表1 动物实验方案设计
Table1 Animal experimental design of scheme
MD高糖高脂饲料+1 000 mg/（kg∙d）醋复方口服液灌胃组别饲料及每日灌胃剂量NC正常基础饲料+400 μL生理盐水灌胃DC高糖高脂饲料+400 μL生理盐水灌胃PC高糖高脂饲料+860 mg/（kg∙d）益可颗粒灌胃LD高糖高脂饲料+500 mg/（kg∙d）醋复方口服液灌胃HD高糖高脂饲料+1 500 mg/（kg∙d）醋复方口服液灌胃
Hypoglycemic Effect and Mechanism of Compound Vinegar Oral Liquid on Diabetic Mice
CHEN Yang, GONG Jinxiu, LI Defu, et al. Hypoglycemic effect and mechanism of compound vinegar oral liquid on diabetic mice[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 174-184. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.022. http://www.chinabrewing.net.cn
随着人民生活习惯和饮食结构的变化，糖尿病发病率不断升高[1-2]。据统计，中国糖尿病人数在2021年达1.4亿，约占全球患者总数的1/4，2045年预计升至1.74亿，居全球首位[3]。糖尿病已成为一种广泛存在的慢性代谢性疾病，长期血糖增高可引起机体代谢紊乱，造成多系统损伤，进而引发糖尿病足、糖尿病肾病等多种并发症[4]，极大威胁着患者健康和生活质量，也给全球公共卫生造成沉重负担[5]。临床用药多以磺酰脲类和双胍类药物为主，但会产生副作用和耐药性问题[6]。因此，寻找安全有效的新型糖尿病预防方式已成为迫切需求[7]。
“药”和“食”的结合在我国一直备受重视，强调食物与药物在防治疾病中的协同作用，饮食和运动疗法被公认为是防治糖尿病的基本方法[8]，从传统天然中药中寻找安全的降血糖物质，开发糖尿病防治的功能性食品一直是研究的热点[9-11]。葛根素有“南葛北参”之称，具有生津止渴、改善胰岛素抵抗等功效，被广泛用于糖代谢异常的干预[12]。地黄自古以来就被广泛用于消渴病治疗，与葛根、人参和瓜蒌被称为治疗糖尿病“四大圣药”[13]。在网络药理学研究中，“葛根-桑叶”药对可发挥降脂降糖作用，控制糖尿病发展[14]。丹参葛根配伍具有升阳化瘀、通脉止痛作用[15]。这些中药疗效明确，安全性高，适合作为功能性食品的组方基础。
山西老陈醋作为我国4大名醋之一，含多酚、有机酸、类黑精等多种营养健康成分，具有降血糖、抗氧化、降血脂等多种健康功效[16-18]。醋作为炮制辅料及药用的历史十分悠久，“醋制入肝”是最具代表的炮制理论之一[19]。因此，山西老陈醋除作为日常生活必需的酸性调味品被广泛应用于食品烹调与加工之外，在健康食品开发领域也取得显著进展，衍生出醋胶囊、醋口服液、醋膏等多种形式的保健食品[20-23]。中药是中国传统医学的重要组成，在多靶点调控、防治疾病及养生保健等方面具有多维度优势[24-25]，以中药为主体的降血糖产品因其含有多种活性成分、安全性高、无副作用等优点而备受关注[26-28]。
为顺应国民日益增长的健康意识与需求，改善糖尿病及相关糖脂代谢慢性疾病，本研究以山西老陈醋为基础，根据中医辨证论治的理论指导，复配葛根、桑叶、生地黄、丹参4种具有明确降血糖功效的中药组分，研发一款有助于降血糖的产品—醋复方口服液，协同发挥其降血糖的保健功效。本研究建立小鼠糖尿病模型，以醋复方口服液进行干预，从生理生化及代谢组学水平阐明其降血糖作用及分子机制，分析醋复方口服液可能影响的代谢途径，为辅助糖尿病防治提供膳食干预的新策略。
雄性昆明（KM）小鼠（体质量（26±2）g，动物生产许可证号：SCXK（京）2024-0001）、D12079B高糖高脂饲料 斯贝福（北京）生物技术有限公司。
山西老陈醋 山西紫林醋业股份有限公司；葛根（Puerariae Lobatae Radix）、桑叶（Morus alba L.）、生地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）、丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）（执行标准参照《中国药典》2020年）四川省洪雅县瓦屋山药业有限公司；益可颗粒 华北制药集团新药研究开发有限责任公司。
