获取，而腺苷酸硫酸盐激酶MET14是该同化途径中的关键酶[11-13]。另有研究表明，MET14基因的过表达可提高菌体细胞内的谷胱甘肽浓度[14]。Effect of Overexpression of the Adenylyl-Sulfate Kinase Gene MET14 on Freeze Tolerance of Saccharomyces cerevisiae
GUO Weixiong, FENG Xiaoyong, FENG Jin, et al. Effect of overexpression of the adenylyl-sulfate kinase gene MET14 on freeze tolerance of Saccharomyces cerevisiae[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 192-198. (in Chinese with English abstract)DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.024. http://www.chinabrewing.net.cn
冷冻面团行业正处于快速增长阶段，发展前景广阔。随着现代生活节奏加快，消费者对 “即烤即食” 类产品的需求激增，冷冻面团已成为家庭烘焙和餐饮企业的优选方案。对于连锁烘焙店、咖啡店、快餐店等业态而言，冷冻面团能有效降低人工成本与物料损耗，显著提升运营效率[1-4]。冷冻面团品质下降的主要原因是冻结和贮存过程中冰晶的形成和重结晶，这严重影响面团的品质。在这一过程中，酵母的存活率和活性降低[5-8]。有研究报道，提高环境的抗氧化能力，可有效提高酵母的存活率和活性。在冷冻面团中添加谷胱甘肽，能显著提高酵母存活率[9-10]。谷胱甘肽分子中半胱氨酸所含的硫原子主要通过硫酸盐同化途径从获取，而腺苷酸硫酸盐激酶MET14是该同化途径中的关键酶[11-13]。另有研究表明，MET14基因的过表达可提高菌体细胞内的谷胱甘肽浓度[14]。
本研究以酿酒酵母LKF-1为出发菌株，采用同源重组法与CRISPR/Cas9技术，分别构建MET14基因过表达菌株与MET14基因缺失菌株，旨在明确MET14基因对酿酒酵母冷冻耐受性的调控作用，并探究MET14基因过表达对冷冻过后酵母菌体外观形态、细胞膜通透性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）生成量的影响，以期为耐冷冻工业酵母菌株的构建奠定基础。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LKF-1从法国乐斯福燕子牌鲜酵母分离；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α（用于重组质粒克隆的扩增） 生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒pAUR123-EGFP、质粒pRCC-K 武汉淼灵生物科技有限公司；质粒bRA66 美国Addgene质粒保藏中心。
次甲基蓝、氯化钾、六水氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖、氯化钠（分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；琼脂粉 广东环凯微生物科技有限公司；酵母碳源基础（yeast carbon base，YCB）培养基 北京酷来搏科技有限公司；酵母基因组DNA快速抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Rapid Taq Master Mix和同源重组酶 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、SacI、EcoRV和BplI限制性内切酶 美国赛默飞世尔科技公司；脂质氧化检测试剂盒、1 mg/mL碘化吡啶（propidium iodide，PI）溶液 上海碧云天生物技术有限公司；DNA Marker Ⅲ分子质量标准 天根生化科技（北京）有限公司。
酵母浸出粉胰蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖20 g、胰蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g，蒸馏水补足1 000 mL，调整pH值为7，121 ℃灭菌20 min。
YPD固体培养基：YPD液体培养基加琼脂粉 15 g。
SC培养基：YCB培养基1.17 g/L，加水补足1 L。
LB固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠 10 g、琼脂粉 15 g，蒸馏水补足1 000 mL，调整pH值为7，121 ℃灭菌20 min。
美兰染色液：次甲基蓝0.025 g、氯化钾0.042 g、六水氯化钙0.048 g、碳酸氢钠0.02 g、葡萄糖1 g，加入无菌生理盐水定容至100 mL。
