Isolation, Identification and Antioxidant Mechanism Analysis of Polypeptides in Fermented Grains from Different Rounds of Sauce-Flavor Baijiu Fermentation
LIU Xiangyue, ZHANG Sijie, SONG Fenfang, et al. Isolation, identification and antioxidant mechanism analysis of polypeptides in fermented grains from different rounds of sauce-flavor Baijiu fermentation[J]. China Brewing,2026, 45(6): 29-37. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.005. http://www.chinabrewing.net.cn
酱香型白酒作为我国传统高端白酒，近年来其销量在消费升级和品质竞争的双重作用下持续增长，主力消费群体对其风味稳定性、品质可控性和健康属性的关注日益增强[1]，相关研究逐步聚焦于主要风味前体及功能性成分的表征机制并持续深入[2]。固态发酵是酱香型白酒品质（酒体风味骨架和多层次香气）形成的关键环节，而酒醅中蛋白质降解[3]是连接微生物代谢、风味形成、潜在生物活性的重要纽带[4]。
酱香型白酒生产周期一般较长，经多轮次发酵，不同轮次酒在温度、含水量、酸度、氧化还原状态、微生物群落结构等方面均存在差异，这进一步影响蛋白酶系表达，导致蛋白质降解呈现轮次间显著差异[5-7]。蛋白质在微生物、环境酶作用下逐渐分解为多肽与游离氨基酸[8]，一方面可为微生物生长代谢提供氮源和代谢底物[9]，另一方面亦是重要的风味前体物质[10]，在蒸馏、贮存和热加工过程中，多肽或氨基酸可参与美拉德反应，间接影响含氮杂环、醛酮类等重要香气物质的形成，进而影响酒体口感与风味层次等[11]。因此，探究不同发酵轮次酒醅的蛋白降解特征与多肽谱差异，有助于阐释酱香型白酒轮次间风味与品质差异形成机制，也可为关键轮次选择提供科学依据[12]。
多肽是由2个及以上氨基酸残基通过肽键缩合而成的化合物，具有结构简单、分子质量小、官能团丰富等特点，可参与复杂发酵体系中的多重化学反应[13-14]；同时多肽易与自由基或金属离子发生相互作用，进而发挥抗氧化等生物活性。在食品发酵体系中，天然来源抗氧化肽具有作用温和、与食品基质相容性好等优点[15]。多肽的抗氧化活性与其氨基酸序列密切相关[16]：Tyr、Trp、Phe等芳香族氨基酸残基可通过供氢/供电子作用稳定自由基[17]；His、Met、Cys等残基则可增强金属离子螯合及过氧化物清除能力[18-19]。白酒中的多肽既可作为风味前体参与酒体香气与口感的塑造，也可作为功能活性因子赋予白酒健康属性，契合当前消费者对白酒品质与健康并重的关注趋势。
目前针对酱香型白酒多肽的相关研究仍较为有限，现有报道多集中于多肽结构鉴定及粗提物活性评价，缺乏从从关键发酵轮次到特征活性多肽筛选及机制解析的系统性闭环研究。本研究以酱香型白酒不同发酵轮次酒醅为研究对象，首先通过测定各轮次多肽含量、蛋白酶活性、总氮及蛋白水解度等指标，确定蛋白降解最为明显的关键轮次；其次利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术对关键轮次中的多肽进行结构鉴定，筛选出具有抗氧化活性的特征多肽；最后通过分子对接技术探究抗氧化肽与氧化自由基之间的相互作用，以解析抗氧化机制，以期为酱香型白酒发酵过程中的关键轮次工艺优化与潜在功能因子挖掘提供理论参考。
3～7轮次酒醅样品取自湖南湘窖酒业有限公司车间；酪蛋白、L-酪氨酸、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力试剂盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠十二水合物、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 上海麦克林生化科技有限公司；其他化学品和试剂（均为分析级） 国药集团化学试剂有限公司。
