表1 黄菊花液发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table1 Factors and levels ofBox-Behnken experimental design for fermentation process optimization of yellow chrysanthemum liquid
因素水平-101 A乳酸菌接种量/（mg/g）102030 B发酵温度/℃323742 C发酵时间/h51015 D葡萄糖添加量/%102030
Fermentation Process Optimization, Antioxidant Activity and Differential Metabolites of Chrysanthemum morifolium Liquid
HE Xin, HUANG Wanyi, Ruan Yuxun, et al. Fermentation process optimization, antioxidant activity and differential metabolites of Chrysanthemum morifolium liquid[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 222-230. (in Chinese with English abstract)DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.028. http://www.chinabrewing.net.cn
菊花是菊科菊属多年生草本植物，其富含黄酮、多酚等多种活性成分，如花色素、绿原酸、菊苷、菊花萜二醇等[1]，具有散风清热、平肝明目、杀菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等作用[2]。此外，菊花还含有脂肪酸、脂肪醇类、少量蒽醌类等活性成分，对多种致病微生物具有抑制活性。
现代医学研究表明，菊花具有一定药用价值。在菊花的诸多功效中，以其较强的抗氧化活性最为突出，而抗氧化是延缓衰老的重要作用机制，能够保护细胞免受氧化损伤。严亦慈等[3]于1999年率先开展菊花抗氧化相关研究，发现菊花中的槲皮素凭借独特分子结构，可作为高效自由基捕获剂，显著提升机体抗氧化防御能力。菊花中的黄酮类物质同样具备较强抗氧化活性，范三红等[4-5]通过优化菊花黄酮提取工艺，探究其抗氧化作用机制。Zhong Lijie[6]、郑曌钰[7]等采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除法测定30批次杭白菊花样品黄酮提取物的抗氧化活性，结果表明，菊花具备较强的抗氧化活性。乳酸菌在食品发酵体系中占据核心地位。经其发酵作用，不仅可代谢生成有机酸、酯类等风味物质，改善产品感官品质；还能产生短链脂肪酸、胞外多糖等生物活性成分[8]，进而对宿主代谢健康发挥积极调节作用，如改善胰岛素敏感性、维持肠道屏障功能等[9]。因此，乳酸菌发酵既是食品加工的重要手段，也是功能性食品开发与代谢性疾病干预研究的重要方向。嗜酸乳杆菌JYLA-126可通过肠道-肝脏轴激活腺苷酸活化蛋白激酶信号通路，从而改善肥胖及多囊卵巢综合征相关糖脂代谢紊乱[10]。植物乳杆菌属也被证实具有降胆固醇、改善非酒精性脂肪肝的潜力。在菊花发酵及其产品领域，刘改改等[11]分析不同品种菊花原料中抗氧化和抗炎成分的化学结构与含量；贠宣[12]探究万寿菊花发酵前后差异性成分，同时提出此类化合物对抗氧化活性提升的影响；刘敏杰等[13]揭示不同发酵菌种处理对中草药酵素品质及抑菌效果的影响，其中乳酸菌发酵制备的中草药酵素产品品质最好，抗氧化活性提升较高。
本研究以鲜黄菊花为原料，利用乳酸菌发酵，根据文献[14]初步选用植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）JYLP-375（LP）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）JYLA-126（LA）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）JYLB-19（LB）3种乳酸菌，分别以不同比例对黄菊花液进行发酵，筛选出最能提升抗氧化活性的菌种组合，再以发酵液总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）为指标，通过单因素及响应面试验对黄菊花液发酵工艺进行优化。在此基础上利用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）对黄菊花发酵液与未发酵液中酚类进行定性定量，对比发酵前后成分变化对其抗氧化活性的影响，旨在为黄菊花发酵液抗氧化能力的提升机制及发酵后物质变化研究提供参考。
