±s表示。Mutagenic Breeding of Low-Glycerol and High-Ethanol Producing Saccharomyces cerevisiae with Tolerance to Sugarcane Molasses Stress and High Temperature
LIAO Shuqiang, LIAO Bei, ZHENG Ping, et al. Mutagenic breeding of low-glycerol and high-ethanol producing Saccharomyces cerevisiae with tolerance to sugarcane molasses stress and high temperature[J]. China Brewing, 2026, 45(6):24-28. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.004. http://www.chinabrewing.net.cn
“十五五”规划已经将绿色生物制造、低能减排作为我国后续发展的重点支持目标之一[1-2]。以甘蔗糖蜜等非粮原料生产燃料乙醇，对于保障国家能源安全、促进农业副产物高值化利用及减少碳排放具有战略意义。虽然基于糖蜜的乙醇发酵技术已取得长足进步[3-4]，如通过细胞固定化技术（包埋法[5]、吸附法[6]、共价结合法[7]及交联法[8]）增强菌体对糖蜜中抑制物的耐受性，或采用煮沸、加入吸附剂及加酸等多种物理化学方法对糖蜜进行预处理以降低其毒性[9-12]等，均能有效提高乙醇合成，但这些方法在工业放大时仍面临明显瓶颈。固定化过程复杂，可能导致细胞活性损失并增加生产成本；而糖蜜预处理工艺繁琐、能耗与化学品消耗高，经济性与环境友好性欠佳。此外，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的最适生长温度一般在28～30 ℃范围内，在大型工业发酵罐中，由于微生物代谢热积累及机械搅拌生热，罐内温度常升至35 ℃以上，尤其在夏季或热带地区。为维持最适发酵温度，工厂需耗费大量电能用于冷却，显著增加生产成本与碳足迹[13-15]。因此，选育能够耐受高温（如34～37 ℃）且能够高效利用高浓度糖蜜的酵母菌株，是从源头上降低能耗、简化工艺、提升工业效益的关键途径。
常压室温等离子体（atmospheric room-temperature plasma，ARTP）诱变技术具有突变率高、操作简便、安全性好等优点，已在工业微生物育种中展现出强大潜力[16-18]。然而，ARTP诱变具有随机性，如何从海量突变体中快速、准确筛选出目标性状得到改善的少数个体，是育种成功与否的核心。本研究团队前期曾建立基于2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（反映细胞脱氢酶活性）与Py-Fe3+（反映丙酮酸积累）的高通量筛选方法，用于高产乙醇菌株选育[19]。然而，在工业乙醇生产中，副产物甘油的含量也是一项重要经济指标[20-21]。甘油合成的直接前体是糖酵解中间产物磷酸二羟丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）[22-23]，其在发酵液中的过度积累更意味着碳源从乙醇合成主途径（糖酵解-丙酮酸-乙醇）的分流，直接导致乙醇得率下降[23-24]。因此，通过遗传改造或诱变筛选降低酵母菌的甘油合成通量，理论上可迫使更多的碳流导向乙醇合成，从而实现“减副增产”目标。Kuhn等[25]早期建立的高碘酸钠显色法可用于快速测定发酵液中的甘油含量，且不受培养基中常见离子及甲醇等物质干扰，但该方法以往多用于高产甘油菌株筛选或甘油定量分析，鲜见报道应用于以高浓度、成分复杂的糖蜜为发酵底物时，低产甘油酵母菌株的高通量定向筛选。
基于此，本研究创新性地将高碘酸钠法反向应用于低产甘油突变体筛选。以酿酒酵母A9为出发菌株，首先利用ARTP对出发菌株进行多轮诱变，并结合在递增糖蜜质量浓度与温度下的适应性进化，构建遗传多样性丰富且环境耐受性提升的突变文库。随后，联合应用TTC平板初筛与高碘酸钠微孔板复筛，从突变文库中筛选甘油产量显著降低、乙醇产量同步提高的优良突变菌株。
酿酒酵母A9保藏于广西科技大学发酵工程研究所。
蔗糖 广西糖业集团柳兴制糖有限公司；甘蔗糖蜜安琪酵母股份有限公司。
氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、硫酸镁、氯化钙、尿素、乙酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；TTC、高碘酸钠、乙酸铵（均为分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯） 成都市诺尔施科技有限责任公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