葡萄糖、链脲佐菌素（streptozocin，STZ） 北京索莱宝科技有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；96 T总蛋白定量测定试剂盒（BCA法） 南京建成生物工程研究所。
AR323AN电子天平 奥豪斯仪器（常州）有限公司；UKSTN-50多功能提取浓缩机组 福州法莫优科机械科技有限公司；S20K pH计 梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司；GA-3血糖测试 三诺生物传感股份有限公司；GL25M高速离心机 江苏新春兰科学仪器有限公司；SHZ-82恒温水浴锅 上海予卓仪器有限公司；TISSUEPREP-02组织破碎仪 上海净信实业发展有限公司；SYNEKGY4多功能酶标仪 美国BioTek公司； UHPLC-Exploris240超高效液相色谱串联傅里叶变换 质谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。
1.3.1 口服液样品制备
山西老陈醋经减压浓缩，真空度维持在-0.07 MPa， 加热温度维持在80 ℃，得到醋浓缩液；中药按葛根6 g、桑叶4 g、生地黄4 g、丹参3 g的配比称取，再以料液比1∶10（g/mL）与水混合，100 ℃煎煮80 min后过滤，煎煮2次，经提取浓缩工艺得到中药提取液；按1∶3的体积比将醋浓缩液和中药提取液复配后再进行过滤消杀，得到产品，备用。
1.3.2 糖尿病小鼠模型建立
动物实验方案参考《保健食品功能检验与评价方法（2023年版）》中“有助于维持血糖健康水平”规定。随机选取12只小鼠为正常对照组（NC），测定禁食3～5 h后的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。其他小鼠禁食24 h后腹腔注射STZ 130 mg/kg（用冰浴预冷的柠檬酸缓冲液配制1 g/100 mL STZ注射液，现用现配），饲喂高糖高脂饲料。7 d后小鼠禁食4 h后测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）值，在10～25 mmol/L 之间则为造模成功。
1.3.3 分组及灌胃
将造模成功的小鼠分为糖尿病模型组（DC）、市售辅助降糖保健品组（PC）（860 mg/kg）、醋复方口服液低剂量组（LD，500 mg/kg）、醋复方口服液中剂量组（MD，1 000 mg/kg）、醋复方口服液高剂量组（HD，1 500 mg/kg），PC组为人体推荐剂量的10倍，低、中、高剂量醋复方口服液分别为人体推荐剂量的5、10、15倍。 每组小鼠12只，实验期间每天对灌胃干预的4组小鼠给予不同受试样品，NC组和DC组给予蒸馏水，每天上午9点灌胃，小鼠自由饮食饮水。每周称体质量1次，按体质量调整受试样品剂量，持续4周。所有小鼠在干预期间饲料不作改变，具体实验方案设计见表1。
表1 动物实验方案设计
Table1 Animal experimental design of scheme
MD高糖高脂饲料+1 000 mg/（kg∙d）醋复方口服液灌胃组别饲料及每日灌胃剂量NC正常基础饲料+400 μL生理盐水灌胃DC高糖高脂饲料+400 μL生理盐水灌胃PC高糖高脂饲料+860 mg/（kg∙d）益可颗粒灌胃LD高糖高脂饲料+500 mg/（kg∙d）醋复方口服液灌胃HD高糖高脂饲料+1 500 mg/（kg∙d）醋复方口服液灌胃
1.3.4 一般指标测定
实验期间，观察小鼠精神状态，每周检测1次小鼠摄食量、饮水量及FBG下降率。血糖下降率按式（1）计算：
1.3.5 口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）
4周后，各组小鼠均禁食4 h，以2.00 g/kg葡萄糖溶液灌胃，测定灌胃后0、0.5、1、1.5、2 h血糖值。OGTT曲线下面积（area under curve，AUC）按式（2）计算：
式中：A、B、C、D和E分别代表灌胃葡萄糖后0、0.5、1、1.5、2 h血糖值/（mmol/L）。
1.3.6 血样收集与组织处理
末次给药后采用眼球取血方式收集血样，静置后离心，血清为上层浅黄色透明液体。吸干肝脏和胰脏组织水分，称质量，记录，各器官质量与体质量的比值即为脏器指数，样本均冻存于-80 ℃备用。所有的动物实验均根据机构动物伦理学委员会指导方针进行。
1.3.7 生化指标检测