黄菊花产自安徽亳州。植物乳植杆菌JYLP-375、嗜酸乳杆菌JYLA-126、保加利亚乳杆菌JYLB-19 本实验室保存；甲醇（色谱纯） 德国Merck公司；乙腈（色谱纯） 上海星可高纯溶剂有限公司；甲酸（色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；T-AOC测定试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司；2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力试剂盒、DPPH自由基清除能力试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；L-2-氯苯丙氨酸（纯度98%） 北京百灵威科技有限公司。
5424R离心机、Research plus移液器 德国Eppendorf公司；LE104E/02电子分析天平、MU-G02-0448恒温金属混匀仪 杭州米欧仪器有限公司；MS105DM十万分之一电子天平 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；CentriVap离心浓缩仪 美国Labconco公司；VORTEX-5涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；KQ5200E超声清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；Mini HES封膜仪 莫纳生物科技有限公司；UV-5500紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；博科BKQ-B75II高压灭菌锅 济南久祥生物技术有限公司；HH-2恒温水浴锅 天津市静海区赛得利斯实验分析仪器制造厂；DL-5M低速离心机 上海悦丰仪器仪表有限公司。
1.3.1 黄菊花发酵液的制备
选取无破损与腐烂、健康完整的安徽毫州大黄菊花，在烘箱内70 ℃烘干48 h并研磨成粉，装入锥形瓶中，按照1∶30（g/mL）的料液比用蒸馏水浸泡24 h，同时加入一定质量分数的葡萄糖，摇匀后，置于高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，冷却后接入不同比例和不同种类的菌种，放入一定温度的恒温培养箱中发酵一定时间，发酵后可得黄菊花发酵液，4 000 r/min离心15 min，取上清液待测。
1.3.2 发酵菌种的筛选
按照1.3.1节方法，分别考察LA、LP、LB、LA∶LB（1∶1、1∶2、2∶1）、LA∶LP（1∶1、1∶2、2∶1）、LB∶LP（1∶1、1∶2、2∶1）、LA∶LB∶LP（1∶1∶1）对黄菊花液发酵后T-AOC的影响。
1.3.3 黄菊花液发酵工艺优化
1.3.3.1 单因素试验
采用单因素轮换法，在菌种筛选结果基础上，分别考察发酵温度（27、32、37、42、47 ℃）、菌种接种量（10、20、30、40、50 mg/g）、发酵时间（5、10、15、20、25、30 h）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL）、葡萄糖添加量（0%、10%、20%、30%、40%，以烘干黄菊花粉质量计）对黄菊花液发酵后T-AOC的影响。
1.3.3.2 响应面试验
在单因素试验结果基础上，以菌种接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、葡萄糖添加量（D）为自变量，以T-AOC（Y）为响应值进行Box-Behnken试验设计，试验因素与水平见表1。
表1 黄菊花液发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table1 Factors and levels ofBox-Behnken experimental design for fermentation process optimization of yellow chrysanthemum liquid
因素水平-101 A乳酸菌接种量/（mg/g）102030 B发酵温度/℃323742 C发酵时间/h51015 D葡萄糖添加量/%102030
1.3.4 T-AOC测定
按照试剂盒使用说明进行T-AOC测定。
1.3.5 黄菊花发酵前后抗氧化活性测定
1.3.5.1 ABTS阳离子自由基清除率
采用20 mmol/L醋酸溶液（pH 4.5）和ABTS试剂制备7.0 mmol/L ABTS阳离子自由基贮液，取5 mL ABTS阳离子自由基贮液与5 mL 2.45 mmol/L K2S2O8（蒸馏水溶解）混合，室温避光反应12～16 h，使用前进行稀释，使其在734 nm波长处的吸光度为0.70±0.02，得到ABTS阳离子自由基工作液。取100 μL最佳条件下制备的黄菊花发酵液样品，加入900 μL ABTS阳离子自由基工作液，室温条件下避光反应60 min。测定其吸光度（Ai）。同时，取100 μL最佳条件下制备的黄菊花发酵液样品，加入900 μL蒸馏水，室温避光反应60 min，测吸光度（Aj）；取100 μL蒸馏水，加入900 μL ABTS阳离子自由基工作液，室温避光反应60 min，测吸光度（A0）。以VC为阳性对照[15]。ABTS阳离子自由基清除率按式（1）计算：
