图1 后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅中真菌Chao1指数（A）和Shannon指数（B）
Fig.1 Chao1index(A) and Shannon index(B) for fungiin fermented grains by Houhuo,Qingcha and Hongxin low-temperature Daqu
Analysis of Fungal Communities in Fermented Grains by Houhuo, Qingcha and Hongxin Low-Temperature Daqu
DING Yuzhe, HOU Qiangchuan, LIU Zhongjun, et al. Analysis of fungal communities in fermented grains by Houhuo,Qingcha and Hongxin low-temperature Daqu[J]. China Brewing, 2026, 45(6): 106-113. (in Chinese with English abstract)DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.06.014. http://www.chinabrewing.net.cn
清香型白酒作为我国3大香型白酒之一，其所占白酒市场份额逐年提升，且消费者偏好占比已超过酱香型和浓香型白酒，居于首位[1]。这一趋势对清香型白酒的工艺传承与技术创新提出了更高要求。根据用曲和工艺的不同，清香型白酒又分为大曲清香[2]、小曲清香[3]和麸曲清香[4]。大曲清香以山西汾酒为代表，占清香型白酒市场的85%，主导高端市场[1]。低温大曲是酿造大曲清香白酒的糖化发酵剂，以大麦和豌豆为主要原料，采用“两低一长”工艺制作而成，即低温入窖、低温培菌和长发酵周期[5]。古语有言“曲，乃酒之骨”。低温大曲中富含微生物和酶系，是酒醅发酵阶段的关键所在，对大曲清香白酒的品质至关重要。
在大曲的堆积发酵过程中，曲堆内部空气不流通，散热不均，使得不同位置大曲所处环境的温度、相对湿度和含氧量均有所差异，这种现象被称为空间异质性[6]。研究表明，空间异质性会使高温大曲的表观颜色和内部微生物群落结构产生明显差异[7-8]。低温大曲同样如此，但差异并不体现在表观，而是在内部。根据曲块的断面颜色，低温大曲被分为后火曲（断面中心有褐色斑块）、清茬曲（断面无杂色）和红心曲（断面中心有红色斑块）[9]。Hou Qiangchuan等[10]研究发现，芽孢杆菌属（Bacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、泛菌属（Pantoea）、小浴氏菌属（Kosakonia）和乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）是低温大曲中的主要微生物类群。后火曲、清茬曲和红心曲中分别显著富集变形菌门、放线菌门和子囊菌门的微生物，3种类型低温大曲中菌群的基因功能亦存在明显差异，在后火曲中，有关糖的降解途径显著富集，而在清茬曲中有关氨基酸合成的途径显著富集。
本研究按照大曲清香型白酒的酿造工艺，分别将后火曲、清茬曲和红心曲投入到清香型白酒大茬酒醅的发酵中，然后采用Illumina MiSeq高通量测序技术对3种类型低温大曲发酵的大茬酒醅真菌群落结构进行解析，并对结果进行主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）、线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）及相关性分析，旨在阐明3种不同类型低温大曲对酒醅真菌群落的影响，以期为清香型白酒酿造的酒曲选择与工艺优化提供理论依据。
低温大曲、大茬酒醅采集自湖北襄阳某清香型白酒生产企业。
土壤基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；rTaq聚合酶 宝日医生物技术（北京）有限公司；正/反向引物ITS3F/ITS4R 上海赛恒生物科技有限公司；Biowest琼脂糖 法国Biowest公司；MiSeq v3测序试剂盒 美国Illumina公司。
Vetiri梯度基因扩增仪 美国AB公司；164-5050基础电泳仪 美国Bio-Rad公司；Fluor Chem FC3化学发光凝胶成像系统 美国Protein Simple公司；MiSeq PE300高通量测序平台 美国Illumina公司。
1.3.1 大茬酒醅制作方法