采用ELISA试剂盒测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量；取0.1 g肝组织，按1∶9（g/mL）加入生理盐水研磨后静置离心，收集上清液，按试剂盒说明测定组织中蛋白浓度，再采用ELISA试剂盒测定SOD、CAT、MDA、GSH-Px、IL-6、TNF-α含量或活性。
1.3.8 非靶向代谢组学分析
加入400 µL提取液（甲醇∶水＝4∶1，V/V）于小肠内容物样本中，研磨仪-10 ℃、50 Hz研磨6 min，5 ℃超声提取30 min，-20 ℃静置30 min，离心15 min（13 000×g、4 ℃），移取上清液至带内插管的进样小瓶中，进行液相色谱-串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测。另外，每个样本分别移取20 µL上清液，混合后作为质控样本。
LC条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）；流动相A：5%乙腈溶液（含0.1%甲酸），流动相B：47.5%乙腈+47.5%异丙醇+ 5%水（含0.1%甲酸），进样量为3 μL，柱温为40 ℃。
MS条件：电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集MS信号。具体参数：扫描范围m/z 70～1 050，鞘气流速60 arb，辅助气流速20 arb，加热温度350 ℃，毛细管温度320 ℃，喷雾电压3 400 V（正离子模式）、 -3 000 V（负离子模式），S-Lens电压70 V，归一化碰撞能量20%、40%、60%，检测方式为全扫描/数据依赖二级扫描（Full-MS/dd-MS2）模式，一级和二级分辨率分别为60 000和15 000。最后将数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI v3.0，获得数据矩阵，用于后期处理及生信分析。
采用GraphPad Prism 8.0.1对实验结果进行分析并绘图，数据以
±s表示。小肠代谢物的代谢组学分析通过美吉生物公司分析平台（https://cloud.majorbio.com/page/project/overview）进行处理，分别在京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和人类代谢组学数据库（Human Metabolome Database，HMDB）进行代谢物注释比对。
糖尿病造模前，小鼠精神活跃、反应迅速、摄食饮水量均处于正常水平、毛发洁白顺滑。注射STZ后，各造模组小鼠均出现典型的三多一少症状（多饮、多食、多尿和体质量减轻）[29]，且精神萎靡、反应迟缓、皮毛杂乱粗糙。在给药治疗期间，NC组小鼠各项状态良好，而DC组糖尿病症状愈加严重，与DC组相比，各复方口服液干预组和PC组整体状况有所改善，HD组状态最佳。
由图1A可知，NC组小鼠体质量稳步增加，而其他组体质量呈下降趋势，DC组体质量显著低于NC组 （P＜0.001）。给药1周后，小鼠体质量明显减轻，这可能是小鼠对灌胃行为产生的应激反应所导致的[30]。给药4周后，相比DC组体质量（（26.08±2.49）g），PC组（（29.05±1.52）g）、MD组（（28.28±2.38）g）与HD组（（29.78±1.72）g）均有较大幅度提高，HD组体质量显著增加（P＜0.01）。
图1 醋复方口服液对小鼠体质量（A）、摄食量（B）、饮水量（C）及FBG （D）的影响
Fig.1 Effect of compound vinegar oralliquid on body weight(A),food intake(B),water intake(C) and FBG(D) in mice
由图1B可知，DC组小鼠摄食量从第2周的（8.86±1.08）g增至第4周的（9.70±0.93）g，与NC组相比，均具有显著差异（P＜0.05、P＜0.01）。干预4周后，PC、LD、MD、HD组小鼠摄食量分别为（8.14±0.46）、（9.27±1.19）、（8.43±0.89）、（7.84±0.68）g，HD组摄食量显著低于DC组（P＜0.05），MD组虽与DC组比差异不显著（P＞0.05），但也在一定程度上减缓了小鼠摄食量的增长。
由图1C可知，第1周时，DC组饮水量为（37.00±2.91）mL，与NC组（6.59±0.80）mL相比显著增加（P＜0.001），给药干预期间，市售辅助降糖保健品和中、高剂量醋复方口服液可有效改善DM小鼠饮水量增长趋势，4周后HD组小鼠饮水量（29.49±0.72）mL，相比DC组（36.71±3.98）mL差异显著（P＜0.01），低剂量组为（31.32±1.39）mL，与DC组相比无显著差异 （P＞0.05）。