1.3.5.2 DPPH自由基清除率
取400 μL 2×10-4 mol/L DPPH-乙醇溶液与400 μL最佳条件下制备的黄菊花发酵液样品混合均匀，室温条件下避光反应30 min，7 000 r/min离心5 min，取上清液于517 nm波长处测定吸光度（Ai）。同时，取400 μL DPPH-乙醇溶液，加入400 μL乙醇，517 nm波长处测定吸光度（A0）；取400 μL样品溶液，加入400 μL乙醇，517 nm波长处测定吸光度（Aj）。以VC为阳性对照[16]。DPPH自由基清除率按式（1）计算。
1.3.6 黄菊花未发酵液与发酵液酚类代谢物分析
利用UPLC-MS/MS对黄菊花发酵液与未发酵液中的酚类代谢物进行定性定量分析[17]。
从-80 ℃冰箱中取出黄菊花液（未发酵）样品与最佳条件下制备的黄菊花发酵液样品，解冻，涡旋10 s混匀。取样本200 μL加入对应的已编号的1.5 mL离心管中，加入200 μL 250 μg/mL L-2-氯苯丙氨酸内标溶液（溶于70%甲醇），涡旋15 min，4 ℃、12 000 r/min离心3 min，移取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，保存于进样瓶中，用于UPLC-MS/MS检测。
SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）；流动相A为超纯水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含0.1%甲酸）；洗脱梯度：0.00 min，5% B，9.00 min内 B相线性增加至95%，维持1 min，10.00～11.10 min， 5% B，平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。
实验均进行3次重复，采用Origin 8.0绘图，Design Expert 13.0进行响应面试验数据处理和统计分析，并用SPSS 25.0进行Pearson相关性及显著性分析。
由图1可知，LA与LB混合发酵时，黄菊花发酵液抗氧化能力最好，添加比例为1∶1、1∶2、2∶1时其T-AOC差别不大，分别为71.89、70.46、71.46 U/mL。因此选取LA∶LB＝1∶1为后续黄菊花液发酵工艺优化的菌种添加比例。
图1 不同菌种发酵黄菊花液T-AOC
Fig.1 T-AOC of yellow chrysanthemum liquid fermented by different strains
2.2.1 乳酸菌接种量对黄菊花发酵液抗氧化能力的影响
由图2可知，随着菌种接种量在10～50 mg/g范围内增加，黄菊花发酵液抗氧化能力呈先上升后下降的趋势。菌种接种量为20 mg/g时，黄菊花发酵液T-AOC达到最高，为64.23 U/mL。继续增加菌种接种量，黄菊花发酵液的抗氧化能力逐渐下降。其原因可能是接种量过低导致发酵速率降低，发酵环境也更易被有害菌污染，延缓抗氧化物质的生成；而接种量过高又会加快菌种生长代谢，使溶氧匮乏，反而限制抗氧化物质的生成[18]。因此，选择最佳乳酸菌接种量为20 mg/g。
图2 不同菌种添加量对黄菊花发酵液T-AOC的影响
Fig.2 Effect of different strain addition amounts on T-AOC of yellow chrysanthemum fermentation liquid
2.2.2 发酵温度对黄菊花发酵液抗氧化能力的影响
由图3可知，发酵温度为27～37 ℃时，黄菊花发酵液的抗氧化活性逐渐上升；当发酵温度为37 ℃时，T-AOC最大，为63.66～64.58 U/mL；发酵温度高于37 ℃后，黄菊花发酵液的抗氧化活性逐渐降低。这是由于在过低温度条件下，微生物代谢被限制，代谢速率减慢，从而导致发酵效率降低；而发酵温度过高，菌种酶活性被抑制，从而导致微生物的生长代谢受限[19]。因此，选择黄菊花发酵液的最佳发酵温度为37 ℃。
图3 不同发酵温度对黄菊花发酵液T-AOC的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperatures on T-AOC of yellow chrysanthemum fermentation liquid
2.2.3 发酵时间对黄菊花发酵液抗氧化能力的影响