2023年在湖北襄阳市某清香型白酒生产企业的曲库中随机采集后火曲、清茬曲和红心曲各10块，共计30份。 将大曲在实验室条件下粉碎后，每份酒曲称取75 g曲粉（约占高梁干质量的9%）装入无菌自封袋中，带至白酒生产企业。在白酒生产企业的酒醅生产线上取经粉碎、润糁、蒸煮和摊晾后的高梁物料30份，每份物料1 650 g（含水量约50%）。将事先粉碎好的大曲粉与高梁物料混合均匀后装入2.5 L的陶瓷坛中，坛口密封后加盖。30个 陶瓷坛均装入同一个地缸，用塑料布和水泥板密封。发酵28 d后取出陶瓷坛，在常温下运送回实验室进行后续分析。
1.3.2 宏基因组DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增和高通量测序参照基因组提取试剂盒说明书对酒醅中真菌宏基因组DNA进行提取，使用添加了核苷酸序列标签的引物（ITS3F：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对真菌DNA的内源转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）2区进行特异性PCR扩增。PCR扩增体系和扩增程序参照腾军伟等[11]的方法进行。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检验，扩增成功的PCR产物送至上海美吉生物科技有限公司完成高通量测序。
1.3.3 生物信息学分析
参照郭壮等[12]的方法，在QIIME 1.9.1生物信息学平台对测序返回的fq文件进行序列质控和分析。经过质控的有效序列使用两步UCLUST方法进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）划分[13]。每个OTU中选择最长序列作为代表性序列与UNITE 7.2数据库进行序列比对完成物种注释[14]。基于获得的OTU数据，对各样品中真菌群落的Chao1指数和Shannon指数进行计算，然后进行PCoA、LEfSe和随机森林 分析。
采用Kruskal-Wallis检验进行组间差异性分析；采用GraphPrism 9.5软件实现Chao1指数、Shannon指数、优势真菌门和属数据的可视化；采用Excel 2021软件对核心OTU进行数量统计、相对丰度计算和数据的可视化；采用R 4.3.2软件完成菌群间相关性分析，然后采用Gephi 0.9.2实现数据可视化；采用R 4.3.2软件进行PCoA、LEfSe分析和随机森林分析并实现数据可视化。
经测序共获得1 363 123条序列，经质控过滤掉15 939条序列，余下1 347 184条有效序列，有效序列共划分到4 032个OTU。平均每个样品中含有44 906条有效序列和987个OTU。基于所得OTU数据，计算每个酒醅样品中的Chao1指数和Shannon指数，它们分别表征群落中微生物的丰富度和多样性[15]，结果见图1。
图1 后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅中真菌Chao1指数（A）和Shannon指数（B）
Fig.1 Chao1index(A) and Shannon index(B) for fungiin fermented grains by Houhuo,Qingcha and Hongxin low-temperature Daqu
由图1A可知，后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅中的平均Chao1指数分别为1 587、1 499和1 451，经Kruskal-Wallis检验发现，后火曲酒醅的Chao1指数显著高于红心组（P＜0.05）。由图1B可知，后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅中的平均Shannon指数分别为2.92、2.63和2.75。经Kruskal-Wallis检验发现，3组酒醅之间的Shannon指数无显著差异（P＞0.05）。结果表明，不同类型低温大曲发酵的酒醅真菌α-多样性差异主要表现在菌群丰富度上，而菌群多样性差异不明显。
所有有效序列被鉴定到4个门、10个纲、15个目、30个 科和45个属。基于平均相对丰度＞1.0%的优势真菌门和优势真菌属展开分析，结果见图2。
图2 后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅中优势真菌门（A）、优势真菌属（B）相对丰度及其差异分析（C）
Fig.2 Relative abundance of dominant fungal phyla(A),dominant fungal genus(B) and difference analysis(C) of fermented grains by Houhuo,Qingcha and Hongxin low-temperature Daqu