5810R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Scientz-48组织研磨器 宁波新芝生物科技股份有限公司；TW20恒温水浴锅 德国Julabo公司；MX-S涡旋混匀仪 美国Scilogex公司；UV-2700i紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；Synergy H1酶标仪 美国 BioTek公司；KjeltecTM 8400凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；UltiMate 3000 RSLCnano-Q Exactive HF超高效液相色谱-高分辨质谱联用系统 美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3.1 酒醅粗蛋白及全氮含量测定
采用凯氏定氮法测定各酒醅样品中粗蛋白含量。准确称取1.0 g混匀后的酒醅样品，置于消化管中，加入浓硫酸及催化剂，消化至溶液澄清透明。冷却后加碱蒸馏，使样品中氨蒸出并由硼酸吸收液吸收，随后采用标准盐酸或标准硫酸滴定至终点，记录样品和空白的滴定体积。按式（1）（2）分别计算粗蛋白质量分数和全氮质量分数：
式中：Vs为样品滴定体积/mL；Vb为空白滴定 体积/mL；C为标准酸浓度/（mol/L）；m为样品质 量/g；14.01为氮原子的摩尔质量/（g/mol）。
1.3.2 酒醅蛋白酶活性测定
采用酪蛋白底物-酪氨酸释放-钨蓝比色法测定酒醅中酸性蛋白酶（acid protease，ACP）、中性蛋白酶（neutral protease，NP）与碱性蛋白酶（alkaline protease，AKP）活性[20]。其中，ACP置于酸性体系 （pH 3.0），NP置于中性体系（pH 7.0），AKP置于碱性体系（pH 10.0）。称取酒醅样品约0.10 g，加入1.0 mL乙醇，冰上充分研磨，并于10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液作为粗酶液，冰上保存待测。设置对照组、测定组、空白组和标准组。其中，对照组与测定组均加入粗酶液20 μL，随后对照组加入100 g/L TCA终止液40 μL，测定组则加入酪蛋白底物液40 μL，混匀后于相应温度水浴反应10 min（ACP、NP：30 ℃；AKP：40 ℃）。反应结束后，对照组加入酪蛋白底物液40 μL，测定组加入终止液40 μL，混匀，10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液用于显色，分别加入碳酸钠显色液200 μL和Folin酚试剂40 μL，混匀后于相应温度水浴显色20 min，在680 nm波长处测定吸光度，空白管以40 μL蒸馏水替代上清液，标准管以40 μL 0.25 μmol/mL L-酪氨酸标准液替代上清液，各组吸光度分别记为A对照、A测定、A空白与A标准，蛋白酶活性按式（3）计算：
式中：C标准为L-酪氨酸标准溶液浓度（0.25 mol/mL）；Cpr为粗酶液蛋白质量浓度/（mg/mL）；V1为酶促反应体系总体积（0.10 mL）；V2为加入反应体系中的粗酶液体积（0.02 mL）；T为酶促反应时间（10 min）。
1.3.3 酒醅多肽含量测定
采用考马斯亮蓝G-250比色法（Bradford法）测定酒醅多肽含量[21]。
以BSA为标准品建立标准曲线方程。向20 μL BSA标准溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）中加入200 μL考马斯亮蓝G-250工作液，充分混匀，室温避光反应5～10 min后，采用酶标仪在595 nm波长处测定吸光度。每个样品平行测定3次，取平均值，以BSA标准溶液质量浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标进行线性回归，绘制蛋白质标准曲线。
多肽样品制备方法：取1 g酒醅样品，充分混匀后，加入适量去离子水匀浆提取，10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液作为水提液。取1.0 mL水提液，加入TCA溶液使终质量浓度为100 g/L，混匀后4 ℃静置10～20 min以充分沉淀大分子蛋白；随后10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液。测定时，取20 μL适当稀释后的10% TCA可溶性多肽上清液，加入200 μL考马斯亮蓝G-250工作液，按上述标准品相同条件显色并测定595 nm吸光度。测定过程中应保证样品吸光度处于标准曲线线性范围内，每个样品平行测定3次，取平均值。按式（4）计算多肽质量浓度：
