表1 酯化条件优化响应面试验因素与水平
Table1 Factors and levels of response surface test for esterification condition optimization
因素-101 A反应温度/℃303540 B反应pH4.04.55.0 C乙醇体积分数/%152025
MA Yue, DUAN Xiyu, LIU Xiaoguang, et al. Screening, identification, esterification condition optimization and application of esterase-producing Bacillus strains[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 51-58. (in Chinese with English abstract)DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.008. http://www.chinabrewing.net.cn
Screening, Identification, Esterification Condition Optimization and Application of Esterase-Producing Bacillus Strains
黄水（又名黄浆水）是白酒固态发酵过程中，酒曲微生物分解原料大分子物质，伴随过饱和水分下渗窖底形成的棕黄色副产物[1]。其产量巨大，不仅会大幅增加企业污水处理成本，未经处理直接排放还会造成严重的环境污染与资源浪费。黄水富含淀粉、还原糖、有机酸及醇类等风味前体物质，同时蕴藏着经长期驯化、适应高酸高乙醇环境的功能微生物资源，是实现副产物资源化利用的天然载体。
酯化酶可催化不同底物的裂解反应和酯键生成[2-3]，是催化酸醇合成酯类物质的核心功能酶，直接影响白酒主体风味物质的生成与酒体品质提升，是实现黄水资源化、无害化的关键工具。目前白酒领域对产酯化酶微生物的研究多聚焦于酵母菌[4-5]与霉菌[6-7]等真菌类群，如异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、总状横梗霉（Lichtheimia ramosa）等[8-10]，其虽有一定的产酶能力，但在黄水高酸、高乙醇含量的极端环境下，易受渗透压与酸碱胁迫影响，酶活性稳定性不足[11-12]。相比之下，芽孢杆菌属（Bacillus spp.）代谢特性突出，可产生高活性胞外酯化酶且抗逆性强，能适配黄水复杂环境，在黄水定向酯化增香中展现出独特优势[13]。目前国内外针对白酒源芽孢杆菌产酯化酶的研究仍处于起步阶段，现有报道多集中于菌株筛选与产酶条件优化，而关于其在黄水体系中的实际应用及工艺放大潜力的研究较少，因此挖掘适配黄水环境的产酯化酶芽孢杆菌，对丰富白酒功能微生物资源具有重要意义。
因此，本研究以馥郁香型白酒黄水为研究对象，通过透明圈法及发酵实验筛选高产酯化酶芽孢杆菌，通过形态学观察、生理生化实验及分子生物学技术对其进行鉴定，通过单因素及响应面试验优化其酯化条件，验证菌株粗酶液在黄水体系中的酯化效果，旨在为白酒副产物资源化利用与风味调控提供菌株资源，推动白酒产业的绿色低碳发展与品质升级。
馥郁香型白酒酿造副产物黄水、酒尾 酒鬼酒股份有限公司； 商用酯化酶制剂 诺和新元（苏州）生物制造有限公司。
己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙醇（均为色谱纯）、三丁酸甘油酯、己酸、乙酸、乳酸、无水乙醇、葡萄糖、丁酸（均为分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉（均为生化试剂） 广东环凯微生物科技有限公司；氯化钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、七水合硫酸镁（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）裂解缓冲液、Premix Taq预混PCR试剂（均为生物试剂） 宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖（分析纯） 北京兰杰柯科技有限公司；Marker Ⅲ（生物试剂）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司。
产酯化酶菌株初筛培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂粉20 g/L，加入三丁酸甘油酯1%，121 ℃高压灭菌20 min。