由图2A可知，所有酒醅样品中平均相对丰度＞1.0%的优势真菌门仅有子囊菌门（Ascomycota）（99.84%）；由图2B可知，所有酒醅样品中平均相对丰度＞1.0%的优势真菌属有7个，分别为隶属于Ascomycota的酵母属（Saccharomyces）（68.28%）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）（9.72%）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）（9.57%）、曲霉属（Aspergillus）（2.55%）、有孢圆酵母属（Torulaspora）（2.39%）、毕赤酵母属（Pichia）（2.33%）和耐干霉菌属（Xeromyces）（1.03%）。由此可见，清香型白酒酒醅中的优势真菌均由隶属于Ascomycota的菌群构成。上述菌群在酿酒相关研究领域已被广泛报道[16-17]。Saccharomyces中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酿酒过程中产生乙醇的重要菌种[18]，扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）在低温大曲中的主要菌种之一[19]。研究发现，尽管Kazachstania中的菌种发酵性能不如Saccharomyces，但部分菌种在与S. cerevisiae共同发酵时会提供更加多样化的香气特征[20]。与此同时，Kazachstania中的部分菌种有着良好的抗逆性能，能够耐乙醇和低温[20]。此外，Aspergillus中的菌种通常具有较强的产酶能力，能够将淀粉和蛋白质分解为葡萄糖和氨基酸，从而供其他微生物所利用[21]。
由图2C可知，经Kruskal-Wallis检验结果显示，后火曲酒醅中的Saccharomycopsis和Aspergillus相对丰度显著高于其他2组（P＜0.05），清茬曲酒醅中的Saccharomycopsis相对含量显著高于红心曲酒醅（P＜0.05），红心曲酒醅中Torulaspora和Pichia相对丰度显著高于后火曲酒醅（P＜0.05）。
由图3A可知，30份样品中共存在119个核心OTU，共被鉴定到1个目、1个科和9个属，分别被鉴定为Saccharomyces（包含10个OTU，67.43%）、Kazachstania（包含6个OTU，9.40%）、Saccharomycopsis（包含66个OTU，7.78%）、Aspergillus（包含1个OTU，1.95%）、Torulaspora（包含4个OTU，1.93%）、Pichia（包含8个OTU，1.68%）、酵母目（Saccharomycetales）（包含14个OTU，1.12%）、Hanseniaspora（包含4个OTU，0.61%）、Wickerhamomyces（包含2个OTU，0.49%）、Naumovozyma（包含3个OTU，0.27%）和酵母科（Saccharomycetaceae）（包含1个OTU，0.01%）。 由图3B可知，所有核心真菌的累计序列相对丰度为92.67%。尽管Hanseniaspora和Wickerhamomyces相对丰度较低，但亦是大曲中常见的真菌类群，其作用不容忽视。葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）被证明具有较强的产酯能力，被广泛应用至白酒和葡萄酒 领域[22-23]。陈勇等[24]研究表明，Wickerhamomyces与浓香型大曲中的多种挥发性风味物质之间存在密切相关性。结果表明，3组酒醅中的核心菌群主要由优势菌群组成，但也包括Hanseniaspora和Wickerhamomyces等较低相对丰度菌群。
图3 后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅OTU数量（A）及其序列累计相对丰度（B）
Fig.3 Number of OTUs(A) and the cumulative sequence relative abundance(B) of fermented grains by Houhuo,Qingcha and Hongxin low-temperature Daqu
本研究基于OTU水平进一步对后火、清茬和红心低温大曲发酵酒醅中真菌群落间的相关性进行共现网络分析，将相关系数|r|≥0.7且P＜0.05的相关性关系定义为强相关关系，结果见图4。
图4 后火（A）、清茬（B）和红心（C）低温大曲发酵酒醅中真菌群落共现网络分析