由图1D可知，与NC组相比，DC组FBG显著增加（P＜ 0.001），在干预第1周，PC、MD、HD组与DC组相比显著降低（P＜0.05），降幅随灌胃时间的延长而扩大。LD、MD、HD组在4周干预后FBG下降率分别为12.61%、17.61%、24.32%。
总体而言，醋复方口服液能缓解DM小鼠体质量下降趋势，降低摄食饮水量及FBG，且高剂量复方口服液效果优于低、中剂量醋复方口服液和市售辅助降糖保健品。
OGTT-AUC可整合各时间点血糖水平，能够更全面、精准地评估小鼠血糖波动特征，进而判定各组小鼠的血糖调节能力差异[31]。如表2所示，在给予葡萄糖30 min后，各组小鼠血糖值均达到最高水平，随后各组血糖值均有所降低。DC组各时间血糖值高于NC组，AUC显著高于NC组（P＜0.001），提示糖尿病可能会引起小鼠FBG升高和糖耐量下降。与DC组相比，不同剂量醋复方口服液组小鼠血糖值均有所降低，各剂量组AUC分别下降9.36%、12.54%、17.40%，表明醋复方口服液能降低糖尿病小鼠葡萄糖负荷后的血糖值，增强葡萄糖耐量，促进胰岛素分泌，特别是HD组效果更为明显 （P＜0.01），LD组则无统计学差异，表明该产品在糖尿病小鼠糖代谢改善上有一定的剂量依赖性。
表2 醋复方口服液对糖尿病小鼠糖耐量的影响
Table2 Effect of compound vinegar oralliquid on glucose tolerance in diabetic mice
组别血糖/（mmol/L）AUC/0 min30 min60 min90 min120 min（h∙mmol/L）NC8.15±0.9312.73±1.5610.70±0.718.87±0.808.00±0.7820.19±0.70 DC27.47±1.8832.25±1.5829.92±1.6228.48±1.0827.55±1.5659.08±1.43###PC22.42±1.2927.62±1.4625.23±0.6923.35±1.6322.77±1.4149.40±0.83*LD24.27±1.6430.12±1.7827.27±1.5925.22±1.1324.73±2.1353.55±1.25 MD23.08±2.0528.80±2.0527.77±2.5424.05±1.4022.33±2.0351.67±1.39*HD21.47±1.4227.05±1.0225.37±0.9023.52±1.4721.87±1.3548.80±0.97**
注：与NC组比较，###.差异极显著（P＜0.001）；与DC组比较，*.差异
显著（P＜0.05），**.差异高度显著（P＜0.01）。表3同。
肾脏、肝脏等脏器指数是衡量小鼠生长状况最为重要的指标，也是食品干预作用机制的重要参考参数[32]。由表3所示，与NC组相比，DC组小鼠肝脏指数、肾脏指数均显著增加（P＜0.001），表明DC组小鼠的肝脏及肾脏可能出现明显病变。与DC组相比，其他各组小鼠肝脏、肾脏指数均有所下降，其中，HD组肝脏指数及肾脏指数显著下降（P＜0.05），表明不同样品对糖尿病小鼠有一定的肝脏、肾脏保护作用，以HD效果最为突出。
表3 醋复方口服液对糖尿病小鼠脏器指数的影响
Table3 Effect of compound vinegar oralliquid on organ indices in diabetic mice
HD2.19±0.307.69±0.72*0.63±0.062.21±0.15*组别肝脏质量/g肝脏指数/%肾脏质量/g肾脏指数/%NC1.93±0.344.45±0.830.71±0.071.61±0.20 DC2.53±0.329.25±0.95###0.73±0.052.66±0.28###PC2.25±0.428.54±0.750.73±0.062.34±0.21 LD2.32±0.379.07±0.900.63±0.092.52±0.20 MD2.29±0.498.07±0.510.65±0.132.45±0.39