种子液体培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化钠5 g/L，121 ℃高压灭菌20 min。
发酵产酶培养基：葡萄糖20 g/L、牛肉膏20 g/L、硫酸铵0.5 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、七水合硫酸镁0.5 g/L、氯化钠0.5 g/L，调节pH值至7.0，121 ℃高压灭菌20 min。
LAI-3TN-C型厌氧培养箱 上海龙跃仪器设备有限公司；DMEX30生物显微镜 宁波舜宇仪器有限公司；C1000 PCR仪 美国伯乐公司；TDZ5-WS型离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LE204E型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDZX-50 KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；6820气相色谱（gas chromatography，GC）仪 安捷伦科技（中国）有限公司；SW-CJ2D超净工作台 上海苏净实业有限公司；HZ150L恒温培养摇床 武汉瑞华仪器设备有限责任公司；HH-6D数显恒温水浴锅 常州普天仪器制造有限公司。
1.3.1 黄水中产酯化酶芽孢杆菌的筛选
初筛：移取10 mL黄水于90 mL无菌水中，70 ℃水浴处理20 min后，180 r/min、30 ℃摇床振荡30 min，制成菌悬液，取上述菌悬液1 mL转接至9 mL无菌水中，采用10倍梯度分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。取上述稀释液各200 μL均匀涂布于初筛培养基平板，37 ℃恒温厌氧培养24～48 h，每隔12 h观察目标菌落周围的透明圈形态，挑取能产生透明圈的菌落，在初筛培养基平板上划线分离至获得纯种。重复透明圈实验，观察菌落周围出现的透明圈，使用游标卡尺测定透明圈直径（D）和菌落直径（d）并计算两者比值（D/d），选取D/d值较高的菌株进行后续实验。
复筛：将初筛后的单菌落接种于50 mL液体种子培养基中，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，取上述培养后的菌悬液1 mL转接后，37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，制备种子液；取1 mL种子液接种于发酵产酶培养基，37 ℃、180 r/min摇床培养48 h，发酵液经8 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液，使用预冷至4 ℃的0.9%生理盐水将粗酶液质量浓度调整为0.1 mg/mL，测定粗酶液的酯化酶活力[14]。
1.3.2 产酯化酶菌株的鉴定
形态学观察：采用划线法将目标菌株接种至产酯化酶菌株初筛培养基，37 ℃培养24 h，观察其菌落形态及特征，对其进行革兰氏染色处理，并通过显微镜观察细胞形态。
生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]及《伯杰氏细菌鉴定手册》[16]中的鉴定方法对目标菌株进行接触酶试验、甲基红试验、V-P试验、明胶水解试验、淀粉水解试验。
分子生物学鉴定：采用引物27F（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACCTTGTTAC GACTT-3′）对菌株16S rDNA基因序列进行PCR扩增。PCR扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循环；72 ℃再延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。回收PCR扩增产物并送至湖南有康莱生物科技有限公司进行测序。
系统发育树构建：将测序得到的序列提交至NCBI，通过BLAST工具进行同源性比对，选取同源性较高的典型模式菌株序列并下载，获取其登录号。使用MEGA 12.1.0软件对目标序列与参考序列进行多序列比对，采用邻接法构建系统发育树[17]。
1.3.3 筛选菌株酯化条件优化
单因素试验：在酯化反应体系中，固定粗酶液添加量为5%、反应时间为72 h，分别考察不同反应温度（20、25、30、35、40 ℃）、反应pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、乙醇体积分数（5%、10%、15%、20%、25%、30%）对酯化酶活力的影响。