由图4可知，发酵时间为5～10 h时，黄菊花发酵液的T-AOC逐渐升高；当发酵时间为10 h时，黄菊花发酵液的T-AOC达到最大，为63.75 U/mL；发酵时间为10～30 h时，黄菊花发酵液的抗氧化活性逐渐降低。这是因为适当延长发酵时间可促进黄菊花液发酵；但发酵时间过长，会造成可用碳源不足，乳酸菌营养物质匮乏，降低了黄菊花液的发酵效率[20]。因此，选择最佳发酵时间为10 h。文献[11]研究表明，以总酸为发酵评价指标时，乳酸菌植物发酵产物的最适发酵时间约为24 h，但发酵前期，微生物产生的纤维素酶、β-葡萄糖苷酶可能会破坏植物细胞壁，导致原本结合在细胞壁上的抗氧化物质被释放出来，或将大分子分解为抗氧化活性更强的小分子。因此，以T-AOC为评价指标时，黄菊花发酵液最适发酵时间较短。
图4 不同发酵时间对黄菊花发酵液T-AOC的影响
Fig.4 Effect of different fermentation times on T-AOC of yellow chrysanthemum fermentation liquid
2.2.4 料液比对黄菊花发酵液抗氧化能力的影响
由图5可知，随着料液比的降低，黄菊花发酵液的抗氧化能力呈先升高后降低的趋势。料液比为1∶20（g/mL） 时，黄菊花发酵液的T-AOC达到最大，为74.18 U/mL；黄菊花发酵液的抗氧化能力存在浓度依赖性，发酵液越浓，其抗氧化能力越强[21]。料液比过高时，菊花中的有效成分不能充分析出，故在1∶10的料液比下其T-AOC低于1∶20。因此，选择最佳料液比为1∶20（g/mL）。
图5 不同料液比对黄菊花发酵液T-AOC的影响
Fig.5 Effect of different solid-liquid ratios on T-AOC of yellow chrysanthemum fermentation liquid
2.2.5 葡萄糖添加量对黄菊花发酵液抗氧化能力的影响
由图6可知，随着葡萄糖添加量在0%～40%范围内的升高，黄菊花发酵液的T-AOC呈现先上升后下降的趋势。当葡萄糖添加量为0%～20%时，黄菊花发酵液T-AOC随之升高；当葡萄糖添加量为20%时，T-AOC最高，为83.31 U/mL；当葡萄糖添加量超过20%后，黄菊花发酵液T-AOC有所下降。糖度过低，微生物生长代谢速率放缓，菌种繁殖受抑，无法为微生物增殖提供充足碳源；而糖度过高不仅易造成微生物菌体早衰，还会使发酵液渗透压升高，抑制乳酸菌合成抗氧化活性物质，最终导致黄菊花发酵液抗氧化能力下降[22]。因此，选择最佳葡萄糖添加量为样品添加量的20%。
图6 不同葡萄糖添加量对黄菊花发酵液T-AOC的影响
Fig.6 Effect of different glucose addition amounts on T-AOC of yellow chrysanthemum fermentation liquid
2.3.1 Box-Behnken试验设计和模型拟合
在单因素试验结果的基础上，以菌种接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、葡萄糖添加量（D）为自变量，以T-AOC（Y）为响应值，采用响应面法优化黄菊花发酵液的发酵工艺，Box-Behnken试验设计及结果见表2。
表2 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果
Table2 Design and results of the Box-Behnken test for fermentation process optimization
1100071.562000083.374-1-10065.55600-1070.6011-100165.0613000084.48190-10165.12211-10067.4823-10-1069.5724010166.132600-1162.5428-110070.9629101071.34试验号ABCDY/（U/mL）310-1068.335000082.517010073.688001166.659000082.1410110069.791201-1069.06140-1-1065.5415001070.32160-11064.3417-101069.5518000082.96200-10067.5222011069.8925-100070.9627100167.01
使用Design Expert 13.0对表2数据进行二次回归拟合，获得回归方程：Y＝83.090 0+0.321 8A+2.000 0B-0.538 1C-2.680 0D-0.775 0AB-0.756 7AC+0.337 1AD+0.507 5BC-1.290 0BD+1.100 0CD-6.420 0A2-7.940 0B2-7.600 0C2-7.680 0D2。
由表3可知，模型P＜0.000 1，极显著；失拟项P＝0.517 3＞0.05，表明实际结果与回归模型之间具有良好的拟合度；决定系数R2＝0.988 9，表明预测值与测定值拟合度较好；调整决定系数