脂肪组织的过量积累易引起胰岛素信号传递受阻、胰岛素抵抗等相关疾病[33]。如图2所示，DC组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平与NC组相比均显著升高（P＜0.001），而HDL-C显著下降（P＜0.001），说明小鼠可能存在脂代谢异常，这极易导致机体胰岛素抵抗。与DC组相比，PC、MD、HD组小鼠血清TC、TG及LDL-C水平显著下降（P＜0.001），HDL-C显著升高（P＜0.01、P＜0.001），这是由于高脂饮食中更多的脂质需HDL-C转运。其中PC与HD组血脂水平变化程度相近，表现出最佳的降血脂活性，提示复方口服液对糖尿病小鼠血脂代谢异常的症状有改善作用。
图2 醋复方口服液对小鼠血清中血脂4项指标的影响
Fig.2 Effect of compound vinegar oralliquid on four indicators of serum lipids in mice
激活SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶可有效清除体内自由基，降低过氧化物产生，从而保护细胞免遭氧化损伤，增强机体抗氧化能力[34]。MDA可在一定程度上反映机体氧化水平[35]。由图3所示，DC组小鼠肝脏SOD、CAT和GSH-Px活性显著低于NC组（P＜0.001），分别降低56.22%、55.67%、54.88%，MDA水平显著升高231.39%（P＜0.001），表明小鼠肝脏内抗氧化酶活性下降，出现氧化应激，发生脂质过氧化反应。干预4周后，与DC组比较，各干预组指标均有向正常组转归的趋势，其中HD＞PC＞MD＞LD。LD、MD、HD组SOD活性均显著高于DC组（P＜0.01、P＜0.001），说明口服液具有较好的提高SOD活性的作用。3个剂量组CAT活性分别升高7.84%、44.86%、54.58%，GSH-Px活性分别升高11.89%、33.02%、62.51%，MDA水平均显著低于DC组（P＜0.001），分别降低30.90%、44.08%、55.67%，呈一定剂量依赖性。但LD组肝脏中CAT及GSH-Px水平与DC组相近，无显著差异（P＞0.05）。这说明高剂量醋复方口服液抗氧化效果最为显著，可有效抑制肝脏脂质过氧化，增强机体抵抗氧化损伤能力。
图3 醋复方口服液对小鼠肝脏抗氧化水平的影响
Fig.3 Effect of compound vinegar oralliquid on antioxidant levelin mouse liver
炎症反应是导致胰岛素抵抗的关键因素，也是糖尿病发生发展的机制之一[36]。TNF-α和IL-6是常见的炎症因子，可用于评价糖尿病小鼠肝脏组织的炎症情况。由图4可知，相较于NC组，DC组小鼠IL-6和TNF-α含量显著升高（P＜0.001）。与DC组相比，PC、MD、HD组TNF-α和IL-6含量显著降低（P＜0.001）。对于LD组而言，与DC组比较，IL-6含量显著降低（P＜0.05），但肝脏TNF-α含量未显著降低（P＞0.05）。Hou Weiyu等[37]采用二甲双胍和核桃衍生肽干预4周后，2型糖尿病小鼠肝线粒体中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低，说明核桃衍生肽在2型糖尿病小鼠中具有良好的抗氧化和抗炎作用。Li Kangxin等[38]研究发现，姜黄素长循环脂质体能够显著降低高脂饮食联合STZ诱导的2型糖尿病小鼠肝脏中促炎细胞因子TNF-α和IL-6水平，对肝脏产生有益影响，进而逆转小鼠的肝脏炎症和损伤。综上所述，口服液可抑制促炎因子表达，有改善炎症的效果。
图4 醋复方口服液对小鼠肝脏炎症因子的影响
Fig.4 Effect of compound vinegar oralliquid on hepatic inflammatory factors in mice
根据上述实验结果，对比市售辅助降糖保健品及醋复方口服液各剂量组，可得中、高剂量对于糖尿病小鼠各指标具有改善作用，高剂量醋复方口服液缓解作用仅略强于中剂量复方口服液，因此后续对MD组以及NC、DC组小鼠的小肠内容物样本进行小肠代谢物非靶向代谢组学分析，将中剂量醋复方口服液的灌胃剂量折算成人体每日口服剂量，分析醋复方口服液对糖尿病小鼠小肠代谢物的影响，寻找复方口服液改善糖尿病小鼠的差异代谢物及相关代谢途径。
2.7.1 质控分析
为确保检测过程的稳定性，在LC-MS分析中，每5～15个样品中插入一个质控样本。由图5可知，该检测条件下，正负离子模式峰形均良好，分布相对均匀，表明检测系统稳定可靠。
图5 质控样本的总离子流图
Fig.5 Totalionflow diagrams of quality control samples
2.7.2 代谢物鉴定分析