响应面试验设计：基于单因素试验结果，以反应温度（A）、反应pH值（B）、乙醇体积分数（C）为自变量，以酯化酶活力为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件设计3因素3水平的Box-Behnken响应面试验以优化酯化条件。响应面试验设计因素及水平见表1。
表1 酯化条件优化响应面试验因素与水平
Table1 Factors and levels of response surface test for esterification condition optimization
因素-101 A反应温度/℃303540 B反应pH4.04.55.0 C乙醇体积分数/%152025
1.3.4 酯化酶对己酸、乙酸、丁酸、乳酸的酯化能力测定
分别配制单一酸与混合酸2种酯化反应体系。单一酸体系：取0.2 mol/L己酸、乙酸、丁酸、乳酸溶液，分别加入乙醇，使乙醇浓度为0.25 mol/L，用蒸馏水定容至1 L；混合酸体系：将己酸、乙酸、丁酸、乳酸按物质的量比1∶1∶1∶1配制混合溶液，使4种酸总浓度为0.2 mol/L （各酸浓度均为0.05 mol/L），再加入乙醇，使之达到0.25 mol/L，用蒸馏水定容至1 L。向上述体系中加入0.2 mL经蛋白浓度校正的0.1 mg/mL粗酶液，保证各反应体系的酶蛋白添加量一致。在35 ℃条件下酯化反应48 h后，加入等体积无水乙醇使酶失活，终止反应。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，去除体系中未反应的固体颗粒、蛋白沉淀，防止污染色谱柱，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，收集滤液，测定总酯含量，同时采用GC测定乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯生成量。
同时设置单一酸体系和混合酸体系空白对照组，不加入粗酶液，其他条件与实验组保持一致，用于排除酸醇自发酯化反应的干扰。
1.3.5 粗酶液酯化黄水实验
使用乙醇体积分数55%的酒尾调节黄水乙醇体积分数至18%后，加入5%（V/V）经蛋白校正的粗酶液（0.1 mg/mL），36 ℃、pH 4.5条件下酯化96 h，每隔24 h测定一次总酯，加入等体积无水乙醇使酶失活，终止反应，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，去除体系中未反应的固体颗粒、蛋白沉淀，防止污染色谱柱，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，采用GC测定乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯含量。同时设置2组对照，一组为不加酶的黄水空白对照，排除黄水自身酯化或其他微生物作用的干扰；另一组为添加等量商品酯化酶的对照组。
1.3.6 总酸、乙醇、总酯及酯类物质含量测定
参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》测定总酸含量；参照GB 5009.225—2023《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》测定乙醇含量；参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》测定总酯含量。
采用GC法测定乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯。GC条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm），程序升温条件：初始温度40 ℃，保持1 min，以4.0 ℃/min升至130 ℃，以20 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min；检测器温度250 ℃；进样口温度250 ℃；载气流量1.0 mL/min；进样量1.0 μL；分流比20∶1。根据标准品的保留时间定性，根据内标法定量。
采用Excel 2019处理数据，数据以
±s表示，采用GraphPad Prism 5.0软件绘图。
由表2可知，采用透明圈法从黄水样中共获得9株透明圈直径相对较大的菌株，菌株AY-6的D/d值及酯化酶活力均达到最高值，分别为2.75、14.35 U/mL。因此，选择菌株AY-6进行后续实验。
表2 筛选菌株的D/d值及酯化酶活力
Table2 D/d values and esterifying enzyme activity of the screened strains