ECLIPSE E200显微镜 日本尼康精机有限公司；SYNERGY H1酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；ZQZY-75BN振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；T100聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Multiporator多功能细胞电穿孔仪 德国Eppendorf公司；Apreo 2s场发射扫描电镜 美国赛默飞世尔科技公司；JXFSTPRP-4D三维样品研磨仪 上海净信实业发展有限公司。
1.3.1 过表达MET14基因和缺失MET14基因的酿酒酵母构建
过表达MET14基因的酿酒酵母构建：采用Zheng Huihui等[15]的方法，以酿酒酵母LKF-1基因组DNA为模板，使用引物U-F/U-R、D-F/D-R、TEF1-F/TEF1-R和MET14-F/MET14-R分别PCR扩增rDNA上游rDNA同源臂（1 128 bp）、下游rDNA同源臂（1 096 bp）、启动子TEF1（407 bp）、基因MET14（606 bp）。以质粒pRCC-K为模板，使用引物kanMX-F/kanMX-R和pRCC-K-F/ pRCC-K-R分别PCR扩增kanMX表达盒（TEF1p-kanMX-TEF1t）（1 357 bp）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）、大肠杆菌的质粒复制起始位点（Amp-ori）片段（1 736 bp）。 以质粒pAUR123-EGFP为模板，使用引物pAUR123-EGFP-F/pAUR123-EGFP-R PCR扩增EGFP-ADH1（989 bp）。根据GenBank检索酿酒酵母S288c的基因组序列（GCA_000146045.2），使用软件Primer Premier 5.0设计引物，由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物具体信息见表1。
表1 引物名称及序列
Table1 Primer names and sequences
引物序列U-FCCGGAACCTCTAATCATTCGC U-RGATATCACCCGGGTTAGAGAGCTCGCAAGTACGGTC GTTTTAGGTTTTACCTEF1-FAACGACCGTACTTGCCGAAAGACATTCGCCACACACCATAGCTT TEF1-RGGCAGAACCAGCAGTCATTTAGATTAGATTGCTATGC TTTCTTTCTAAD-FACTAGTACGTCTCGAGATTATACCTCAAGCACGCAGA GAAD-RAACGAACGAGACCTTAACCTACTAAA MET14-FAAATGGCTACTAATATTACTTGGCATCC MET14-RGCCCTTGCTCACCATGATATCCAAATGCTTACGGATGA TTTTTTCACTGkanMX-FCGTTAGTATCGAATCGACTATGCCAGTATAGCGACCAGCA kanMX-RCTGCGTGCTTGAGGTATAATCTCGAGACGTACTAGTT AGGGATAACAGGGTAATCAGCGpAUR123-TCTAACCCGGGTGATATCATGGTGAGCAAGGGCGA EGFP-FGG pEAGUFRP1-2R3-CTGTCGATTCGATACTAACG pRCC-K-FTTTAGTAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTCACTTTTCGGG GAAATGTGCpRCC-K-RGCGAATGATTAGAGGTTCCGGTACCTGCTGGCGTTTT TCCATAGGN20-FCAGTAACTGTTCTAGCGCACGTTTT N20-RGTGCGCTAGAACAGTTACTGGATCA U-cas9-FACTCAATCTCGTCACTAAAG U-cas9-RTCCAAGCACACTGTACACCATTTGACCGATTACTGTA CATD-cas9-FATGTACAGTAATCGGTCAGAGAATGGTGTACAGTGTGCTT D-cas9-RACATCAGTTGCGTATCCGTT
将片段上游rDNA同源臂、EGFP片段、kanMX片段、下游rDNA同源臂和Amp-ori片段进行重组。将重组产物通过热激法转入大肠杆菌DH5α，涂布在100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板，37℃培养24 h。在该平板挑取单克隆体，用rDNAup-F和KanMX-R引物进行PCR验证。对验证正确的质粒进行SacI和EcoRV双酶切，再与启动子TEF1和MET14基因进行同源重组。将重组产物通过热激法转入大肠杆菌DH5α，涂布在含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养24 h。在该平板挑取单克隆体，用TEF1-F和MET14-R引物进行PCR验证。