式中：Asample为样品吸光度；k和b为标准曲线斜率与截距；D为稀释倍数。
1.3.4 酒醅蛋白水解度测定
酒醅蛋白水解度表征蛋白质在发酵过程中由大分子向小分子肽和游离氨基酸的转化程度。采用10% TCA可溶性氮占全氮的百分比表示水解度[22]。取1 g酒醅样品，充分混匀后，加入适量去离子水匀浆提取，10 000 r/min、 4 ℃离心10 min，取上清液作为酒醅水提液。取1.0 mL水提液，加入TCA溶液使终质量浓度为100 g/L，混匀后4 ℃静置10～20 min以充分沉淀大分子蛋白；随后10 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，采用凯氏定氮法测定其氮含量，即为10% TCA可溶性氮，所有测定均设置空白。10% TCA可溶性氮与全氮含量比值即为酒醅蛋白水解度。
1.3.5 酒醅多肽结构鉴定
取酒醅水提液，经3 kDa超滤管分离后收集滤过液即多肽样品采用LC-MS/MS进行结构鉴定[23]。多肽样品经自动进样器进样后，首先富集于C18捕集柱（75 µm×2 cm，3 µm，100 Å），再经C18分析柱（75 µm×25 cm，1.9 µm，100 Å）进行分离。流动相A为含0.1%甲酸的3%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶液，流动相B为含0.1%甲酸的3% DMSO乙腈溶液，采用梯度洗脱模式，流速300 nL/min。MS采用数据依赖采集模式。MS1全扫描参数：分辨率60 000（m/z 200）， 扫描范围m/z 350～1 500，自动增益控制目标值3×106，最大离子注入时间30 ms；前体离子隔离窗1.4 Da，选择信号强度最高的前20个前体离子进行高能碰撞解离，归一化碰撞能量为28。MS2扫描参数：分辨率15 000（m/z 200）， 自动增益控制目标值1×105，最大注入时间50 ms；动态排除时间30 s。
质谱原始数据采用MaxQuant软件完成肽段鉴定与定量分析，导出结果矩阵后，依次进行缺失值填充、污染物过滤、数据归一化及对数转换等预处理[24]。差异多肽的统计分析在RStudio平台完成，依据组间相对丰度变化进行判定，以|log2 FC|＞1作为筛选阈值。
1.3.6 酒醅多肽抗氧化活性测定
多肽样品以去离子水溶解并配制为不同质量浓度梯度，以GSH为阳性对照，参照文献[25]的方法测定酒醅多肽抗氧化活性。
DPPH工作液以甲醇配制，现配现用并避光保存。将多肽样品溶液与DPPH工作液按1∶1（V/V）混匀后室温避光反应20 min，采用酶标仪测定515 nm波长处的吸光度。阴性对照为等体积溶剂（去离子水）与DPPH工作液混合；样品本底对照为样品溶液与等体积甲醇混合，用于扣除样品本底吸光度。DPPH自由基清除率按式（5）计算：
式中：A对照为阴性对照孔吸光度；A样品为样品测定孔吸光度；A空白为样品本底孔吸光度。
称取ABTS与过硫酸钾，配制成终浓度7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾的混合溶液，室温避光放置约14 h，以生成ABTS阳离子自由基。将ABTS阳离子自由基原液用pH 7.4缓冲液稀释，调节至A734 nm＝0.70±0.05，作为工作液。测定时，在96孔板中每孔加入样品溶液10 µL，再加入ABTS阳离子自由基工作液150 µL，避光反应6 min，于734 nm波长处测定吸光度（A样品）。对照孔以10 μL纯水替代样品溶液，并加入150 μL ABTS阳离子自由基工作液，在相同条件下反应并测定吸光度，记为A对照。ABTS阳离子自由基清除率按式（6）计算：
1.3.7 分子对接
为从分子层面解析酒醅多肽的潜在抗氧化作用机制，采用Discovery Studio软件构建多肽三维空间结构，借助3D Chem完成分子构象能量最小化，再基于AutoDock Vina软件完成多肽与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的分子对接，通过PyMOL软件对对接复合物的三维结合构象进行可视化分析，并运用Discovery Studio软件绘制并输出二维相互作用图谱。
