图1 DC1和DC4组细菌菌群稀释曲线（A）、Chao1指数（B）和Shannon指数（C）
Fig.1 Rarefaction curve(A),Chao1index(B) and Shannon index(C) of bacterialflora in DC1 and DC4groups
CUI Zhiyu, WEN Yurong, TANG Qing, et al. Microbial community diversity of Guilin Douchi at different fermentation times[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 45-50. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.007.http://www.chinabrewing.net.cn
Microbial Community Diversity of Guilin Douchi at Different Fermentation Times
豆豉是我国传统发酵食品，主要以黑豆或黄豆为原料，经微生物发酵制成[1-3]。根据发酵微生物的不同，豆豉可分为曲霉型、毛霉型和细菌型3大类，其中曲霉型和毛霉型豆豉在国内备受青睐。发酵不仅能提升豆豉的营养品质，有效降解胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，还可对原料中大分子蛋白质进行分解代谢，并能够生成苷元型异黄酮、维生素和可溶性糖等多种功能性营养物 质[4-5]。与此同时，发酵体系中的微生物可分泌多种胞外酶，进一步催化原料中蛋白质、碳水化合物及脂质的分解与转化反应[3,6]。在异黄酮功效提升方面，发酵还可实现糖苷型异黄酮向高生物活性苷元型异黄酮的转化，从而增强其生理调节功能[7]。豆豉发酵品质与风味的形成，与其体系内富集的优势微生物密切相关，各类微生物在发酵进程中各司其职、协同代谢，是驱动豆豉理化性质及营养特征变化的核心主体[8-10]。例如，浏阳豆豉中葡萄球菌属（Staphylococcus）、根瘤菌属（Rhizobium）和海带属（Laminaria）为优势菌属，而八宝豆豉中芽孢杆菌属（Bacillus）、曲霉属（Aspergillus）和红酵母属（Rhodotorula）丰度较高，这些菌属与蛋白酶活性均呈正相关[8]；非产毒黄曲霉（Aspergillus flavus）菌株可促进浏阳豆豉中谷氨酸和乙酸释放，并显著增加酯类和醛类物质含量，赋予豆豉花香和坚果香气[11]。 Staphylococcus则通过代谢蛋白质和脂肪，促进醛类、酯类和醇类等风味物质形成[12]。遵义细菌型豆豉中杆菌属芽孢杆菌、拟杆菌、短杆菌相对丰度较高，挥发性物质中酸类物质含量最高，其次是含氮类物质，醇、酮及酯类物质含量较少，其可能与微生物群落有关[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是细菌型豆豉中的主要微生物，其代谢产物四甲基吡嗪为一种具有坚果香气的风味活性化合物[13]。
豆豉菌群结构研究方法主要包括可培养法、限制性片段长度多态性技术、变性梯度凝胶电泳技术等方法，但是这些方法各有其局限性[14-16]。Illumina MiSeq高通量测序技术因其高准确率和高通量，常用于检测微生物多样性。为探究不同发酵时间对桂林豆豉微生物群落的影响，本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对发酵1～4年桂林豆豉样品进行微生物菌群结构分析，旨在明确其优势菌群种类，为桂林豆豉的发酵调控与规模化生产提供理论依据。
豆豉采自广西桂林，选取发酵1年豆豉（DC1）、发酵4年豆豉（DC4），装入灭菌离心管。采集完毕后及时将所采豆豉样品置于冰盒保存，并立即送返实验室，-80 ℃贮藏备用。
E.Z.N.A.®土壤DNA抽提试剂盒 美国Omega公司；FastPfu DNA聚合酶（5 U/μL） 北京全式金生物技术股份有限公司；无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司；琼脂糖 西班牙Biowest公司；AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒 美国Axygen公司。
T100聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；JY600电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；NextSeq 2000高通量测序仪 美国Illumina公司；ME2002E分析天平瑞士Mettler Toledo公司；NanoDrop 2000微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3.1 样品DNA提取和PCR扩增
