±s表示。采用R语言进行差异显著性分析，采用Origin 2019b绘制图表。Transcriptome-Based Analysis on the Mechanism of Culture Medium Affecting Phenotypes of Saccharomyces cerevisiae
SUN Xiaoyan, SUN Jie, LOU Leiming, et al. Transcriptome-based analysis on the mechanism of culture medium affecting phenotypes of Saccharomyces cerevisiae[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 215-221. (in Chinese with English abstract)DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.027. http://www.chinabrewing.net.cn
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是啤酒酿造的灵魂，是推动啤酒工业可持续发展的重要力量。酵母表型是在特定环境下其酿造性能的直观评价，受基因型及环境双重影响，这些评价包括但不限于细胞形态、生长速率、代谢产物及胁迫耐受性等[1]。酵母表型是研究酵母生理功能和代谢调控的重要对象，其稳定性对于目标产品的质量稳定性至关重要[2]。
啤酒酿造流程涉及酵母的阶段包括保藏、扩培、发酵及回收[3]，在保藏阶段所用的培养基是酿酒酵母表型的环境影响因素。酵母保藏通常需要特定成分的培养基以维持其活性和稳定性，培养基为酵母的生长提供氮源、碳源及各种微量元素，不同培养基各组分含量不同，进而导致酵母表型出现差异[4]。酵母直接影响发酵过程中的降糖速率、发酵度及风味物质生成等，进而影响工厂的生产效率及生产成本[5]。此外，酵母代谢过程中产生的抗氧化活性物质等间接影响产品的非生物稳定性[6]。综上，酿酒酵母的稳定性是企业优化酿造过程及提高产品质量的重要基础。但现阶段，对于国内的啤酒生产厂家来说，酿酒酵母保藏所用的培养基各不相同，经验先行，缺乏理论数据的指导及验证，因酵母表型的波动导致批次间产品质量波动较大。
本研究以酿酒酵母W34/70为目标菌株，采用现阶段啤酒厂常用的3种培养基：麦芽酵母葡萄糖蛋白胨（malt yeast glucose peptone，MYGP）固体培养基、全麦汁（QMZ）固体培养基及辅料麦汁（FLMZ）培养基对其进行培养，采用美国化学家酿造协会（American Society of Brewing Chemists，ASBC）分析方法对菌株的酿造性能相关表型进行鉴定，同时结合转录组学的差异表达基因、基因本体论（Gene Ontology，GO）富集对比分析不同培养基对酿酒酵母表型的影响及机制，以酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培养基为对照，明确酿酒酵母的最适培养基，为维持酿酒酵母代谢性状稳定、保障成品品质稳定及实现批次间品质均一化提供理论依据。
酿酒酵母W34/70 中国工业微生物菌种保藏管理中心；麦芽 中粮麦芽（大连）有限公司；啤酒用糖浆（总糖质量分数75%）[7] 东晓生物科技股份有限公司。
亚甲基蓝（分析纯） 上海源叶生物科技有限公司；正丁醇（纯度≥99%）、N-叔丁基-α-苯基硝酮（纯度≥98%）、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（纯度≥98%） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；NaH2PO4、Na2HPO4、琼脂（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
YPD培养基[8]：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、酵母浸出粉5 g、琼脂14 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
MYGP培养基[9]：酵母提取物3 g、麦芽提取物3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
QMZ固体培养基[10]：采用澳麦芽协定糖化法制备麦汁，原麦汁浓度10 °P、体积1 000 mL，加入琼脂20 g，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