以验证正确的质粒为模板，使用引物U-F/D-R，PCR扩增线性化质粒表达盒（上游rDNA同源臂-TEF1p-MET14-EGFP-ADH1t-TEF1p-kanMX-TEF1t-下游rDNA同源臂）。线性化质粒表达盒通过电转入酿酒酵母LKF-1，在含200 μg/mL G418（遗传霉素）的YPD平板上初筛阳性克隆。通过引物TEF1-F/pAUR123-EGFP-R对阳性克隆的菌株进行PCR鉴定。将鉴定正确的阳性克隆接入SC培养基，30 ℃培养24 h，在荧光显微镜下观察，激发波长：465～495 nm，发射滤光片波长512～558 nm，于10倍物镜观察。菌体有明显的绿色荧光，表明融合蛋白MET14-EGFP在LKF-1菌体中表达，成功构建过表达MET14基因的菌株，并将该菌株命名为LKF-1-MET14。
缺失MET14基因的酿酒酵母构建：采取Levi等[16]的方法。以酿酒酵母LKF-1基因组DNA为模板，使用引物U-cas9-F/U-cas9-R和D-cas9-F/D-cas9-R分别PCR扩增MET14基因的上游和下游各100 bp同源臂，并通过重叠延伸PCR获得完整200 bp片段。将N20-F与N20-R互连，然后与经BplI酶切的质粒bRA66酶连。将质粒和完整片段通过电转入酿酒酵母LKF-1，涂布在含200 μg/mL潮霉素的半乳糖YPD平板，30 ℃培养48 h。最后，对平板上的单克隆通过引物U-cas9-F/D-cas9-R进行PCR鉴定，确定成功构建缺失MET14基因的菌株，并将该菌株命名为LKF-1-ΔMET14。
1.3.2 存活率测定
将野生型LKF-1和LKF-1-MET14以5%（V/V）接种量接入YPD培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养培养24 h。然后将发酵液6 500×g离心3 min，将沉淀的菌体置于-20 ℃冰箱中。冻藏1、3、7 d取样，在室温条件下解冻，将1 mL无菌生理盐水加入沉淀的菌体中，重悬菌体后在室温活化1 h。将活化液振荡均匀，吸取0.1 mL活化酵母加入0.9 mL美兰染色液摇匀。室温染色10 min，立刻在显微镜下用血球计数板计数。其中染成蓝色的菌体为死酵母，没染上色的透明的为活的酵母[17]。存活率按下式计算：
1.3.3 抗冻能力测定
将野生型LKF-1、LKF-1-MET14和LKF-1-ΔMET14以5%（V/V）的接种量接入YPD培养基，30 ℃、180 r/min 振荡培养24 h。取1 mL菌液，6 500×g离心3 min，去上清。将菌体置于-20 ℃放置。3 d后置于室温解冻。加入1 mL YPD液体培养基，再以2%（V/V）的接种量接种入YPD液体培养基，取150 μL加入96孔板中，30 ℃静置培养。每小时使用酶标仪测OD600 nm值。
1.3.4 电镜形态观察
将野生型LKF-1和LKF-1-MET14以5%（V/V）的接种量接入YPD培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养24 h。取1 mL菌液，6 500×g离心3 min，去上清液。将沉淀菌体分成2部分：一部分作为0 d的样品，另一部分置于 -20 ℃放置7 d，为冷冻后的样品。样品经过戊二醛的固定和梯度乙醇脱水，贴台喷金，3 kV观察表面形貌。
1.3.5 细胞膜通透性测定
将野生型LKF-1和LKF-1-MET14以5%（V/V）接种量接入YPD培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养24 h。取1 mL菌液，6 500×g离心3 min，去上清液。将菌体置于-20 ℃放置。7 d后置于室温解冻。分别加入生理盐水调菌浓度达到OD600 nm值为1。每100 μL加入1 μL 1 mg/mL PI，在室温避光孵育10 min。然后测激发波长493 nm、发射波长636 nm处的荧光强度。
1.3.6 MDA含量测定
将野生型LKF-1和LKF-1-MET14以5%（V/V）接种量接入YPD培养基，30 ℃、180 r/min振荡培养24 h。取1 mL菌液，6 500×g离心3 min，去上清液。将菌体置于-20 ℃放置。7 d后置于室温解冻。分别使用生理盐水洗涤菌体3次。再加入锆石小珠，使用球磨机破碎菌体。然后将破碎的菌体分成2份：1份使用脂质氧化检测试剂盒测MDA含量，另1份使用BCA蛋白定量分析试剂盒测蛋白浓度。
所有实验均重复3次，使用Office 2013中Excel进行数据统计和显著性分析，数据表示为
±s，P ＜0.05被认为具有显著差异，P＜0.01被认为具有极显著差异。
绿色荧光蛋白EGFP在465～495 nm激发波长处发出绿色荧光。转化的过表达菌体MET14和EGFP基因在同一个表达盒中，且该表达盒中MET14基因没有终止密码子，MET14-EGFP基因一起表达。由图1可知，经过转化的过表达菌体带绿色荧光。表明LKF-1-MET14 菌体中MET14-EGFP蛋白融合表达成功。
图1 荧光显微镜下LKF-1-MET14菌体形态
Fig.1 Cell morphology ofLKF-1-MET14strains underfluorescence microscope
