Effects of Different Saccharomyces cerevisiae Strains on Methanol and Higher Alcohol Formation of Purple Sweet Potato Wine During Fermentation Process
CHEN Nan, LIU Siqi, WU Zhengyun, et al. Effects of different Saccharomyces cerevisiae strains on methanol and higher alcohol formation of purple sweet potato wine during fermentation process[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 185-191.(in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.023. http://www.chinabrewing.net.cn
紫薯为旋花科番薯属植物甘薯（Ipomoea batatas (L.)Lam.）的紫色块根品种，富含淀粉、膳食纤维、多酚、类黄酮等功能性成分，具有抗氧化、抗炎等生理活性[1]。紫薯酒是以紫薯为原料的发酵酒，发酵过程中保留了紫薯的香气、色泽和丰富的花青素、维生素等生物活性成分。
酿造酒又称发酵酒，是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将含淀粉和糖质的原料进行发酵，产生乙醇而得到酒。在酿酒过程中也伴随着其他一些对人体有害的物质产生，甲醇和高级醇是发酵酒中主要的健康风险因子[2]。甲醇的健康危害包括易引发恶心、头痛等症状，严重时可导致中枢神经和视神经损伤，甚至引发永久性失明和死亡，且因其在人体内代谢迟缓，毒性作用往往持续时间较长[3]。甲醇生成途径包括果胶分解代谢途径和甘氨酸代谢途径[4]。研究显示，以果胶含量较高的原料酿酒通常导致更高的甲醇水平[5]。在发酵过程中，果胶酯酶通过特异性水解作用能够断开果胶中半乳糖醛酸与甲氧基之间的酯键，从而生成甲醇[6]。但果胶并非甲醇的唯一来源，甘氨酸也可在脱羧酶体系作用下发生脱氨和脱羧反应生成甲醇[2]。
高级醇又称杂醇油，指在酿造酒的过程中由酵母分解蛋白质、氨基酸及糖类而产生的一类具有较高沸点和强烈气味、含3个及以上碳原子的一元醇混合物。酿造酒中的高级醇主要有正丙醇、异丁醇、正丁醇、正戊醇、异戊醇、β-苯乙醇等[7]。高级醇的种类和含量决定了酿造酒的香气特征和口感，但过高含量的高级醇会引起剧烈头痛，对人体健康造成危害[8]。高级醇是乙醇发酵过程中产生的副产物，其生成途径包括氨基酸降解代谢路径（Ehrlich代谢机制）和糖合成代谢路径（Harris代谢机制）[9]。酒类中的高级醇主要来源于发酵过程中微生物对氨基酸和糖类物质的代谢[10]，其中酵母菌扮演了重要角色，能够在转氨酶的作用下生成相应的α-酮酸，并通过脱羧和还原反应生成高级醇[11]。
目前，对于不同酵母菌株对紫薯酒发酵中甲醇和高级醇生成的影响，尤其是甲醇生成中不同途径的作用尚不明确。本研究选取4种酿酒酵母菌株AQ、EC1118、SY、RW发酵紫薯汁制备紫薯酒，通过热酸法提取果胶，并采用pH-stat法检测果胶酯酶活性，考察对不同酿酒酵母通过果胶分解、甘氨酸代谢途径；比较其氨基酸降解代谢路径和糖合成代谢路径生成甲醇和高级醇的能力，探讨不同酿酒酵母对紫薯酒发酵过程中的甲醇和高级醇生成的影响，旨在挑选出低产甲醇和高级醇且综合指标良好的酿酒酵母，为紫薯酒酿造中的甲醇和高级醇含量控制提供参考。
紫薯、白砂糖 市购。