Fig.4 Co-occurrence network analysis of fungal communities in fermented grains by Houhuo(A),Qingcha(B) and Hongxin(C)low-temperature Daqu
由图4可知，后火曲、清茬曲和红心曲酒醅真菌群落共现网络分别由15、18个和17个节点（OTU）组成，这些OTU均属于优势真菌类群，如Saccharomyces、Kazachstania、Saccharomycopsis、Torulaspora和Pichia等。后火曲、清茬曲和红心曲酒醅中分别存在64、93对和46对强相关性关系，后火曲、清茬曲和红心曲酒醅中正相关关系分别达89.06%、62.37%和56.52%。结果表明，清茬曲酒醅中真菌群落间相关性更为密切，而后火曲酒醅中群落间表现为更多的正相关关系。
对不同类型低温大曲发酵大茬酒醅的真菌群落结构进行PCoA和组间马氏距离分析。由图5A可知，3组酒醅样品在二维空间结构中存在部分重叠，但仍有明显分离趋势，后火组曲酒醅样品点主要分布在第3象限，清茬曲酒醅样品点主要分布在第2象限，而红心曲酒醅样品点主要分布在x轴的正半轴。Adonis检验结果显示，不同分组样品之间的真菌群落结构存在显著差异（P＜0.05）。马氏距离是一种用于度量一个样本点与数据分布之间距离的统计量，它考虑了数据的分布特性，通过协方差矩阵进行归一化，从而规避了欧氏距离在多变量距离度量中的局限性。由图5B可知，后火曲、清茬曲和红心曲酒醅的组间马氏距离分别为0.541、0.568和0.568，经Kruskal-Wallis检验结果发现，后火曲酒醅的组间马氏距离显著小于清茬曲和红心曲酒醅（P＜0.05）。
图5 基于非加权UniFrac距离的PCoA得分图（A）和组间马氏距离分析（B）
Fig.5 PCoA score plot based on unweighted UniFrac distance(A) and inter-group Mahalanobis distance analysis(B)
在此基础上，进一步基于OTU水平展开LEfSe和随机森林模型分析，以解析后火曲、清茬曲和红心曲酒醅中的特征真菌属和重要真菌属，结果见图6。
图6 基于OTU数量的LDA得分（A）和随机森林模型（B）分析
Fig.6 LDA score histogram(A) and random forest model(B)based on OTUs level
LEfSe分析中使用的线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）模型能够计算出不同组之间每个特征的显著性差异及效果大小，LDA值越高，则表示该特征在区分不同组别的作用越明显[25]。由图6A可知，当LDA得分＞3时，仅有后火曲和红心曲酒醅中呈现特征真菌属，其中后火曲酒醅中的特征真菌属分别为Aspergillus和Saccharomycopsis，而红心曲酒醅中的特征真菌属分别为Pichia、Torulaspora和Hanseniaspora。由图6B可知，在随机森林模型分析中，平均基尼下降指数是衡量每个变量如何对随机森林中的节点和叶子的同质性作出贡献的量度[26]，其值越高，变量在模型中的重要性越高[26]。后火曲酒醅中存在2个重要真菌属，为Aspergillus和Lichtheimia（平均基尼下降指数 分别＞4、＞2），其中Lichtheimia相对丰度较低，不足0.1%；红心曲中亦存在2个重要真菌属（平均基尼下降指数分别＞3、＞2），分别为Pichia和Candida，其中Candida相对丰度亦较低，不足0.1%。综上，Aspergillus、Pichia分别是后火曲和红心曲酒醅中的特征真菌属（LDA得分＞3）及重要真菌属（平均基尼下降 指数＞3），而清茬曲酒醅中则不存在。
本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对分别使用后火曲、清茬曲和红心曲发酵得到的清香型白酒大茬酒醅中的真菌微生物群落进行解析。结果显示，后火曲发酵的酒醅中真菌丰富度明显高于红心曲发酵的酒醅。 3组酒醅中的真菌属主要为Saccharomyces、Kazachstania和Saccharomycopsis等，核心真菌类群与优势菌群相类似，且占比超过90%。此外，清茬曲发酵酒醅中真菌群落间表现出更密切的相关性，而后火曲发酵酒醅中的群落间则表现出更多的正相关关系。3组酒醅的真菌群落结构间存在明显差异，同时后火曲发酵酒醅样品的组间距离明显小于清茬曲和红心曲。LEfSe分析和随机森林分析结果均表明，Aspergillus、Pichia分别是后火曲和红心曲酒醅中的特征真菌属（LDA得分＞3）及重要真菌属（平均基尼下降指数＞3）。本研究为清香型白酒酿造过程中的酒曲选择提供了理论支撑。
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