种子培养基[10]：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L；糖蜜培养基[10]：糖蜜（按需添加）、尿素0.05 g/L、乙酸0.86 054 g/L；模拟糖蜜环境培养基[10]：蔗糖300 g/L、氯化钾15 g/L、氯化钙8 g/L、Na2HPO4∙7H2O 12.8 g/L、KH2PO4 3.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、MgSO4∙7H2O 0.25 g/L、CaCl2∙6H2O 0.025 g/L；发酵培养基[10]：糖蜜395 g/L、尿素0.05 g/L、乙酸0.860 54 g/L；TTC底层培养基[19]：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、琼脂粉20 g/L，pH自然；TTC上层培养基[19]： 葡萄糖5 g/L、琼脂粉20 g/L、TTC 0.5 g/L（灭菌后冷却至55 ℃左右加入混匀）。以上培养基均在115 ℃条件下高压蒸汽灭菌20 min。
Synergy H1型酶标仪 美国安捷伦科技有限公司；H2100R型低温高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；L2000型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 日立科学仪器有限公司；456-GC型气相色谱（gas chromatography，GC）仪 天美创科仪器（北京）有限公司；ZWYR-C2402C型叠式恒温调速摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司；ATRP-M型ATRP诱变仪 中山天木科技有限公司；BX43F型显微镜 奥林巴斯（中国）有限公司。
1.3.1 ARTP诱变及适应性进化育种
将酿酒酵母A9单菌落接种至种子培养基中，30 ℃、200 r/min培养12 h，取5 mL菌液离心（12 000 r/min、5 min），收集菌体，使用无菌水洗涤3次后，进行ATRP诱变[26]。ATRP诱变参数：射频功率输入100 W，氦气流量10 SLM，等离子炬喷嘴出口与载片之间距离为2 mm，诱变时间分别为60、80、100、120、140、160、180、200 s。诱变后使用无菌水冲洗所有载片上的菌体，得到ATRP突变文库。将突变菌株转移至15 mL糖蜜培养基，34 ℃、200 r/min培养24 h，以10%接种量接种至新鲜糖蜜培养基进行传代一次，显微镜下检测活菌数，待活菌数稳定后，再进行诱变及传代，逐步增加糖蜜质量浓度和温度，第1次诱变后培养条件为500 g/L糖蜜、34 ℃， 第2次诱变后培养条件为600 g/L糖蜜、34 ℃，最终培养条件为600 g/L糖蜜、37 ℃。
1.3.2 低产甘油、高产乙醇突变菌株筛选
初筛：利用无菌水将酿酒酵母突变文库中活菌数稀释至80 CFU/mL，将稀释液均匀涂布在TTC底层培养基上，30 ℃培养36 h，缓慢倒入TTC上层培养基，30 ℃培养5～10 min，期间观察平板显色情况，挑取显色较快和显色较深的诱变菌株形成初筛菌库。
复筛：将初筛菌库中的菌株分别挑入48深孔培养板（含有2 mL模拟糖蜜环境培养基）中，37 ℃、200 r/min 培养48 h，静止1 h，待菌体全部沉淀后，取40 µL上清液和40 µL溶液1（以20 mL 10%乙酸溶解1.8 g高碘酸钠，然后采用80 mL无菌水溶解7.7 g乙酸铵，按体积1∶4混合）混匀，37 ℃孵育10 min，再加入125 µL溶液2（以异丙醇配制1%乙酰丙酮），37 ℃孵育5 min，常温条件 下9 000 r/min离心1 min，取100 µL上清液，利用酶标仪在410 nm波长处测定光密度值（OD410 nm）。选择9株OD410 nm值小的菌株进行摇瓶发酵。
1.3.3 甘油及乙醇产量的测定
将复筛得到的菌株接种至20 mL种子培养基，37 ℃、200 r/min条培养12 h，以17.5%接种量接种至50 mL发酵培养基，37 ℃、200 r/min条件下发酵，每隔12 h取样测定乙醇含量，发酵24 h时取样测定甘油含量。
发酵液经12 000 r/min离心2 min，取上清液，经0.45 μm 尼龙针头过滤器过滤，采用HPLC仪测定甘油产量[27]。HPLC条件：NH2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（85∶15，V/V），流速1 mL/min，柱温30 ℃，示差检测器温度30 ℃，进样量1 mL/min。定性定量：根据保留时间定性，通过外标法定量。
发酵液经12 000 r/min离心5 min，取上清液，利用GC仪测定乙醇产量[10]。GC条件：TM-1毛细管色谱柱（25 m×0.53 mm，1 μm），进样口温度200 ℃、载气为高纯N2，载气流速1 mL/min，升温程序为初始温度40 ℃，以8 ℃/min升温至80 ℃，持续5 min，再以7 ℃/min升温至150 ℃，持续10 min。定性定量：根据保留时间定性，通过外标法定量。