采用MaxQuant v2.2.0.0软件对多肽组学原始质谱数据进行处理，完成肽段鉴定与定量，以UniProt数据库中的Sorghum_bicolor_BTx623蛋白序列作为谱图检索的参考序列库，在肽段与蛋白质水平均以1%错误发现率阈值对检索结果进行过滤，以控制鉴定错误率并保证定量可信度。运用GraphPad Prism 10进行统计学分析并绘图，结合数据分布选用t检验或单因素方差分析并校正多重检验，P＜0.05表示差异显著。使用RStudio进行主成分分析（principal component analysis，PCA），以明确样本间多肽组成的整体差异与分离趋势。所有实验均至少进行3次重复，结果以
±s表示。
由图1A可知，基于凯氏定氮法测得的酒醅全氮和粗蛋白含量随发酵轮次推进整体呈升高趋势，表明酒醅体系中含氮物质在多轮次发酵过程中持续累积。由图1B可知，ACP、NP及AKP活性均在第4轮次达到较高水平，随后在第5～7轮次逐渐降低，其中ACP活性整体高于NP和AKP，说明第4轮次蛋白质水解相关酶促作用较为活跃。由图1C可知，采用Bradford法测得的多肽含量在第4轮次较高，随后随轮次推进呈下降趋势。由图1D可知，蛋白水解度随发酵轮次增加而升高，并在后期轮次维持较高水平，提示酒醅蛋白质在发酵过程中持续发生水解，小分子含氮组分逐渐释放。综合来看，第4轮次表现出较高的蛋白酶活性和可溶性蛋白水平，而第5～7轮次蛋白水解度维持较高水平，说明酒醅蛋白质降解过程具有明显的阶段性特征。
图1 不同发酵轮次酒醅粗蛋白及全氮含量（A）、蛋白酶活性（B）、总氮含量（C）、蛋白水解度（D）变化
Fig.1 Changes of crude protein and total nitrogen content(A),protease activity(B),total nitrogen content(C) and degree of protein hydrolysis(D) in fermented grains at different fermentation rounds
为解析酱香型白酒多轮次发酵过程中多肽谱的差异特征，本研究在前期蛋白降解指标测定结果的基础上，选取第4、5、7轮次酒醅样品开展LC-MS/MS肽组学鉴定与定量比较。第4轮次代表蛋白酶活性和含氮组分释放较为活跃的中期水解阶段，第5轮次可反映多肽含量和蛋白水解度继续升高后的过渡状态，第7轮次则代表后期发酵阶段多肽累积与转化后的终末特征。由于第6轮次与第5、7轮次同处于后期水解程度较高阶段，且本研究肽组学检测的设计重点在于比较中期活跃水解、过渡阶段和后期累积阶段之间的多肽谱差异，因此未将第6轮次纳入LC-MS/MS检测。
通过LC-MS/MS技术从这3个轮次酒醅中鉴定出204条多肽。由图2A可知，第4轮次酒醅特有多肽115条，高于第5轮次（20条）与第7轮次（14条），表明第4轮次酒醅多肽组成更为丰富。结合Sorghum_bicolor_BTx623蛋白序列库，在该轮次鉴定到的多肽与高粱蛋白高度匹配，说明第4轮次很可能是高粱原料蛋白集中裂解、短肽快速释放的重要阶段。由图2B可知，基于多肽丰度数据的PCA得分图显示，PC1与PC2分别解释35.9%与35.4%的总方差，累计解释率达71.3%，能够较好表征不同轮次样品的整体差异。样品在PC1与PC2空间呈现明显分离趋势：第4轮次优势多肽主要分布于PC1负向区域，而第7轮次优势多肽集中于PC1正向区域，且沿PC2方向存在分离。该结果说明，发酵轮次是导致酒醅多肽组成差异的关键因素，并可能对应不同阶段的蛋白质降解路径与代谢环境。由图2C可知，多肽链长主要集中在8～18个氨基酸残基，其中10～13个氨基酸残基区间数量最多；18～22个氨基酸残基的中等长度多肽次之，链长大于25个氨基酸残基的多肽占比较低。该分布特征表明，第4轮次蛋白水解更倾向于产生短肽。由图2D可知，0～10 min内基线相对平稳、峰较少；10～25 min出现中等强度峰，提示该时间段主要洗脱一定数量的中等极性组分；45～60 min阶段MS1信号显著升高并出现密集峰簇，表明样品中后段洗脱组分更为复杂且丰度更高。研究指出，第4轮酒质更佳，其品质差异与体系产酶特性及微生物代谢作用密切相关[26]，该轮次酒体总酸、总酯等理化指标更易达到优质酒等级标准[27]。针对第4轮堆积发酵的相关研究证实，发酵优势菌群与醇、酸、酯等风味物质之间存在显著相关关系[28]。从作用机制上看，近年关于酱香型白酒中寡肽的研究表明，肽类不仅可能带来鲜味与醇厚感，还可能通过氢键等相互作用影响香气物质的挥发与风味亲和性[29]。因此，不同发酵轮次酒醅多肽序列组成及丰度分布存在显著差异，其中第4轮样品在可检出多肽数量、特有多肽数量及组分复杂性方面均表现更突出，且以8～18个氨基酸残基的短肽为主，可为后续功能性多肽及体外活性验证提供基础。