酿酒酵母EC1118 加拿大Lallemand公司；酿酒酵母RW、AQ、SY 安琪酵母股份有限公司。
α-淀粉酶（10 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）山东科隆特酶制剂有限公司；柠檬酸、无水葡萄糖、氯化钠、焦亚硫酸钾、无水乙醇（均为分析纯）、甲醇、正丙醇、β-苯乙醇、异丁醇、异戊醇（均为色谱纯） 四川兴向实验设备有限公司；甘氨酸、D-异抗坏血酸钠（均为分析纯）、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基 北京Solarbio科技有限公司。
pHS-3C pH计 上海羌强仪器设备有限公司；TGL-1650高速离心机 四川蜀科仪器有限公司；UV-1600紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Trace 1300气相色谱（gas chromatography， GC）仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；QTRAP 6500+ 高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry， HPLC-MS/MS）仪 美国SCIEX公司。
1.3.1 紫薯酒的制备
挑选完整、新鲜、无虫蛀的紫薯，清水洗净后切块，高温蒸煮20 min，冷却后破碎打浆。紫薯浆与蒸馏水按照料液比1∶0.4（g/mL）混合，添加0.2%（以紫薯浆质量计）的糖化酶、0.15%的α-淀粉酶，65 ℃条件下恒温酶解时间2 h，酶解后经压榨得到紫薯汁。按照紫薯汁质量添加13%白砂糖、0.2%柠檬酸、0.03% D-异抗坏血酸钠和0.025%焦亚硫酸钾。将紫薯汁质量0.1%的干酵母加入10倍质量的5 g/100mL无菌葡萄糖溶液，在 35 ℃条件下活化30 min，向调配后的紫薯汁中分别接种活化后的酿酒酵母AQ、EC1118、SY、RW，25 ℃条件下恒温发酵8 d至无明显气泡产生，终止发酵，即得紫薯酒原酒。分别在发酵0、2、4、6、8 d取样，测定相关指标[12]。
1.3.2 添加甘氨酸模拟酿酒体系制备
参考文献[13]的方法略加修改。用蒸馏水配制200 mL YPD液体培养基（50 g/L），添加葡萄糖，调整还原糖质量浓度为250 g/L，调整甘氨酸质量浓度为10 g/L，培养基高温灭菌后冷却。按1%的接种量向培养基中接种活化后的4株酿酒酵母AQ、EC1118、SY、RW，25 ℃条件下恒温发酵8 d，样品依次编号为A-AQ、A-EC1118、A-SY、A-RW。以未添加甘氨酸为对照组，样品依次编号为CK-AQ、CK-EC1118、CK-SY、CK-RW。分别在发酵0、2、4、6、8 d取样，测定相关指标。
1.3.3 理化指标测定
pH值：采用pH计测定；产气量：采用二氧化碳质量损失法[14]测定；总酸、乙醇体积分数：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法、酒精计法测定；花青素含量：采用比色法[15]测定。
1.3.4 甲醇、高级醇含量测定
将紫薯酒原酒样品过0.22 μm的滤膜，采用GC法[16]进行甲醇、高级醇含量测定。以甲醇、高级醇质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），得到甲醇、高级醇标准曲线回归方程分别为：y＝219.95x-3.612 6，决定系数（R2）为0.999 7；y＝28.777x-11.696，R2为0.999 7。