，表明该回归模型可以反映响应值97.78%的变化。F值越大，说明各因素对黄菊花发酵液T-AOC的影响越强，由F值可知，各因素对黄菊花发酵液T-AOC的影响程度为：葡萄糖添加量（D）＞发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞菌种接种量（A）。由P值可知，回归模型中一次项B、D，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；交互项BD、CD对结果影响显著（P＜0.05）；一次项A、C，交互项AB、AC、AD、BC对结果影响均不显著（P＞0.05）。
表3 回归模型方差分析
Table3 Analysis of variance for the regression model
方差来源自由度平方和均方FP显著性模型141 075.9676.8589.29＜0.000 1**A11.241.241.440.249 5 B147.8147.8155.54＜0.000 1**C13.473.474.040.064 2 D185.9985.9999.91＜0.000 1**AB12.402.402.790.117 0 AC12.292.292.660.125 1 AD10.454 50.454 50.528 10.479 4 BC11.031.031.200.292 4 BD16.656.657.730.014 7*CD14.834.835.610.032 8*A21267.75267.75311.08＜0.000 1**B21408.70408.70474.83＜0.000 1**C21375.03375.03435.72＜0.000 1**D21382.14382.14443.97＜0.000 1**残差1412.050.860 7失拟项108.770.877 31.070.517 3纯误差43.280.819 2总离差281 088.01
注：*.显著（P＜0.05）；**.极显著（P＜0.01）。
2.3.2 交互作用分析
响应面的坡度越陡峭，等高线趋于椭圆形，表明两因素之间交互作用显著；响应面的坡度越平缓，等高线趋于圆形，表明两因素之间交互作用不显著。由图7可知，菌种接种量（A）和发酵温度（B）、菌种接种量（A）和发酵时间（C）、菌种接种量（A）和葡萄糖添加量（D）、发酵温度（B）和发酵时间（C）的交互作用响应曲面坡度平缓，等高线呈圆形，表明二者交互作用对黄菊花发酵液抗氧化能力影响不显著。发酵温度（B）和葡萄糖添加量（D）、发酵时间（C）葡萄糖添加量（D）交互作用对黄菊花发酵液抗氧化活性影响显著，与方差分析结果一致。
图7 各因素间交互作用对黄菊花发酵液T-AOC影响的响应曲面与等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots for the interaction effects among various factors on T-AOC of yellow chrysanthemum fermentation liquid
2.3.3 黄菊花发酵液最佳工艺参数的确定和验证试验
利用Design Expert 13.0软件对试验结果进行分析，得出黄菊花发酵液最佳发酵工艺为嗜酸乳杆菌与保加利亚乳杆菌（1∶1）添加量2%、发酵温度37.7 ℃、发酵时间9.1 h、葡萄糖添加量18%。在此条件下，黄菊花发酵液T-AOC预测值为83.490 U/mL。考虑实际可操作性，修正最佳发酵工艺为嗜酸乳杆菌与保加利亚乳杆菌（1∶1）添加量2%、发酵温度38 ℃、发酵时间9 h、葡萄糖添加量18%。在此优化条件下，进行 3次平行验证实验，黄菊花发酵液T-AOC为82.363 U/mL， 与预测值基本相符，表明优化后的参数可信，较发酵前提升约14.6%，具有实际应用价值。
2.4.1 DPPH自由基清除能力
由图8可知，在样品体积分数为0.4%～2.0%时，未发酵黄菊花液DPPH自由基清除率由21.45%升至59.09%，黄菊花发酵液DPPH自由基清除率由28.75%升至63.37%，而对照组（2 mmol/L VC溶液）在体积分数为2.0%时最高，为72.82%，表明黄菊花发酵液有一定的DPPH自由基清除能力，且发酵能够改善黄菊花液的DPPH自由基清除能力。
图8 黄菊花液发酵前后DPPH自由基清除率
Fig.8 DPPH radical scavenging rate of yellow chrysanthemum liquid before and after fermentation
2.4.2 ABTS阳离子自由基清除能力
由图9可知，在样品体积分数由5%升至80%的过程中，未发酵黄菊花液ABTS阳离子自由基清除率由12.16%提升至95.97%，发酵液ABTS阳离子自由基清除率由7.72%提升至97.04%，而阳性对照组（2 mmol/L VC溶液）在体积分数为40%时已经达到99.97%，表明黄菊花发酵液有一定的ABTS阳离子自由基清除能力，且发酵能够改善黄菊花液的ABTS阳离子自由基清除能力。
图9 黄菊花液发酵前后ABTS阳离子自由基清除率
Fig.9 ABTS cation radical scavenging rate of yellow chrysanthemum liquid before and after fermentation