所有实验重复3次，采用OriginPro v9.0软件处理数据，结果用±s表示。
由图1可知，经过3轮ARTP诱变及高质量浓度糖蜜、高温胁迫后，酵母活菌数下降，但经过多代驯化后活菌数趋于稳定，最终活菌数达到6.48×107 CFU/mL。高质量浓度糖蜜、高温胁迫这一过程模拟了工业化生产中可能遇到的极端环境，成功筛选出兼具高糖蜜耐受性与耐高温特性的基础菌群，为低产甘油酵母菌株的筛选提供了高质量的突变文库。
图1 酿酒酵母A9在ARTP诱变与适应性进化过程中的活菌数
Fig.1 Viable cell count ofS. cerevisiaeA9duringARTP mutagenesis and adaptive evolution
2.2.1 基于TTC法初筛
TTC是一种无色化合物，可被活细胞内的脱氢酶还原为不溶于水的红色甲臜并沉淀在细胞周围，细胞代谢活性越强，脱氢酶活性越高，显色越快、颜色越深[28]。 基于此，采用TTC法初筛生长活性较高的菌株。由图2可知，将突变文库涂布于TTC底层培养基生长后，覆盖含有TTC的上层培养基中，不同菌落呈现出深浅不一的红色，从中快速挑取500个显色快且颜色较深的菌落，认为这些菌株具有较高的基础代谢活力，是高产乙醇的潜在候选菌株。
图2 TTC平板法初筛高生长活性突变菌株
Fig.2 Primary screening of high-growth-activity mutant strains by TTC plate method
2.2.2 基于高碘酸钠法复筛
将初筛获得的500株突变菌株分别接种于48深孔板中进行微型发酵，测定发酵液OD410 nm值，OD410 nm值越低，表明发酵液中甘油含量越低。由图3可知，不同突变菌株的OD410 nm值分布广泛，证实突变文库在甘油合成表型上的多样性。从中选取OD410 nm值最低的9株菌株（编号C39、E21、E40、G9、G33、H48、J22、K36、K40）作为低产甘油的候选优势菌株。
图3 基于高碘酸钠法复筛低产甘油突变菌株
Fig.3 Secondary screening oflow-glycerol-yield mutant strains by sodium periodate method
以出发菌株A9为对照，对9株候选菌株进行摇瓶发酵实验，测定其甘油与乙醇产量。由图4A可知，发酵24 h后，所有突变菌株的甘油产量均低于出发菌株A9，但降低幅度各异。其中，突变菌株E40和K36表现较为突出，甘油产量分别为10.40、11.00 g/L，相较出发菌株A9分别下降27.56%、23.35%。甘油产量的降低意味着糖酵解通量可能更多地由DHAP节点导向目标产物乙醇的合成途径。由图4B可知，在37 ℃条件下，与对照A9菌株相比，突变菌株E40和K36乙醇合成能力更为突出，尤其是在发酵前24 h，即对数生长期和产物快速合成期，两者的乙醇积累速率明显快于出发菌株A9。发酵24 h时，突变菌株E40和K36的乙醇产量最高，分别为93.92、94.42 g/L，分别比出发菌株A9高8.04%和7.46%。结果表明，突变菌株E40和K36不仅通过降低甘油分流节约碳源，其整体糖代谢通量和乙醇合成关键酶活性也得到增强和优化。在酿酒酵母中，甘油合成是细胞应对渗透压胁迫、氧化还原平衡的重要途径[29]。突变菌株E40和K36在甘油产量大幅降低的同时，依然能在高渗、高温的糖蜜培养基中良好生长并高产乙醇，暗示其可能通过其他机制（如细胞膜组成改变、海藻糖积累、氧化应激系统增强等）适应环境压力，或其糖酵解通量足够大，以至于即使甘油分流比例减小，仍能提供足够的还原力平衡，其具体的分子机制有待通过基因组学、转录组学等进行深入解析。
图4 出发菌株及筛选菌株的甘油（A）及乙醇（B）产量
Fig.4 Glycerol(A) and ethanol(B) production by the wild-type strain and the screened mutant strains
本研究成功构建一套高效、定向的复合筛选体系，并利用该体系从ARTP诱变及适应性进化获得的酿酒酵母突变文库中选育出2株性能优异的突变株E40和K36。这 2株菌在高质量浓度甘蔗糖蜜（395 g/L）、37 ℃胁迫条件下表现出甘油产量显著降低（24 h后分别降低27.56%、23.35%）和乙醇产量显著提高（24 h后分别提升8.04%和7.46%）的优良特性，综合性能满足进一步中试生产的要求。本研究不仅为燃料乙醇工业提供了具有应用潜力的候选菌种，所建立的“活力初筛-副产物复筛”组合筛选策略也为工业微生物的定向育种提供了可借鉴的方法学框架，对于推动生物制造过程的绿色化、高效化和低碳化发展具有重要意义。
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