GC条件：DB-WAX色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），载气为高纯氮气（N2），流量35 mL/min，分流比1∶20，进样口和检测器的温度分别为200 ℃、230 ℃。升温程序为初始温度为40 ℃，保持1 min；随后以4.0 ℃/min的速率升温至70 ℃，保持1 min；最后以10.0 ℃/min的速率升温至220 ℃，并保持1 min。
定性定量方法：依据按照甲醇、高级醇标准品保留时间进行定性分析，按照标准曲线回归方程计算样品中甲醇、高级醇含量。
1.3.5 果胶含量、果胶酯酶活性测定
果胶含量测定[17]：紫薯酒原酒样品按照体积比1∶20添加蒸馏水稀释，柠檬酸调节pH值，90 ℃下恒温搅拌2 h。于4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min后，取上清液按体积比1∶2与无水乙醇混合，搅拌均匀，4 ℃下静置过夜。于4 ℃、8 000 r/min条件下离心15 min，收集粗果胶沉淀。无水乙醇洗涤沉淀，于4 ℃、8 000 r/min条件下离心5 min，置于烘箱中55 ℃干燥至恒质量，称量计算果胶含量。
果胶酯酶的提取[18]：在样品中按体积比1∶3加入2 mol/L的NaCl溶液，置于28 ℃摇床中，恒温振荡提取22 h，提取液于4 ℃、10 000 r/min离心20 min后，取上清液过滤，即得粗酶液。
果胶酯酶活性的测定：参考文献[18]的方法，并稍加修改。配制果胶盐溶液30 mL（1%果胶溶液10 mL、0.01 mol/L NaCl 20 mL），于30 ℃水浴中用0.05 mol/L NaOH将pH值调至7.5后，加入1 mL粗酶液，迅速调节pH值为7.5，而后加入0.05 mol/L NaOH 10 μL，记录反应体系pH值恢复至7.5所需的时间。以消耗NaOH溶液的总量与反应时间比值计算果胶酯酶活性。
果胶酯酶活性定义：每1 mL样品每分钟消耗1 μmol NaOH定义为一个酶活性单位/（U/mL）。
所有实验均重复测定3次，采用Microsoft Excel 2022软件对数据进行统计整理，采用SPSS 27.0软件进行数据相关性分析，使用Origin 2021软件制图。
由表1可知，紫薯原酒中的总酸质量浓度为5.22～5.88 g/L，乙醇体积分数为14.3%～15.4%，符合农业行业标准NY/T 1508—2017《绿色食品 果酒》的要求。4株酿酒酵母中，菌株SY发酵过程中产气量最多（79.3 g），乙醇体积分数（15.4%）也高于其他3组，表明菌株SY发酵能力最强。
表1 4种酿酒酵母酿造紫薯酒的理化指标
Table1 Physicochemicalindicators of PSPW brewed by four S. cerevisiae
分数/%pH总酸质量花青素质量编号量/g浓度/（g/L）浓度/（mg/L）AQ75.314.54.375.88±0.09392.42±1.01菌株产气乙醇体积EC111874.914.34.535.22±0.03374.89±3.01 SY79.315.44.465.22±0.06412.04±3.88 RW75.114.74.445.46±0.03384.49±2.22
由表1亦可知，紫薯酒中花青素质量浓度为374.89～412.04 mg/L，与发酵前（紫薯浆）相比增加18.78%～30.56%。其中，菌株SY发酵紫薯酒中的花青素质量浓度最高（412.04 mg/L）。花青素含量的整体增加可能是由于发酵中产生的乙醇对花青素等复杂大分子酚类物质的提取[19]，以及果胶酶等对细胞壁水解对花青素浸出的增加[20]。此外，有机酸、糖类等物质也可能会与花青素发生酰基化、糖基化等反应，生成稳定性更高的酰基和羰基花青素[21]。