使用DNA提取试剂盒提取豆豉样品中DNA。利用微量分光光度计检测DNA浓度和纯度；使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。以338F（5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′）作为引物对细菌16S rRNA基因序列的V3～V4区域进行扩增，以ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3′）和ITS4R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）作为引物对真菌18S rRNA基因序列进行扩增。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，27个循环；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.3.2 Illumina Miseq测序
使用2%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，利用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖凝胶电泳检测。利用微型荧光计定量检测[14,17-18]。利用Illumina MiSeq平台（上海美吉生物医药科技有限公司）进行测序。
操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU）是在系统发育或群体遗传学研究中人为设置的分类单元（如株、属、种、群等）的统一标记，以便于数据分析。为了从样本测序结果中获得关于种、属等层级的数量信息，需要进行序列聚类。通过聚类操作，序列根据彼此间的相似性被划分为多个组，每个组即代表一个OTU。根据不同的相似度阈值，可将所有序列划分为相应的OTU。使用UPARSE软件（版本7.0.1090；http://drive5.com/uparse/）对相似度为97%的序列进行聚类和生物信息学统计分析。为获得每个OTU对应的物种分类信息，对代表性OTU序列（相似度阈值97%）进行分类学分析，采用核糖体数据库项目分类器的贝叶斯算法。此外，每个样品中群落的物种组成在各分类等级（门和属）上进行计数，所依据的数据库为SILVA（Release 138，http://www.arb-silva.de）和GreenGenes（版本13.5， http://greengenes.secondgenome.com/）。
稀释曲线反映测序深度对应的细菌群落多样性，如果稀释曲线覆盖全面趋于饱和，表明测序数据合理[19]。由图1A可知，所有样品稀释曲线趋于饱和，表明本次样品测序数据合理。α-多样性指标包括群落丰富度（Chao1指数、ACE指数）和群落多样性（Shannon指数、Simpson指数）。群落丰富度表征样本内微生物物种的总数，群落多样性综合体现物种数量与各物种的丰度分布特征；因此α-多样性指标能够反映不同发酵时长豆豉样品中微生物群落的差异与变化规律。为研究不同发酵时间豆豉细菌菌群多样性，利用Chao1和Shannon指数对豆豉细菌菌群多样性进行分析。
图1 DC1和DC4组细菌菌群稀释曲线（A）、Chao1指数（B）和Shannon指数（C）
Fig.1 Rarefaction curve(A),Chao1index(B) and Shannon index(C) of bacterialflora in DC1 and DC4groups
由图1B、C可知，DC1和DC4组Chao1指数和Shannon 指数没有显著差异（P＞0.05），但是DC1组比DC4组菌群丰富度高，说明随着发酵时间延长，豆豉中细菌多样性减少。
由图2A可知，DC1和DC4细菌组成OTU分别为116个和73个，共有OTU为65个，DC1独有OTU 51个，DC4独有OTU 8个。通过Venn图分析发现，不同发酵时间豆豉细菌存在不同的微生物群落组成。
图2 DC1和DC4组细菌OTU Venn图（A）和LDA得分柱状图（B）
Fig.2 BacterialOTUVenn diagram(A) andhistogram ofLDAscore(B)of DC1 and DC4groups
利用LDA工具，从门到属水平对LDA得分≥2的微生物群落进行分析。由图2B可知，DC1组有10种差异细菌，其中g__Lysinibacillus和f__Planococcaceae丰度贡献最高，DC4组c__Bacilli和p__Firmicutes为优势差异类群。