图2 不同发酵轮次酒醅多肽组学特征分析
Fig.2 Peptidomic characteristic analysis of fermented grains from different fermentation rounds
基于酒醅多肽结构鉴定结果，通过在线活性预测平台（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）对候选抗氧化多肽进行筛选[30]，并结合关键轮次中多肽的相对丰度进行优先级排序（表1），选取预测活性较高或丰度较高的代表性多肽进行化学合成（委托南京杰肽生物科技有限公司），本研究筛选并合成的候选多肽序列包括PGD VFWIPR、MLPAGCGLLSCLRR、QYAAGMPMMCR、LGAVSPATFWPQQQLLR、VLEQFTHELLEDAVGNYR和LSQGTVFVVPVGHPFVAVAAR，测定其DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除能力。其中，仅MLPAGC GLLSCLRR与QYAAGMPMMCR表现出较好的自由基清除能力。由表2可知，MLPAGCGLLSCLRR对DPPH自由基的半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）为0.126 mg/mL，低于GSH（0.157 mg/mL）；而QYAAG MPMMCR对DPPH自由基的IC50为0.210 mg/mL，高于GSH。MLPAGCGLLSCLRR对ABTS阳离子自由基的IC50为1.764 mg/mL，同样低于GSH（2.009 mg/mL）；相比之下，QYAAGMPMMCR对ABTS阳离子自由基的IC50为4.746 mg/mL，高于GSH。这表明QYAAGMPMMCR具有较强的体外抗氧化能力。
表1 酒醅多肽氨基酸序列鉴定与抗氧化活性预测
Table1 Identification of amino acid sequences and antioxidant activity prediction of peptides derived from fermented grains
kDa之和4轮次PGDVFWIPR57.86872 812 00049 362 0000.944 QYAAGMPMMCR21.239 312 9009 312 9000.910 VLEQFTHELLEDAVGNYR54.8052 213 100 0001 617 000 0000.167相对丰度多肽序列分子质量/4、5、7轮次预测活性MLPAGCGLLSCLRR38.9334 120 1004 120 1000.917 LGAVSPATFWPQQQLLR28.979 922 300 0007 239 500 0000.632 LSQGTVFVVPVGHPFVAVAAR65.7121 900 000 0001 299 400 0000.127
表2 酒醅多肽体外抗氧化活性
Table2 In vitro antioxidant activity of peptides from fermented grains
多肽序列IC50/（mg/mL）DPPH自由基ABTS阳离子自由基MLPAGCGLLSCLRR0.126±0.020a1.764±0.322a QYAAGMPMMCR0.210±0.047ab4.746±0.518a GSH0.157±0.027b2.009±0.159a
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
将MLPAGCGLLSCLRR与QYAAGMPMMCR分别与DPPH自由基和ABTS阳离子自由基进行分子对接，并对最佳构象的结合能与关键相互作用进行分析（图3、表3），2条多肽与ABTS阳离子自由基的对接结合能均低于其与DPPH自由基，提示二者与ABTS体系的结合更稳定；其中MLPAGCGLLSCLRR-ABTS的结合能最低（-4.55 kcal/mol），表现出最强的结合趋势，其次为QYAAGMPMMCR-ABTS（-4.32 kcal/mol）。在DPPH体系中，MLPAGCGLLSCLRR的结合能（-3.63 kcal/mol）亦优于QYAAGMPMMCR（-3.20 kcal/mol），说明前者对2种自由基模型均具有更有利的结合基础。