由图1a可知，4株酿酒酵母酿造紫薯酒发酵过程中果胶酯酶活性均呈现先增强后减弱的趋势，且均在发酵第2天达到最高值，菌株AQ、EC1118、SY、RW酿造紫薯酒的果胶酯酶活性分别为0.118 2、0.100 0、0.085 2、0.083 8 U/mL。这与Poondla等[22]在YPD培养基中观察到的果胶酶活性在发酵周期内先增强（0～48 h）后降低（48～72 h）的变化规律相近。4株酿酒酵母中，菌株AQ的果胶酯酶活性最强，最高为0.118 2 U/mL，发酵结束时其果胶酯酶活性仍明显高于其他3株酵母。菌株EC1118、SY与RW在发酵过程中的果胶酯酶活性相对较低，且差异较小。
图1 不同酿酒酵母菌株酿造紫薯酒发酵过程中果胶酯酶活性（a）、果胶含量（b）、甲醇含量（c）及pH值（d）变化
Fig.1 Changes of pectinesterase activities(a),pectin contents(b),methanol contents(c) and pH values(d) of PSPW brewed by different S. cerevisiae strains during fermentation process
由图1b可知，发酵开始前，紫薯浆中果胶质量浓度为34.8 mg/L，这与赵丰丽等[23]从紫薯渣中提取的果胶质量分数为3.979%的报道相近。4株酵母发酵过程中，果胶质量浓度均呈先快后慢的下降趋势。菌株EC1118发酵结束后，其酿造紫薯酒中果胶质量浓度最低，为13.53 mg/L。
由图1c可知，发酵前期（0～4 d），甲醇质量浓度快速增加，随后（4～8 d）增速放缓，甲醇质量浓度逐渐稳定。这与湛佳佳等[24]的研究结果相近。4株酵母中，菌株EC1118酿造紫薯酒中甲醇质量浓度增长最快，发酵结束时甲醇质量浓度最高，为574.27 mg/L；菌株SY酿造紫薯酒中甲醇含量增长最慢，发酵结束时甲醇质量浓度为526.69 mg/L。发酵开始前紫薯浆中存在一定量甲醇，推测是前期紫薯淀粉酶解时，原料中的内源果胶酯酶在高温下造成紫薯中果胶的部分分解。发酵结束时，4株酵母酿造紫薯酒中甲醇含量相差不大。
由图1d可知，发酵初期（0～2 d），不同酿酒酵母菌株利用体系中的碳源通过相关代谢途径产生有机酸，总酸含量积累，pH值显著降低。发酵2～8 d，pH值呈现缓慢回升的趋势，并逐渐趋于稳定。4株酵母中，菌株SY在发酵前期产酸最多，pH值下降最快，在后期回升后与菌株RW发酵pH值相近。发酵结束时，菌株AQ 酿造紫薯酒pH值最低，为4.37；菌株EC1118酿造紫薯酒pH值最高，为4.53。
综上，发酵初期紫薯浆中果胶含量高，酵母菌生长代谢较为活跃，分泌的果胶酯酶活性较高，能够快速水解原料中的果胶生成甲醇。酵母菌产酸较多，pH值下降较快；随着发酵的进行，体系中底物减少，果胶酯酶活性下降，果胶分解产生甲醇的速度也逐渐下降，果胶含量、甲醇含量、pH值趋于稳定[25]。
由图2a可知，高级醇含量随发酵时间增加总体呈上升趋势，发酵后期（4～8 d）增速放缓。菌株AQ酿造紫薯酒发酵过程中高级醇含量始终高于其他3株酵母，并且其他3株酵母酿造紫薯酒发酵过程中高级醇含量差异不大，菌株SY酿造紫薯酒原酒高级醇含量最低。发酵结束时，菌株AQ、EC1118、SY、RW酿造紫薯酒中高级醇质量浓度分别为926.74、599.27、491.08、522.55 mg/L。由图2b可知，4株酵母酿造紫薯酒中的主要高级醇为β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、正丙醇。菌株AQ酵母酿造紫薯酒中β-苯乙醇质量浓度最高，达到447.03 mg/L；异戊醇、异丁醇质量浓度也较高，分别为203.36、213.96 mg/L。菌株SY酵母酿造紫薯酒中β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、正丙醇质量浓度较低，分别为145.4、130.2、117.78、97.7 mg/L。