Venn图可直观展示多组样本间元素集合的重叠关系，常用于分析各对比组共有及特有差异代谢物分布特征[39]。经KEGG和HMDB数据库比对，在mix模式下共检测到NC、DC、MD组小鼠小肠内容物样本中代谢物6 764种。由图6可知，3组共有代谢物5 728种。代谢物主要包括多肽类、脂类、核酸、有机酸、维生素及辅因子、类固醇、激素类和递质[40]。与HMDB数据库比对，DC vs. NC共有代谢物5 821个，MD vs. DC共有代谢物5 889种，各对比组差异代谢物数量前10的HMDB分类结果见图7。
图6 不同组别小鼠小肠内容物代谢物的Venn图
Fig.6 Venn diagram of metabolites in intestinal contents of mice from different groups
图7 不同组小鼠代谢物数量排名前10的HMDB分类结果
Fig.7 Top10Human Metabolome Database classification results of metabolites in mice from different groups
由图7可知，DC vs. NC差异代谢物主要富集于脂类及类脂分子（21.05%）、有机酸及其衍生物（20.39%）和有机杂环化合物（16.45%）。这一分布特征提示，糖尿病状态下小鼠小肠代谢谱的变化主要集中在脂类代谢、能量代谢及炎症相关通路。MD vs. DC差异代谢物主要富集于脂类及类脂分子（31.43%）和有机酸及其衍生物（16.00%）。与DC vs. NC相比，干预后脂类差异代谢物占比显著升高，而有机酸、有机杂环类占比有所下降，醋复方口服液可能主要通过调控脂类代谢通路并缓解能量代谢及核苷酸代谢紊乱，从而改善糖尿病小鼠的代谢异常。
2.7.3 多元统计分析
基于小鼠小肠内容物代谢物含量进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。由图8A可知，组间样本分离明显，表明NC组与DC组之间代谢特征存在明显差异；由图8D可知，DC组与MD组样本在主成分空间中存在较大程度重叠，未实现完全分离。这一现象可能与以下因素有关：一方面，降维分析过程中存在信息损失，导致组间差异在二维/三维投影中未能完全体现；另一方面，也提示2组样本间的代谢轮廓差异本身相对较小，组内变异对分离效果的影响更为显著。OPLS-DA可最大程度去除与分类不相关的信息，弱化组内样本差异，最大化提高组间差异[41]。由图8B、E可知，NC、MD组均与DC组明显分离，OPLS-DA可将上述组别进行区分，将上述模型进行200次迭代的置换检验，
和
分别表示所建模型对X和Y轴的解释率，
）和 
）表示累计解释率；Q2标示模型预测能力，这3个指标越接近于1表示模型越稳定可靠，由图8C、F可知，该模型Q2、
趋近于1，此外Q2＞0.5，表示模型预测能力较好，该结果表明模型未过分拟合，验证模型稳定可靠。综上所述，OPLS-DA模型所识别的代谢特征能够稳定区分NC、DC组与MD组，为后续差异代谢物的筛选提供可靠分析基础。
图8 基于小鼠小肠内容物代谢物的PCA及OPLS-DA结果
Fig.8 Results of principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis based on metabolites in mouse small intestinal contents
2.7.4 差异代谢物筛选与分析
基于OPLS-DA模型，以P＜0.05、变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）＞1为筛选标准，分别对DC vs. NC和MD vs. DC进行差异代谢物筛选。由图9可知，DC vs. NC共有421种差异代谢物，79种上调，342种下调，提示糖尿病模型的建立可对小鼠小肠代谢物产生显著的不良影响，造成代谢紊乱。MD vs. DC共有249种差异代谢物，205种上调，44下调，表明复方醋口服液对糖尿病小鼠代谢调节效果显著。综上所述，中剂量醋复方口服液干预使MD组代谢物发生显著改变，可以缓解糖尿病小鼠代谢异常。
图9 小鼠小肠内容物差异代谢物火山图
Fig.9 Volcano plot of differential metabolites in mouse small intestinal contents