菌株D/d酯化酶活力/（U/mL）AY-12.75±0.023.94±0.42 AY-42.09±0.020.79±0.16 AY-51.48±0.011.85±0.40 AY-62.75±0.0114.35±0.42 AY-72.07±0.013.47±0.70 AY-81.47±0.0211.81±0.70 AY-91.81±0.023.70±0.42 AY-111.64±0.022.55±0.41 AY-121.82±0.022.31±0.40
2.2.1 形态学观察
如图1A所示，菌株AY-6能形成明显的透明圈，菌落表面呈褶皱状、低凸起形态，轮廓不规则且无明显光泽，质地黏稠易挑取，菌落主体与边缘的色泽一致且呈不透明状态。如图1B所示，经革兰氏染色后，菌株AY-6形态呈短杆状，颜色呈紫色，符合革兰氏阳性菌的特征。
图1 菌株AY-6的菌落（A）与菌体（B）形态
Fig.1 Colony(A) and cell morphology(B) of strain AY-6
2.2.2 生理生化观察
由表3可知，菌株AY-6的淀粉水解、明胶水解、接触酶及V-P试验均为阳性，甲基红试验为阴性，生理生化特征与芽孢杆菌属的典型表型一致，结合分子生物学鉴定结果，可明确其分类学地位。
表3 菌株AY-6生理生化特性
Table3 Physiological and biochemical characteristics of strain AY-6
淀粉水解+接触酶+试验项目结果明胶水解+甲基红-V-P+
注：+.阳性；-.阴性。
2.2.3 分子生物学鉴定
经PCR扩增，菌株AY-6的16S rDNA序列碱基长度为1 487 bp。采用MEGA 12.1.0构建系统发育树，结果见图2。菌株AY-6与特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）10b同源性较高，达99.86%，聚在同一分支，表明两者亲缘关系极近。因此，菌株AY-6鉴定为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）。
图2 基于16S rDNA序列菌株AY-6的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain AY-6based on16S rDNA sequences
2.3.1 反应pH值的确定
由图3可知，随着pH值在3.0～5.0范围内的增加，菌株AY-6的酯化酶活力呈先上升后下降的趋势；当pH值为4.5时，酯化酶活力达到最高值，为14.35 U/mL。当反应体系pH值低于4.5时，过酸的环境会破坏酶分子（蛋白质类催化剂）的电荷分布状态，干扰其活性中心与底物分子的特异性结合，同时削弱酶分子空间结构的稳定性，酶促反应的效率受限，导致酶活力较低[18]。当pH值超过4.5时，会改变酶活性中心的构象特征，酶分子中氨基酸残基的解离状态发生改变，使其失去与底物精准结合并催化反应的能力，因此酶活力出现明显回落[19]。综上，确定最适反应pH值为4.5。
图3 反应pH值对酯化酶活力的影响
Fig.3 Influence of reaction pH value on esterase activity
2.3.2 反应温度的确定
由图4可知，随着反应温度的上升，菌株AY-6的酯化酶活力呈先上升后下降的趋势；当反应温度为35 ℃时，酯化酶活力达到最高值，为13.65 U/mL。温度低于30 ℃时，低温抑制化学反应速率，同时分子动能不足，酶与底物难以快速形成稳定的酶-底物复合物，反应启动速率受限；当温度达到40 ℃时，酶活力反而降低，可能是因为高温会影响酶的结构[20]。温度通过调控分子运动效率与蛋白构象稳定性，形成“低温抑制反应速率、高温破坏酶结构”的双向影响[21]，综上，确定最适反应温度为35 ℃。
图4 反应温度对酶液酯化酶活力的影响
Fig.4 Influence of reaction temperature on esterase activity
2.3.3 乙醇体积分数的确定
如图5所示，乙醇体积分数为5%～20%时，酯化酶活力相对较稳定，乙醇体积分数为20%时，酯化酶活力达13.19 U/mL；当乙醇体积分数超过20%后，酯化酶活力下降。乙醇体积分数较低时，乙醇仅与酶蛋白表面发生温和的相互作用，并未破坏其核心空间构象，酶活性中心仍能正常结合底物并催化反应，酶活力相对稳定[22-23]；而乙醇体积分数过高，乙醇逐渐渗透至酶蛋白分子内部，一方面打破酶分子表面的水化膜，破坏酶结构，导致酶活力下降，另一方面干扰其氨基酸残基间的次级键连接，使酶的空间构象出现不可逆的轻微扭曲[24]。因此，确定最佳乙醇体积分数为20%。
图5 不同乙醇体积分数对酶液酯化酶活力的影响
Fig.5 Influence of ethanol content on esterase activity
2.3.4 酯化条件优化响应面试验结果