图2 不同酿酒酵母酿造紫薯酒发酵过程中高级醇含量变化（a）及发酵后各高级醇组分含量（b）
Fig.2 Changes of higher alcohol contents(a) of PSPW brewed by different S. cerevisiae strains during fermentation process and the contents of higher alcohol composition(b) after fermentation
4株酵母发酵紫薯原酒中高级醇含量及组成含量的差异主要源于不同高级醇的合成途径的差异。例如，异戊醇主要由糖代谢和亮氨酸/缬氨酸代谢途径的中间体α-酮异己酸转化而成，而正丙醇则通常由苏氨酸代谢、2-甲基苹果酸代谢和丙酸代谢产生[11]。此外，不同酵母在氮源吸收速率、氨基酸降解能力以及糖合成代谢相关酶活性等方面也存在差异。发酵前期，酵母生长迅速，氨基酸降解代谢及糖合成代谢途径关键酶活性旺盛， 2条代谢通路共同生成高级醇。值得注意的是，生成高级醇最多的菌株AQ同时也表现出最强的果胶酯酶活性。发酵后期高级醇生成速度也逐渐放缓，可能与体系pH值降低，酵母代谢减缓，果胶酶活性降低和氨基酸底物减少有关。
结果表明，菌株SY酿造紫薯酒高级醇质量浓度及各高级醇组分质量浓度最低，但主要高级醇总质量浓度仍略高于400 mg/L。相关研究指出，当葡萄酒等果酒中高级醇质量浓度大于400 mg/L，会导致负面风味效应，并易引起头痛[26]。提示有必要继续寻求减少紫薯酒酿造中高级醇生成的有效手段。
除果胶分解途径外，甲醇也可通过甘氨酸代谢途径生成：甘氨酸脱去羧基和氨基形成甲醇，或者在甘氨酸脱羧酶的作用下先脱羧生成甲胺，再与亚硝酸反应，脱去氨基生成甲醇[6,27]。实际酿酒过程中，甘氨酸的来源和转化途径复杂，难以直接分析其对甲醇生成的贡献，在此借助添加甘氨酸的模拟酿酒体系进行讨论。
由图3a1、b1可知，在发酵过程中，4株酿酒酵母的产气量均呈现先增加后平缓的趋势；菌株EC1119、RW、SY在添加甘氨酸模拟酿酒体系中产气量略高于对照组，但整体差异较小；菌株RW在添加、未添加甘氨酸模拟酿酒体系中产气量均最高。
图3 不同酿酒酵母在未添加（a）及添加甘氨酸（b）模拟酿酒体系发酵过程中的产气量、pH值和总酸含量变化
Fig.3 Changes of gas production,pH values and total acid contents in simulated winemaking systems inoculated with different S. cerevisiae strains under glycine-free(a) and glycine-supplemented(b) treatments
由图3a2、b2可知，4株酵母发酵过程中pH值均呈现先快速下降后缓慢回升的趋势，并在发酵后期趋于稳定，最终体系pH值均为4.18～4.35；添加甘氨酸模拟酿酒体系的初始和终点pH值均低于对照，但发酵结束pH值差距较小；添加甘氨酸模拟酿酒体系中，菌株SY发酵结束pH值最低，而对照组中菌株AQ的终点pH值最低。
由图3a3、b3可知，发酵过程中总酸含量整体呈现先升高后略有下降的趋势，与pH值的变化规律基本一致；发酵结束后，添加甘氨酸模拟酿酒体系中，总酸含量均高于对照组，这可能由于外源添加的甘氨酸作为可利用氮源，促进酵母生长及氮代谢活性，从而增强糖代谢与有机酸生成[28]；其中，与对照组相比，菌株SY在添加甘氨酸的条件下，总酸含量增加最为显著。