以P＜0.05、FC＞1.5，对2组对比组中50个核心差异代谢物进行聚类分析，通过可视化代谢物表达模式，直观揭示不同组间样本的相似性及代谢物共表达特征。由图10可知，DC vs. NC与MD vs. DC差异代谢物相对表达量存在明显差异。DC vs. NC中，抗炎及抗氧化应激相关成分显著下调，如磷脂酰乙醇胺（19:0/0:0）、2-羟基-3-甲基-4H-吡喃-4-酮-O-(6E-肉桂酰基-β-D-葡萄糖苷)、 4′-去甲基表鬼臼毒素等差异代谢物；布他前列素、阿贝西利等促损伤、促炎、促氧化应激相关代谢成分上调。这些差异代谢物的变化说明DC组面临脂质代谢障碍、胆汁酸代谢紊乱、炎症激活及氧化防御体系失衡等问题。
图10 差异代谢物的聚类热图
Fig.10 Cluster heatmap of differential metabolites
中剂量醋复方口服液干预4周后，磷脂酰肌醇（前列腺素 F2α/18:0）、神经酰胺（18:1_2O/18:2）等具有促进脂肪酸氧化、抗炎及调节膜功能的成分发生明显上调。值得注意的是，多种与糖尿病发生发展相关的成分发生显著下调，如神经酰胺NS、甘油磷酸乙醇胺类等，说明醋复方口服液可以改善糖尿病小鼠糖脂代谢异常、炎症反应，修复氧化损伤等。
对比两者共同的代谢差异物，发现醋复方口服液可以明显回调醚磷脂酰胆碱（O-31:2）、甘油磷酸乙醇胺（16:1/22:5）、神经酰胺（18:1_2O/18:2）、五肽（Val-Leu-Thr-Gly-Ser）等物质，覆盖脂质代谢、膜结构功能、胰岛素信号通路、氨基酸代谢等多个与糖尿病发病密切相关的维度。以上结果表明，口服液产品可以逆转这些病理变化，具有多靶点、多通路的降糖潜力，可能通过改善胰岛素敏感性、减轻炎症反应发挥作用。
2.7.5 KEGG代谢通路富集分析
借助KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析，采用超几何分布算法筛选获得前20条显著富集的KEGG通路，以揭示其在宿主代谢过程中的功能作用。由图11A可知，DC vs. NC差异代谢物主要富集于与糖脂调控相关的代谢通路，包括单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路、FoxO信号通路、抗叶酸耐药性、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸生物合成等。其中AMPK信号通路是血糖和血脂代谢的核心调控通路，在血糖调节方面，其可增强对葡萄糖吸收与利用、抑制糖异生，在脂质代谢方面，其能够抑制脂肪酸和TG合成、促进脂肪酸氧化，对血脂水平调控有重要作用。其差异富集提示糖尿病小鼠中AMPK信号通路出现异常，导致糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗等症状。由图11B可知，MD vs. DC差异代谢物主要富集于环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信号通路、胆汁分泌、内分泌抵抗、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢等通路，均为糖脂代谢的核心关联通路，差异富集提示MD组与DC组在损伤及炎症、能量生成、血糖血脂调控及代谢上存在显著区别。以上结果表明，高脂饮食可显著扰动小鼠糖脂及氨基酸代谢通路，扰乱机体正常代谢与消化功能。醋复方健康产品可有效调控高脂饮食小鼠的糖代谢、脂质代谢及氨基酸代谢紊乱，在改善糖脂代谢失衡中发挥重要作用，与本研究预期作用机制一致。
图11 KEGG通路富集气泡图
Fig.11 Bubble plots ofKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment
本研究将山西老陈醋与4种降糖中药复配得到降血糖醋复方口服液产品，对产品的降糖作用机制及代谢通路进行研究。动物实验表明，DC组中的小鼠表现出“三多一少”、血糖水平升高、葡萄糖耐量受损、脏器病变、血脂异常、氧化损伤、炎症反应等，这些症状在复方醋口服液干预组中得到改善，并呈现一定的剂量依赖性，尤其中、高剂量口服液对糖尿病小鼠血糖有显著改善作用。非靶向代谢组学分析结果显示，中剂量醋复方口服液可通过多靶点和多机制调节机体血糖血脂代谢、炎症及氧化应激水平等，从而减少因血糖升高导致的各种代谢异常和炎症反应，改善糖尿病小鼠的整体状态。综上所述，本研究中醋复方口服液具有调节血糖和血脂能力，证明山西老陈醋与复方中药结合开发成新的保健食品较为可行，具有满足人们对健康饮食和功能性食品需求的潜力和广阔的开发应用前景，为降糖保健食品的开发提供了一个新思路，为降血糖醋复方口服液的应用提供了依据。
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