FLMZ固体培养基[10]：采用澳麦芽协定糖化法制备麦汁，添加30%啤酒用糖浆，原麦汁浓度10 °P、体积1 000 mL，加入琼脂20 g，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
TTC培养基[10]：A液：NaH2PO4 1.26 g、Na2HPO41.16 g、琼脂3 g，加水溶解至100 mL；B液：TTC 0.2 g加水溶解至100 mL，A液与B液分别于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至44～46 ℃，以1∶1混合。
FL-1封闭电炉 余姚市沐潞电子商务商行；Buhler DLFU麦芽标准粉碎机 北京德之杰啤酒技术有限责任公司；MR3002/A电子天平 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；HXC-158 4 ℃血液冷藏箱 海尔生物医疗科技（成都）有限公司；CanNeed-M8-800自动糖化仪 嘉仪仪器（香港）有限公司；SM830立式压力蒸汽灭菌锅 雅马拓科技贸易（上海）有限公司；HYL-C3组合式多功能摇床 太仓市强乐实验设备有限公司；Alcolyzer Plus Beer全自动啤酒分析仪（配有DMATM 4500M密度计、Alcolyzer Plus ME测量模块和XsampleTM 520进样器） 安东帕（上海）商贸有限公司；7980A气相色谱（gas chromatography，GC）仪（配备光离子化检测器检测器） 安捷伦科技（中国）有限公司；E-scan电子顺磁共振波谱仪 布鲁克（北京）科技有限公司。
1.3.1 酿酒酵母W34/70的培养
将酿酒酵母W34/70接种至含4种不同培养基质的试管斜面，25 ℃静置培养3 d，待试管斜面增殖约1 mm厚的菌落时，保存于4 ℃冰箱。
1.3.2 酿酒酵母W34/70表型的鉴定
以YPD培养基培养的酿酒酵母W34/70为对照组，采用ASBC分析方法测定酵母表型相关指标，包括酵母死亡率、呼吸缺陷型菌株占比，发酵液发酵度、乙醛含量、总酯含量、总高级醇含量、醇酯比及抗氧化滞后时间[10]。
1.3.3 转录组学分析
取4种培养基质的试管斜面，添加无菌双蒸水冲洗斜面上的酵母，混匀，倒至15 mL离心管中，12 000 r/min 离心1 min，弃去上清液，添加无菌双蒸水后反复冲洗 3遍。将离心后的酵母于干冰中送至北京农林科学院，采用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行文库构建及转录组学测序。为保证数据质量及可靠性，先对原始测序数据进行过滤处理并得到有效纯净数据，再利用DESeq2软件开展差异表达基因分析，基于ClusterProfiler软件完成 GO富集分析，明确不同培养基条件下差异表达基因显著富集的生物学功能。
数据均进行3组生物学重复，结果用±s表示。采用R语言进行差异显著性分析，采用Origin 2019b绘制图表。
2.1.1 酵母死亡率
死亡率是反映酵母细胞活性及环境适应能力的重要指标，通常指在一定条件下，酵母细胞因外界环境压力或内部代谢异常而失去活性或死亡的比例[11]。由图1可知，以MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70死亡率最低，为6.17%，且标准偏差最小，说明以MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70批次间稳定性较好；以FLMZ培养基培养时，酿酒酵母W34/70死亡率最高，为14.58%；以QMZ培养基培养时，死亡率标准偏差最大，批次间稳定性最差。
图1 酿酒酵母W34/70死亡率
Fig.1 Mortality rate ofS. cerevisiae W34/70
2.1.2 酵母呼吸缺陷型占比
呼吸缺陷型是酵母细胞中线粒体功能受损或缺失的一种表型，其形成受环境因素影响[12]。由图2可知，4种培养基质培养的酿酒酵母W34/70的呼吸缺陷型菌株占比相差较小，为1.30%～1.57%。MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70呼吸缺陷型菌株占比为1.34%。
图2 酿酒酵母W34/70呼吸缺陷型菌株占比
Fig.2 Proportion of respiratory-deficient strains of S. cerevisiae W34/70
2.1.3 发酵液的发酵度