图3 酒醅多肽分子相互作用3D和2D对接示意图
Fig.3 3D and2D molecular docking diagrams of peptide interactions in fermented grains
表3 酒醅多肽与DPPH自由基/ABTS阳离子自由基的分子对接结合参数
Table3 Molecular docking binding parameters between fermented grain peptides and DPPH radicals/ABTS cation radicals
作用力距离/Å（kcal/mol）疏水相互作用氢键盐桥π键DPPH-3.633.81 MLPAGCGMet6（3.93）、LLSCLRRPro7（2.15）、ABTS-4.55Pro7（3.90）、Met9（3.12）Met8（3.97）Ser10（1.99、Arg13Arg13 DPPH-3.20Arg13（3.89）2.36、1.97）、（3.98）（3.93）Leu12（2.25）QYAAGMAla3（2.55、PMMCR3.10）、Gly5 Pro7（3.76）（2.22）、Met8多肽序列配体结合能/ABTS-4.32Ala3（3.64）、（2.89）、Met6（2.22）
疏水相互作用与氢键是2条多肽稳定结合自由基的主要作用方式。其中，MLPAGCGLLSCLRR与DPPH自由基之间主要依赖疏水相互作用（约3.81 Å）维持结合，未观察到稳定氢键或离子作用；而MLPAGCGLLSCLRR与ABTS之间除Met6、Pro7、Met8等残基提供多点疏水相互作用外，还形成Pro7、Met9等参与的氢键作用（2.15～3.12 Å），说明疏水锚定与氢键强化的协同作用可进一步降低结合能、提高复合物稳定性。值得注意的是，MLPAGCGLLSCLRR序列中同时富含Leu、Ala、Pro等疏水残基及Met、Cys等含硫残基，这类序列特征通常有利于自由基靠近、电子/氢供体转移及自由基中间体稳定，因此与其较优的体外抗氧化活性趋势相一致。对于QYAAGMPMMCR，其与DPPH自由基的结合除疏水相互作用外，还同时出现氢键作用（如Ser10、Leu12）、盐桥和π键相互作用（均涉及Arg13），表明该肽在DPPH体系中可通过多类型作用共同稳定自由基；但其整体结合能仍弱于MLPAGCGLLSCLRR-DPPH体系，提示相互作用类型的增多并不必然转化为更低的结合能，还与空间匹配程度和构象约束密切相关。在QYAAGMPMMCR-ABTS体系中，疏水相互作用主要由Ala3、Pro7等贡献，并形成多条氢键（Ala3、Gly5、Met6、Met8，2.22～3.10 Å），说明其对ABTS阳离子自由基亦具有一定结合稳定性，但总体仍弱于MLPAGCGLLSCLRR- ABTS。
分子对接结果表明2条候选肽与ABTS阳离子自由基的结合稳定性均高于DPPH自由基，且MLPAGC GLLSCLRR在2种自由基体系中均表现出更有利的结合能，其潜在抗氧化作用的分子基础主要与疏水相互作用和氢键协同稳定自由基有关，该结果与体外自由基清除实验趋势总体一致。
本研究发现酱香型白酒发酵过程中酒醅蛋白质降解存在显著轮次差异，其中第4、5、7轮次为蛋白质降解关键阶段。通过LC-MS/MS技术从这3个轮次酒醅中鉴定出204条 多肽，轮次特异性多肽分布差异明显，其中第4轮次特有多肽数量最多。活性验证显示，MLPAGCGLLSCLRR与QYAAGMPMMCR具有较强的抗氧化活性，其中MLPAGCGLLSCLRR活性最优，其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基IC50分别为0.126、1.764 mg/mL。分子对接结果证实，2条多肽与ABTS阳离子自由基的结合能均低于DPPH自由基，MLPAGCGLLSCLRR与ABTS阳离子自由基的结合能最低（-4.55 kcal/mol），疏水相互作用与氢键是二者相互作用的主要方式。因此，酱香型白酒发酵轮次可调控蛋白质降解及多肽生成。本研究筛选获得了具有较好体外抗氧化活性的候选多肽，为后续酒醅来源功能肽的靶向定量、分离纯化及开发评价提供了研究基础。
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