.687 60.055 2—0.052 10.067 00.031 6—72,3-丁二醇17.926 00.006 20.008 00.065 20.003 80.007 1—8苯乙醇28.241 10.135 70.747 34.306 50.156 70.480 93.964 89苯甲醇27.119 40.008 70.008 4—0.006 30.007 9—小计0.971 51.761 16.741 11.309 70.866 06.634 411己酸乙酯8.511 50.001 90.022 80.032 5—0.011 0—12辛酸乙酯13.959 30.003 30.138 50.069 10.003 80.055 70.114 414癸酸乙酯19.919 4—0.127 70.090 7—0.062 00.112 215戊酸乙酯22.839 1——0.012 0———162-苯基乙酸17月桂酸乙酯26.416 6—0.040 7—0.004 60.014 90.021 918棕榈酸乙酯39.195 5—0.002 60.001 60.002 8—0.102 2小计0.005 20.362 80.205 90.017 90.158 60.350 720正丁酸19.409 9——0.009 60.003 20.003 1—21酸类正癸酸23.824 3—0.017 1——0.009 90.090 8小计0.021 50.090 30.061 80.003 20.052 40.205 426糠醛14.513 60.097 20.019 00.026 4—0.016 00.355 2285-羟甲基总计1.204 02.265 17.065 61.358 11.128 57.791 5
注：—.未检出。
菌株A2根霉曲发酵液的酸类物质含量呈先升后降趋势，避免了发酵后期可能存在的酸涩口感。其原因可能是，菌株A2将大量游离有机酸作为底物转化为酯类物质。菌株Q303在发酵72 h时，糠醛和羟基丙酮质量浓度较高（0.355 2、0.147 1 mg/L），易带来粗糙的焦苦味[28]。菌株A2根霉曲在发酵过程中的糠醛含量始终维持在极低水平，表明该菌株抗逆性强，在发酵后期依然保持健康的细胞状态和高度有序的代谢流，从而保证酒体的纯净清爽[29]。因此，菌株A2可有效调控有机酸代谢，减少后期酸涩感，同时促进有机酸向风味酯类转化，丰富酒体香气。
针对传统甜酒曲糖化力不稳定及生产标准化程度低的问题，本研究从传统酒曲中成功筛选出1株高产糖化酶的米根霉A2，其最佳工艺条件为：培养温度30 ℃、培养时间60 h、水分质量分数35%。与菌株Q303相比，菌株A2糖化力与液化力分别提升6.2%和17.4%，其发酵液还原糖含量提高5.36%。菌株A2根霉曲发酵液中苯乙醇含量增加，且能够快速合成辛酸乙酯、癸酸乙酯等果香型酯类物质，减少致苦物质（糠醛）生成，有助于提升米酒醇厚协调的感官品质。本研究目前仍处于实验室小试阶段，且采用单一菌种发酵模式，而传统米酒酿造本质上是一个多菌种协同作用的复杂过程。因此，上述结论在实际生产中的适用性，尚需在更接近真实酿造环境的多菌种体系及规模化放大试验中进一步验证。后续研究将聚焦于多菌种协同发酵技术的构建与产业化工艺的优化，力求为标准化复合酒曲的开发提供更坚实的技术基础，从而推动传统米酒酿造行业的标准化与现代化升级。
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