发酵度是指通过发酵作用将糖类转化成乙醇和二氧化碳的比例，反映酵母代谢能力，与酵母生长状态、环境适应性及抗逆性密切相关[13-14]。由图3可知，以MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70发酵液的发酵度最高，为69.59%，其次为QMZ培养基培养时，酿酒酵母W34/70发酵液的发酵度为68.36%，以FLMZ培养基培养时，酿酒酵母W34/70发酵液发酵度最低，为67.34%。
图3 酿酒酵母W34/70发酵液的发酵度
Fig.3 Fermentation degree of fermentation broth inoculated with S. cerevisiae W34/70
2.1.4 发酵液的挥发性风味物质
啤酒风味物质是指啤酒发酵过程中，由酵母代谢、麦芽分解及酒花添加等过程产生的多种化学成分，酵母类型及代谢能力是影响风味物质形成的主要因素[15-16]。 由表1可知，与其他3种培养基质相比，MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70发酵液中的乙醛质量浓度最低（9.02 mg/L），总酯（14.47 mg/L）及总高级醇（81.00 mg/L）质量浓度最高，醇酯比（5.67） 适宜[17]。
表1 酿酒酵母W34/70发酵液中挥发性风味物质含量
Table1 Contents of volatileflavor substances in fermentation broth of S. cerevisiae W34/70
培养乙醛质量浓度/总酯质量浓度/浓度/（mg/L）醇酯比总高级醇质量基质（mg/L）（mg/L）FLMZ11.18±2.1612.51±2.3274.91±7.296.04±0.64 MYGP9.02±0.6814.47±2.0581.00±3.355.67±0.58 QMZ11.06±0.919.71±2.8168.19±3.667.18±0.78 YPD10.17±2.2613.81±1.8064.07±3.576.97±3.40
2.1.5 发酵液的滞后时间
滞后时间可表征啤酒内源抗氧化能力，可预测啤酒的风味稳定时间，该数值越高，啤酒抗氧化性能越好[16]。 酒体滞后时间主要形成于发酵阶段，只有保证酵母生理活性才能促使其产生更多的抗氧化物质[18-19]。由图4可知，不同培养基中，酿酒酵母W34/70发酵液的滞后时间不同，以MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70发酵液的滞后时间最长，为69.1 min，抗氧化能力最好。
图4 酿酒酵母W34/70发酵液滞后时间
Fig.4 Lag time of fermentation brothinoculated with S. cerevisiaeW34/70
综上，与其他3种培养基质相比，以MYGP培养基培养的酿酒酵母W34/70死亡率、呼吸缺陷型菌落占比及发酵液乙醛含量低，发酵度、总酯及总高级醇含量高，且醇酯比较适宜，发酵液的滞后时间长，抗氧化能力好。因此，酿酒酵母W34/70的最适培养基为MYGP培养基。
2.2.1 测序数据质量评估与分析
由表2可知，12个样本纯净数据的Q20均大于97%、Q30均大于95%。与参考基因组（NCBI GCA_011022315.1_ASM 1102231v1_genomic.fa）对比，匹配率均大于97%。结果表明，该组样本的转录组测序数据质量较高，可进行样本间差异表达基因分析。
表2 不同培养基质中酿酒酵母W34/70转录组测序结果
Table2 Transcriptome sequencing results ofS. cerevisiae W34/70in different culture media
质控后基质（×106）序列数（×106）对比率/%Q20/%Q30/%MYGP20.60±1.9519.78±1.9419.22±1.9097.11±0.1298.39±0.5795.97±0.17培养原始序列数对比序列数（×106）YPD23.65±1.8422.83±1.8122.19±1.7697.21±0.0298.81±0.0296.22±0.07 QMZ21.62±2.8620.80±2.9920.18±2.9497.02±0.2298.81±0.0596.22±0.15 FLMZ22.28±2.3421.32±1.9720.70±1.9197.10±0.1598.79±0.0696.15±0.17
注：Q20. Phred值大于20的碱基占总碱基的百分比；Q30. Phred值大于30
的碱基占总碱基的百分比。
2.2.2 差异表达基因分析
由图5可知，以YPD培养基培养酿酒酵母W34/70为对照，MYGP培养酿酒酵母W34/70中差异表达基因3 738个，其中上调基因1 603个、下调基因2 135个；QMZ培养酿酒酵母W34/70中差异表达基因4 167个，其中下调基因2 325个、上调基因1 842个；FLMZ培养酿酒酵母W34/70中差异表达基因2 924个，其中下调基因1 716个、上调基因1 208个。