采用Design-Expert 8.0.6软件对表4数据进行多元二次回归分析，得到二次多项式回归方程：Y＝15.534+0.168 75A+0.172 5B-0.508 75C-0.272 5AB-0.51AC+0.067 5BC-0.784 5A2-1.067B2-1.089 5C2。
表4 酯化条件优化响应面试验设计及结果
Table4 Design and results of response surface experiment for esterification condition optimization
200014.35500014.81901-114.581011013.43161-1014.12试验号ABC酯化酶活力/（U/mL）1-1-1013.19300014.5840-1112.04601115.5170-1-112.58810-114.581100014.3512-11013.191310112.7314-10113.6615-10-113.661700014.58
由表5可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＝0.464 0＞0.05），表明二次回归方程拟合程度良好，能够很好地对响应值进行预测。决定系数R2＝0.985 3，校正决定系数
，表明模型可解释98.53%的酯化酶活力变异，拟合程度良好；预测决定系数
，说明模型预测能力可靠，无明显过拟合现象。由P值可知，一次项C、交互项AC及二次项A2、B2、C2对酯化酶活力影响极显著（P＜0.001），一次项A、B及交互项AB对酯化酶活力影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各因素对酯化酶活力影响的主次顺序为：乙醇体积分数（C）＞反应pH值（B）＞反应温度（A）。
表5 回归模型方差分析
Table5 Variance analysis of regression model
来源平方和自由度均方FP显著性模型17.6991.9752.09＜0.000 1**A0.2310.236.040.043 7*B0.2410.246.310.040 3*C2.0712.0754.870.000 1**AB0.3010.307.870.026 3*AC1.0411.0427.570.001 2**BC0.01810.0180.480.509 5 A22.5912.5968.67＜0.000 1**B24.7914.79127.03＜0.000 1**C25.0015.00132.45＜0.000 1**残差0.2670.038失拟项0.1230.0391.040.464 0误差项0.1540.037总和17.9616
注：*.显著（P＜0.05）；**.极显著（P＜0.01）。
当各因素水平从四周逐渐趋向中心点时，曲面呈凸起趋势，说明存在最大响应值。响应曲面坡度越陡，等高线越趋于椭圆形，交互作用越显著[25]。由图6可知，各因素水平从四周向中心点变化时，3个响应曲面均呈凸起趋势，表明反应温度与反应pH值、乙醇体积分数间交互作用明显，AC响应曲面坡度最陡，等高线趋于椭圆形，这与方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对酯化酶活力影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface and contour plots for the interactive effects of various factors on esterase activity
通过Design-Expert 8.0.6软件对回归方程进行最优求解，得到菌株AY-6粗酶液最佳酯化条件为：反应温度35.95 ℃、反应pH 4.52、乙醇体积分数18.62%，在此优化条件下，酯化酶活力预测值为15.62 U/mL，为方便实际操作，将酯化条件参数修正为：反应温度36 ℃、反应pH 4.5、乙醇体积分数18%。酯化酶活力实际值为15.97 U/mL，与预测值相差不大，说明该模型可靠，可对酯化条件进行预测。
2.4.1 单一有机酸体系下的酯化能力
如图7所示，菌株AY-6粗酶液可分别催化己酸、乙酸、丁酸、乳酸与乙醇发生酯化反应，生成己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯，其质量浓度分别为1.59、1.54、1.33、1.13 g/L。表明有机酸底物种类影响酯化反应效率[26]，该酶对己酸和乙酸的酯化催化活性较强。从底物结构角度分析，上述催化底物偏好性可能与酸分子的碳链长度及官能团特性密切相关[27]：己酸与乙酸的分子空间构型与该酶活性中心的匹配度较高，有利于底物与活性位点的高效结合，从而促进酯化反应的进行；而丁酸和含羟基的乳酸在空间适配性方面相对较低，导致催化效率有所下降。这一特性与白酒酿造中“己酸乙酯、乙酸乙酯为核心风味酯类”的需求高度契合，进一步体现了该酯化酶在白酒风味优化中的应用潜力。