由图4a可知，对照组菌株RW发酵结束后乙醇体积分数最高（12.2%），而添加甘氨酸后，菌株RW发酵结束后乙醇体积分数略低（12.0%），其余组间相差较小。由图4b可知，未添加甘氨酸的模拟酿酒体系中也产生了一定量的甲醇，推测是由于发酵期间代谢产生的甘氨酸部分通过酿酒酵母的代谢转化成甲醇。发酵结束后，添加甘氨酸组EC1118体系中甲醇质量浓度最高，为117.11 mg/L；与对照组相比，添加甘氨酸后各酵母发酵体系中的甲醇生成量均有所增加，其中以菌株EC1118发酵体系中的甲醇增幅最为显著，增加量为37.61 mg/L。综上，4种酵母均具有通过甘氨酸代谢途径产生甲醇的能力，其中，菌株AQ通过甘氨酸途径生成甲醇的能力相对较弱。
图4 添加甘氨酸模拟酿酒体系发酵后的乙醇体积分数（a）及甲醇含量（b）
Fig.4 Ethanol content(a) and methanol content(b) in simulated winemaking system with glycine addition after fermentation
根据甘氨酸代谢生成甲醇的途径计算，10 g/L甘氨酸完全转化成甲醇的理论产量为4.268 g/L[2]。本实验酿酒模拟体系中的甲醇生成量远低于此数值（转化率3%以内）。甘氨酸在发酵过程中可参与多种代谢途径，其中转化成甲醇的比例相对有限。Liang Minghua等[27]对添加甘氨酸的甘蔗酿酒体系的研究结果显示，甘氨酸代谢生成甲醇的转化率可达24.56%。需要指出的是，该研究中甘氨酸的添加量范围为0～0.9 g/L，即使在最高添加量（0.9 g/L）条件下，甲醇生成量仍低于100 mg/L。而本研究中所采用的甘氨酸添加量为10 g/L，显著高于上述报道，高浓度的外源甘氨酸受代谢能力限制，转化生成甲醇的比例相对减少。此外，不同酵母菌株中甘氨酸裂解酶等代谢酶活性的差异也可能影响甘氨酸向甲醇的转化效率。具体原因有待进一步研究。
4株酵母通过甘氨酸代谢途径生成甲醇的能力排序为菌株EC1118＞菌株RW＞菌株SY＞菌株AQ，与不同酵母在果胶分解代谢途径生成甲醇能力的强弱不完全一致。这种差异可能与不同酵母在果胶酯酶、甘氨酸脱羧酶的表达和活性差异相关。菌株EC1118在2种代谢途径中均表现出较强的甲醇生成能力，而菌株SY在2种代谢途径中产生的甲醇均较少，且其发酵过程中的果胶酯酶活性相对较弱。
综上，紫薯酒发酵过程中，果胶分解和甘氨酸代谢2种甲醇生成途径同时存在，在紫薯酒发酵过程中，果胶分解途径是甲醇生成的主导来源，其对甲醇生成的贡献远大于甘氨酸代谢途径。因此，果胶相关代谢过程的控制仍应作为降低紫薯酒中甲醇水平的关键。
本研究以紫薯浆为原料酿造紫薯酒，不同酿酒酵母酿造紫薯酒的乙醇体积分数为14.3%～15.4%，花青素质量浓度为374.89～412.04 mg/L，甲醇质量浓度为526.69～574.27 mg/L，高级醇（β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、正丙醇等）质量浓度为491.08～926.74 mg/L。紫薯酒发酵过程中，体系中的果胶含量持续下降，果胶酯酶活性呈现先增强后减弱的变化趋势。紫薯酒添加甘氨酸模拟酿酒体系实验结果显示，4株酿酒酵母模拟酿酒体系中的产气量、pH值、总酸含量变化规律均与实际紫薯酒发酵过程基本一致，均具有将甘氨酸转化为甲醇的能力。紫薯酒发酵过程中，果胶分解途径与甘氨酸代谢途径同时参与甲醇的生成，但果胶分解途径对甲醇生成的贡献远高于甘氨酸代谢途径。总体而言，菌株SY在2种甲醇生成途径中的代谢水平均较低，其所酿造紫薯原酒甲醇、高级醇含量相对较低，产酸能力适中，花青素含量高，是应用于紫薯酒发酵的最佳菌株。
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