图5 不同培养基质中酿酒酵母W34/70差异表达基因分析
Fig.5 Analysis ofDEGs ofS. cerevisiaeW34/70in different culture media
2.2.3 差异表达基因GO富集分析
进一步对差异表达基因进行GO富集分析，包括分子功能、生物过程及细胞组分3个维度[20]。由图6可知，以YPD培养酿酒酵母W34/70为基准，与FLMZ和QMZ培养酿酒酵母W34/70相比较，MYGP培养酿酒酵母W34/70差异表达基因在分子功能维度上表现为结构分子活性的下调、氧化还原酶活性大幅上调；在生物过程维度上，蛋白质复性、甾醇生物合成与代谢、类固醇生物合成过程出现明显上调；在细胞组分维度上，细胞质核糖体出现明显下调。
图6 不同培养基质下酿酒酵母W34/70差异表达基因GO富集分析
Fig.6 GO enrichment analysis ofDEGs ofS. cerevisiae W34/70under different culture mediums
氧化还原酶在酵母细胞中通过参与能量代谢、氧化应激应对、蛋白质折叠等过程维持细胞功能[21]。针对能量代谢功能，氧化还原酶是线粒体电子传递链的核心，参与呼吸链的电子传递，为细胞提供能量。研究表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶是一种位于线粒体内膜的脱氢酶，属于非质子泵型脱氢酶，可将电子从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸直接传递给泛醌，在特定条件下作为呼吸链的替代入口，这一发现为理解酵母细胞的呼吸缺陷型提供了新视角[22-23]；针对氧化应激反应功能，氧化还原酶通过调节细胞内氧化还原状态及代谢物和辅因子分布增强细胞代谢及环境适应性[24-25]；针对蛋白质折叠功能，氧化还原酶参与蛋白质二硫键形成，对细胞质膜的正确合成至关重要[26]。因此，MYGP培养基培养时，酿酒酵母W34/70氧化还原酶功能基因表达的上调与酵母细胞的死亡率低、呼吸缺陷型低、发酵液的挥发性风味物质含量协调、滞后时间长呈现正相关性。
蛋白质复性、甾醇及类固醇生物合成与代谢对维持酵母细胞的存活十分重要。蛋白质复性是肽链在内质网中折叠成正确三维结构的过程，也是蛋白质在适当条件下恢复其结构和生物活性的关键环节。另外，甾醇有调节膜流动性、通透性和机械强度的功能，能够保持膜结构完整性，增强酵母对乙醇、氧化等工业发酵胁迫环境的耐受性；在无氧条件下，酵母必须合成甾醇才能在无氧环境生长[27-28]。综上，以MYGP为培养基的酵母其蛋白质复性、甾醇及类固醇生物合成与代谢相关功能基因上调与酵母细胞死亡率低、发酵度高、风味物质代谢协调性呈正相关。
细胞质核糖体通过蛋白质合成、代谢调控、应激响应及环境适应性等全面支持细胞的生长和生存[29-30]。细胞质核糖体是酿酒酵母维持生命活动的基础，当酵母细胞面临饥饿或氧化压力时，酵母细胞会快速通过细胞质核糖体进行响应。另外，核糖体可精准调控蛋白质翻译进程，该过程与酿酒酵母寿命密切相关[31-32]。所以，酵母在营养相对缺乏的保藏阶段，细胞质核糖体功能基因下调，可减缓菌体生长速率，从而避免因营养物质缺乏导致的酵母死亡率升高。
综上，以MYGP为培养基时，酿酒酵母W34/70分子功能中氧化还原酶活性功能基因明显上调，生物学功能中蛋白质复性、甾醇及类固醇生物合成过程功能基因明显上调，细胞组分中细胞质核糖体功能基因明显下调，与其酵母表型鉴定结果一致。
不同培养基对酿酒酵母表型的影响主要体现在酵母细胞死亡率、呼吸缺陷型及代谢相关指标上，啤酒厂常用的培养基中，以MYGP培养的酿酒酵母W34/70表型最优，死亡率6.17%、呼吸缺陷型菌株占比1.34%，发酵液发酵度69.59%、乙醛质量浓度9.02 mg/L、总酯质量浓度14.47 mg/L、总醇质量浓度81.00 mg/L、醇酯比5.67、滞后时间69.1 min。转录组测序与分析结果显示，MYGP培养酵母的氧化还原酶活性功能基因明显上调、蛋白质复性、甾醇及类固醇生物合成过程功能基因明显上调、细胞质核糖体功能基因明显下调。本研究结果可为啤酒厂酿酒酵母培养基选择提供理论依据，为维持酿酒酵母代谢性状稳定、保障成品品质稳定及实现批次间品质均一化提供理论依据，后续可结合啤酒酿造生产全流程（酵母扩培、发酵及回收阶段）的环境影响因素，系统解析其对酵母表型影响机制，形成全面的酵母表型稳定性保障体系。
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