图7 粗酶液对不同酸的酯化能力
Fig.7 Esterification ability of crude enzyme solution towards different acids
2.4.2 混合有机酸体系下的酯化能力
如图8所示，在己酸、乙酸、丁酸、乳酸物质的量比为1∶1∶1∶1的混合酯化体系中，菌株AY-6粗酶液对4种酸均表现出催化活性，在该混合体系中，催化生成己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯的质量浓度分别为0.96、0.45、0.73、0.27 g/L。结果表明，在混合底物体系中，酯化酶对中长链脂肪酸（己酸和丁酸）的催化效率显著高于短链酸（乙酸）和羟基酸（乳酸），呈现出明显的底物选择性，这可能与底物分子结构或酶的特异性结合有关[28]。从底物结构角度推测，己酸、丁酸作为中长链脂肪酸，其碳链长度与该酯化酶活性中心的空间构型匹配度较高，有利于底物与活性位点的有效结合；而乙酸碳链较短，乳酸因含有羟基而导致极性增大，二者与酶活性中心的适配性相对较弱，因此催化效率较低。己酸乙酯生成量约为丁酸乙酯的1.3倍，提示该酶在中长链脂肪酸底物中对己酸具有更强的亲和性，这一特性与浓香型白酒酿造中“己酸乙酯为主体风味物质”的需求高度 适配[29]，体现了该酯化酶在实际生产中的应用优势。
图8 酯化酶在混合酸体系中的酯化能力
Fig.8 Esterification ability of esterification enzyme in mixed acid system
由图9可知，黄水总酯含量在出窖后偏低，仅0.36 g/L， 这可能与酯类物质的挥发损失及黄水复杂基质中的酯类物质消耗有关，因此空白对照组总酯质量浓度持续维持在0.4 g/L以下，整体水平偏低。加入菌株AY-6粗酶液后，黄水总酯质量浓度在24～72 h内增加，72～96 h内趋于稳定，发酵96 h时，总酯质量浓度达0.86 g/L。加入商品酶后黄水总酯质量浓度在24～96 h内均低于AY-6组，分析原因认为，本体系依据菌株AY-6酯化酶最适催化条件设定，未同步优化商品酶的反应条件，导致商品酶催化潜力未能充分发挥；而菌株AY-6粗酶液的最适催化条件与调节后黄水的理化特性高度吻合，因此在当前酯化体系中表现出更优的总酯积累效果。
图9 最适条件下酯化酶对黄水总酯含量的影响
Fig.9 Effect of esterase on total ester content in Huangshui under optimal conditions
如图10所示，酯化前黄水中乳酸乙酯质量浓度最高（0.495 83 g/L），乙酸乙酯质量浓度为0.029 46 g/L，己酸乙酯质量浓度为0.003 25 g/L，丁酸乙酯质量浓度未达到检测限，酯类物质组成与优质白酒的典型风味结构差距较大；经菌株AY-6粗酶液酯化72 h后，己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯质量浓度分别达0.096 87、0.096 92、0.087 99、0.578 82 mg/L。而商品酶对照组对己酸乙酯催化效果较为明显，但对乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯的促进效果并不显著。上述结果表明，菌株AY-6粗酶液可有效提升黄水的总酯含量，并能够定向促进己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒核心酯类物质的生成。
图10 黄水酯化前后主要酯类物质含量变化
Fig.10 Changes of main ester contents in Huangshui before and after esterification
本研究以馥郁香型白酒的黄水样品为原料，采用透明圈及酯化酶活力分析筛选得到9株产酯化酶菌株，其中菌株AY-6产酯化酶活力最高（14.35 U/mL），鉴定为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）。其最佳酯化条件为：反应温度36 ℃、反应pH 4.5、乙醇体积分数18%，在此优化条件下，酯化酶活力达15.97 U/mL，应用该酶液处理黄水96 h后总酯质量浓度提升至0.86 g/L，并定向促进己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒核心酯类生成。该菌株为黄水与酒尾等白酒酿造副产物资源化利用提供了高效酶制剂支撑，也为白酒酿造副产物的提质回收与高值化利用提供了新的技术路径。
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