由图2可知，引物TEF1-F、pAUR123-EGFP-R鉴定LKF-1-MET14菌株大小为2 018 bp。采取Cas9对野生型LKF-1菌株进行MET14基因敲除，引物U-cas9-F、D-cas9-R鉴定缺失株LKF-1-ΔMET14的PCR产物为200 bp，与上下游同源臂序列长度之和大小相同；野生型LKF-1的PCR产物为809 bp，与基因MET14及上下游同源臂序列长度之和大小相同。
图2 MET14基因过表达与敲除菌株PCR扩增产物电泳图
Fig.2 Electrophoresis of polymerase chain reaction amplification products ofMET14-overexpression and knockout strains
由图3可知，在-20 ℃冷冻1、3 d和7 d后LKF-1的存活率分别为61.60%、19.37%、8.50%，而LKF-1-MET14的存活率分别为71.17%、47.40%、21.60%，LKF-1-MET14的存活率均高于LKF-1，表明基因MET14过表达可以提高酿酒酵母LKF-1在冷冻条件下的存活率。
图3 －20 ℃下酵母菌存活率随时间变化情况
Fig.3 Changes in yeast survival rate over time at–20 ℃
由图4可知，在-20 ℃冷冻3 d后，菌株LKF-1、LKF-1-MET14、LKF-1-ΔMET14进入稳定期的时间分别为15、13 h和19 h。表明LKF-1-MET14再冷冻后活菌量最多，而LKF-1-ΔMET14再冷冻后活菌量最少，表明基因MET14过表达可以提高酿酒酵母LKF-1的耐冻能力。
图4 LKF-1、LKF-1-MET14和LKF-1-ΔMET14菌株的生长曲线
Fig.4 Growth curves ofLKF-1,LKF-1-MET14,and LKF-1-ΔMET14strains
由图5可知，0 d时LKF-1和LKF-1-MET14的菌体表面光滑。冷冻7 d后，LKF-1和LKF-1-MET14菌体表面都有颗粒状的物质。经过冷冻处理菌体表面会发生变化。但是LKF-1-MET14的菌体表面颗粒少于比LKF-1。表明基因MET14过表达能减少菌体表面颗粒物生成。MET14基因过表达可能影响酵母的细胞壁和细胞膜结构。
图5 酿酒酵母扫描电镜图
Fig.5 Scanning electron micrographs ofS. cerevisiae
PI可以结合双链DNA后产生红色荧光。但是PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。由图6可知，冷冻过后LKF-1和LKF-1-MET14的荧光强度分别为4 006和2 538。表明LKF-1的细胞膜通透性高于LKF-1-MET14。在低温条件下，酿酒酵母细胞膜的流动性下降，导致膜蛋白功能受损、蛋白质合成受阻。随着低温胁迫时间延长，胞内H2O2和活性氧水平持续升高，表明酵母遭受氧化损伤[18-21]。MET14基因表达提高了在冷冻环境下酵母的细胞膜强度。
图6 菌体胞内的荧光强度
Fig.6 Intracellularfluorescence intensity of yeast cells
MDA是脂质过氧化作用的主要产物之一，通常以其含量作为脂质过氧化指标。由图7可知，冷冻过后，LKF-1和LKF-1-MET14的细胞内MDA含量分别为239.20 μmol/mg和171.90 μmol/mg。谷胱甘肽的合成依赖硫酸盐同化途径，即将无机硫转化为半胱氨酸的巯基，MET14是该途径的关键酶[14,22]。王立梅[23]、Hara[24]等报道显示，过表达MET14可显著提升酵母谷胱甘肽产量。谷胱甘肽在谷胱甘肽过氧化物酶催化下将二硫键还原为巯基（—SH），该巯基可高效清除氧自由基，显著减缓细胞膜、DNA及膜蛋白的过氧化损伤。冷冻面团制作中外源添加谷胱甘肽能提高酵母存活率[25-27]。而细胞膜具有大量脂质，脂质被氧化后使细胞的通透性升高，表明MET14基因的过表达能提高胞内的抗氧化性。在酵母抗冻性能改良的研究领域，有学者聚焦酵母菌的海藻糖代谢途径，通过基因编辑手段，一方面增强海藻糖的合成效率，另一方面抑制其降解过程。经此改造的酵母菌，在冷冻处理7 d后，存活率可稳定保持在70%以上[28]。也有学者则针对酿酒酵母的fps1基因展开研究，通过敲除该基因，有效减少了菌体内甘油向胞外的扩散流失。得益于这一改造，该菌株在冷冻3 d后存活率更是高达90%以上[29]。
图7 菌体胞内的MDA含量
Fig.7 Intracellular MDA content of yeast cells
本研究探究了酵母中耐冻基因与酵母耐冻的关系，结果表明，低温胁迫后，MET14基因过表达能提高菌体的耐冻能力。MET14基因过表达菌株在低温处理后表现出更优的细胞膜选择透过性和更完整的细胞形态，从而有效提高酿酒酵母的耐冻性。并且，MET14基因过表达菌株的抗氧化能力增强，胞内脂质过氧化水平降低。本研究可为开发冷冻面团使用的酵母奠定基础。
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