由图3A可知，在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度最高，占90%以上。由图3B可知，在属水平上，桂林豆豉在发酵过程中的细菌有Bacillus、Staphylococcus、屠宰场拟杆菌属（Macellibacteroides）、产碱杆菌属（Alcaligenes）等。DC1和DC4组中优势菌属为Bacillus和Staphylococcus，但是DC1组的Bacillus相对丰度低于DC4组。有研究发现，陇南豆豉中和阳江豆豉中富含Bacillus，Bacillus产生的酶或风味物质在豆豉的风味构成中发挥着重要作用[20-21]。同时，Bacillus因具有产生孢子、形成生物膜、分泌酶类、合成抗生素和诱导植物激素合成的能力而具有重要价值[22]。目前Bacillus被广泛应用于豆豉、豆瓣酱和发酵食品中[22]。由此可知，发酵4年的豆豉风味可能比发酵1年的豆豉更好，具有较好的应用前景。Staphylococcus会通过代谢产生具有奶酪香味的3-甲基丁酸，在代谢过程和风味化合物的生成中发挥重要作用，这可能是广东阳江豆豉特有风味形成的重要原因之一[23]。DC1组Staphylococcus相对丰度高于DC4组，这说明发酵1年的豆豉风味可能比发酵4年的风味更接近阳江豆豉。
图3 DC1和DC4组细菌菌群结构组成
Fig.3 Bacterial community composition ofDC1 and DC4groups
PICRUSt2结合eggNOG数据库，可预测细菌微生物群在组织中的功能[24]。同时，PICRUSt2结合KEGG数据库也能预测细菌微生物群在组织中的功能，并展示KEGG通路在2级和3级水平上的注释结果。基于16S rRNA基因扩增子测序数据，结合eggNOG预测细菌的生物功能，主要涉及代谢，除未知功能以外，氨基酸转运与代谢的相对丰度最高（图4A）。同样，16S rRNA基因测序数据结合KEGG功能预测表明，细菌菌落功能主要与碳水化合物和氨基酸代谢途径有关（图4B1）。3级水平KEGG通路注释信息可以进一步确认菌群主要参与代谢途径、次级代谢产物的生物合成和氨基酸的生物合成（图4B2）。
图4 基于PICRUSt2结合eggNOG （A）和KEGG （B）数据库的细菌群落功能预测
Fig.4 Functional prediction of bacterial community based on PICRUSt2 with eggNOG(A) and KEGG(B) databases
2.4.1 不同发酵时间真菌多样性
由图5A可知，所有样品稀释曲线趋于饱和，表明本次样品测序数据合理。由图5B、C可知，DC1和DC4组ACE指数和Shannon指数差异不显著（P＞0.05）。
图5 DC1和DC4组真菌菌群稀释曲线（A）、ACE指数（B）和Shannon指数（C）
Fig.5 Rarefaction curves(A),ACE index(B) and Shannon index(C) of fungalflora in DC1 and DC4groups
2.4.2 不同发酵时间真菌组成分析
由图6可知，DC1和DC4真菌组成OTU分别为87个和86个，共有OTU为53个，DC1独有OTU 34个，DC4独有OTU 33个。通过Venn图分析发现，不同发酵时间豆豉真菌存在不同的微生物群落。
图6 DC1和DC4组真菌OTU Venn图
Fig.6 Fungal OTU Venn diagram ofDC1 and DC4groups
由图7A可知，在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）相对丰度最高，占99%以上。由图7B可知，桂林豆豉发酵过程中真菌菌属主要为斯塔莫酵母属（Starmerella）、炭疽菌属（Colletotrichum）、念珠菌属（Candida）、柯达酵母属（Kodamaea）、枝孢属（Cladosporium）、拟威克酵母属（Wickerhamiella）等。DC1组的优势菌株为Starmerella。Starmerella的某些酵母在食品发酵中具有重要作用，例如，Starmerella davenportii Do18在红茶发酵中表现出理想的发酵特性，能够产生浓郁的香气和有机酸，降低胆固醇，对高糖、低pH值、胆盐等具有耐受性，并能模拟胃肠环境[8,25]。Candida是中国传统发酵豆豉风味形成的菌株之一，其能增加豆豉的甜味和焦糖味，永川豆豉发酵过程中，Candida为优势真菌类群，丰度较高[23,26-28]。DC4组中Candida的相对丰度比DC1高，由此可见发酵4年的豆豉的真菌多样性更接近于我国传统豆豉。
图7 DC1和DC4组真菌菌群结构组成
Fig.7 Fungal community composition ofDC1 and DC4groups
采用高通量测序技术对不同发酵时间桂林豆豉的菌群多样性及群落结构进行分析。α-多样性结果表明，发酵1年和发酵4年豆豉的细菌多样性和真菌多样性没有显著性差异，优势菌门均为Firmicutes，优势真菌门均为Ascomycota和Basidiomycota。发酵1年和发酵4年的优势细菌属均为Bacillus和Staphylococcus；优势真菌属均为Starmerella和Candida。PICRUSt2测序，细菌菌落功能主要与碳水化合物与氨基酸代谢途径、代谢途径、次级代谢产物的生物合成和氨基酸的生物合成有关。本研究结果有助于加深对对桂林豆豉的了解和后续相关产品的开发。
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