基于UPLC-MS/MS分析，利用本地自建数据库和公共数据库在黄菊花发酵液中共鉴定出16类、1 320种代谢物。由表4可知，含量占比最高的为黄酮类化合物，占全部代谢物的50%以上。同时，黄酮类化合物也是植物源性食品及中草药中产生抗氧化活性的主要物质基础[23-24]。
表4 黄菊花发酵液主要酚类成分及代表性化合物
Table4 Main polyphenol components and representative compounds in yellow chrysanthemum fermentation liquid
种类占比/%代表性化合物山柰酚、芹菜素、香叶木素、木犀草素、矢车菊素、万寿菊素奎宁酸、4-羟基苯甲酸、三羟基环己烷、香豆素15.045-羟基香豆素、异莨菪亭-β-D-葡萄糖苷、甘密树皮素B、马尾松树脂醇黄酮类52.31高车前素、新樱花苷、金圣草黄素、酚酸类30.893,5-二羟基环己烷、肉桂酰山梨醇、2-羟基-3-苯基丙酸木脂素和鞣质1.17蜂斗菜酸、条茶槭丙素、三甲基鞣花酸其他0.59四羟基-二苯乙烯-O-葡萄糖苷、赤松素
对发酵前后黄菊花液进行代谢物差异分析，在正、负离子模式下对比未发酵与发酵样品，共筛选出差异代谢物484个，其中上调代谢物274个、下调代谢物210个。明确上述代谢物的差异变化规律，对探究黄菊花发酵应用机制具有重要参考价值[25]。
由图10可知，发酵液与未发酵液差异代谢物排名前20的化合物中，上调14种、下调6种。上调幅度最高的化合物为咖啡酰-对香豆酰酒石酸，其作为酚酸衍生物，含有咖啡酰基和香豆酰基，其中酚羟基为强效自由基清除基团，且咖啡酰基已被证实具有显著抗氧化活性[26]。DL-3-苯基乳酸作为苯乳酸类物质，其衍生物如2,3-双(2-羧基苯基)琥珀酸可通过羧基和苯环的协同作用粗灭自由基。(–)-异月桂酰脲-4-O-β-D-葡萄吡喃苷作为木脂素苷类化合物，其含量上调后，木脂素结构中的酚羟基可有效清除自由基[27]，而糖苷化修饰能有效改善其水溶性和生物利用度，进一步提升体内抗氧化作用[28]。进一步分析表明，这种抗氧化能力的增强与发酵液中黄酮类化合物、多酚等活性成分的含量变化密切相关。经差异代谢物分析可知，黄菊花液发酵后抗氧化活性增强，主要依靠酚羟基主导的自由基清除作用。发酵后上调的化合物多含酚羟基结构，如咖啡酰、香豆酰基，可通过氢原子转移或单电子转移机制中和自由基[29]。同时，酚酸、木脂素和苯丙素类化合物共存，可通过互补机制进一步提升整体抗氧化能力[30]。此外，甲氧基、糖苷化等结构修饰可改善化合物的水溶性和反应活性[31]。
图10 发酵液与未发酵液排名前20的差异代谢物
Fig.10 Top20differential metabolites in fermentation liquid vs. unfermented liquid
本研究以黄菊花为原料，选取嗜酸乳杆菌与保加利亚乳杆菌（1∶1）进行发酵制备黄菊花发酵液。通过单因素试验和响应面试验对黄菊花发酵液的发酵工艺进行优化，确定黄菊花发酵液的最佳发酵工艺条件为：嗜酸乳杆菌与保加利亚乳杆菌（1∶1）接种量2%、发酵温度38 ℃、发酵时间9 h、葡萄糖添加量18%。在该优化条件下，黄菊花发酵液T-AOC为82.363 U/mL。黄菊花经发酵处理后，其发酵液DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力较未发酵前提升。发酵处理对黄菊花化学成分产生影响，共筛选出484个差异代谢物，其中上调化合物274个、下调化合物210个。这说明微生物发酵能够有效转化或修饰黄菊花中的原有成分，从而改变其整体化学组成。发酵前后差异代谢物排名前10种的化合物中，上调化合物分别为4′,5,6,7-四甲氧基黄酮、5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄烷酮、2-羟基-3-苯基丙酸、2-甲基苯甲酸、DL-3-苯基乳酸、6-((4-(3-羟基-2-(4-(3-羟基丙基)-2-甲基苯氧基)丙氧基)-2-甲氧基苯氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2,3,4,5-四醇、(–)-异月桂酰脲-4-O-β-D-葡萄吡喃苷、2,3-双(2-羧基苯基)琥珀酸、荔枝单宁A1及咖啡酰-对香豆酰酒石酸。发酵后上调幅度最高的化合物为咖啡酰-对香豆酰酒石酸等酚酸衍生物及木脂素苷类。这些物质均被证实具有显著的抗氧化活性。这表明发酵工艺可作为一种有效的生物转化手段，用于富集或生成特定的高活性抗氧化成分。(–)-异月桂酰脲通过糖苷化修饰生成相应糖苷产物，可增加其水溶性和生物利用度，表明发酵不仅能增加活性成分含量，还能改善其理化性质，从而可能增强其在体内的抗氧化效果。这些代谢物的显著变化对于开发基于黄菊花的健康产品、功能性食品、发酵饮品等具有重要的指导意义。
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