大曲既是白酒酿造的发酵剂，也是重要的原料和生香剂，直接影响白酒的产量、质量和风格特征[1]。在酱香型白酒的酿造工艺中，高温大曲制作过程需维持在约65 ℃的高温环境，以促进特定微生物群落生长、酶系以及主要挥发性风味成分（吡嗪类、芳香族、酯类等）的形成，对酱香型白酒风格的形成具有重要的作用[2]。近年来，高温大曲微生物群落结构与代谢产物变化机制备受关注，且关于大曲风味物质形成与微生物群落组成间的相关性研究也越来越多[1,3-5]。
作为中国白酒的典型代表，酱香型白酒通过传统工艺塑造出层次丰富的风味图谱，其基酒香气主要由酱香、醇甜香和窖底香3种典型香气构成，共同形成“酱香突出、幽雅细腻”的感官特征[6]。其中以具有花果甜香风味的芳香族、酯类、醇类及呋喃类等化合物对“醇甜”香型的构成具有重要贡献，对白酒幽雅风格和高质量品质有重要的影响[7-8]。近年来，地处四川白酒核心产区之一的成都邛崃产区在生产中发现部分高温大曲具有明显的花果香，且此类大曲可强化酿造白酒的花果香气。但目前关于具有花果香风味高温大曲的研究鲜见报道。
本研究旨在通过高通量测序技术、非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析和线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）解析花果香高温大曲与普通高温大曲的微生物群落结构特征及其差异微生物，结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术与Spearman相关性分别分析花果香高温大曲挥发性风味物质及其与微生物之间的关系，为优化大曲生产工艺、提高大曲质量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高温大曲取自我国某白酒厂四川邛崃生产基地，其中花果香高温大曲和普通高温大曲均来自该酒厂同一生产批次。将2种大曲分别在无菌研磨机粉碎混合均匀后，各取3份平行样本密封在无菌袋中，分别标记为JF1（普通大曲，JF1-1～3）、JF2（花果香大曲，JF2-1～3），－20 ℃冰箱保存待测。
DNeasy PowerSoil® Pro Kit 德国QIAGEN公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Clean-Up Kit 上海美吉逾华生物医药科技有限公司；NEXTFLEXR Rapid DNA-Seq Kit 美国Bioo Scientific公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
NanoDrop 2000分光光度计、Qubit 4.0荧光仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；9700 PCR仪 美国ABI公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；GCMS-TQ8050 NX GC-MS仪、AOC-6000进样器 日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取、PCR扩增及高通量测序
采用DNeasy PowerSoil® Pro Kit提取样品微生物宏基因组DNA，以其为模板，分别采用细菌引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）、真菌引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）/ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对细菌16S rRNA可变区V3～V4区基因序列和真菌内转录间隔区1基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×Pro Taq 10 μL、上游引物（5 μmol/L） 0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、模板DNA 10 ng，双蒸水（ddH2O）补足至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，35个循环（95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶和纯化试剂盒回收、纯化，并采用荧光仪进行定量检测，委托上海美吉生物医药科技有限公司基于Illumina MiSeq测序平台进行高通量测序。
使用fastp（http://github.com/OpenGene/fastp，v0.19.6）软件对双端原始测序序列进行质控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，v1.2.11）软件进行拼接。使用UPARSE v7.1软件（http://drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类并剔除嵌合体。利用RDP分类器（http://rdp.cme.msu.edu/，v2.11）比对基因数据库进行OTU物种分类学注释，置信度阈值为70%，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。
1.3.2 挥发性风味成分测定
采用HS-SPME-GC-MS测定样品中的挥发性风味成分。
HS-SPME条件：称取样品0.5 g，装入20 mL顶空样品瓶中，加入1 μL混合内标（4-溴氟苯、苊-D10和1,2-二氯代苯-D4，10 μg/mL），50 ℃平衡5 min，萃取15 min。
GC条件：进样口温度250 ℃；SH-Polar Wax毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（He），升温程序为以40 ℃起始温度保持5 min，再以3 ℃/min升温至250 ℃并保持15 min；汽化室温度 250 ℃；采用5∶1分流比进样。
MS条件：电子电离源，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，全扫描模式，扫描范围m/z 40～500。
定性定量：通过对比NIST 2017质谱库和保留指数对挥发性成分进行定性分析，采用内标法进行定量[9]。
1.4 数据处理
在美吉生物云平台（http://cloud.majorbio.com）进行微生物群落多样性分析、Spearman相关性及热图分析。采用R语言绘制Venn图。采用SPSS 23.0软件处理数据，使用OriginPro 2021绘图。
2 结果与分析
2.1 稀释曲线
基于不同测序深度构建高温大曲样品中微生物菌群的Shannon指数稀释曲线。由图1可知，稀释曲线随着测序深度的提升趋向平缓，说明每个样品测序数据量充分，可以合理反映样品中微生物群落信息。
图1 2种高温大曲样品细菌（A）和真菌（B）菌群的Shannon指数稀释曲线
Fig.1 Rarefaction curves based on Shannon index for bacterial (A) and fungal (B) communities in two types of high-temperature Daqu samples
2.2 微生物菌群α-多样性分析
由图2可知，2种高温大曲细菌及真菌菌群的共有OTU分别仅占总OTU数的27.76%、35.59%，且花果香高温大曲的细菌及真菌总OTU数均显著低于普通高温大曲（P＜0.05），说明普通高温大曲和花果香高温大曲的细菌及真菌菌群存在差异。
图2 2种高温大曲样品细菌（A）和真菌（B）OTU数Venn图
Fig.2 Venn diagrams of bacterial (A) and fungal (B) operational taxonomic units in two types of high-temperature Daqu samples
在α-多样性分析中，常用ACE、Chao1、Simpson指数和Shannon指数评估样品中物种的多样性和丰富度[10]。由图3、4可知，花果香高温大曲的细菌及真菌菌群的ACE、Chao1、Shannon指数均显著低于普通高温大曲（P＜0.05），而Simpson指数均显著高于普通高温大曲（P＜0.05），说明花果香高温大曲的细菌及真菌物种丰富度及多样性均显著低于普通高温大曲，分析原因可能是经过不断驯化，对花果香大曲特征风味形成有贡献的有益微生物不断积累并成为优势物种，作用较小或无用的物种则越来越少，最终形成稳定的微生态系统。
图3 2种高温大曲样品细菌菌群的α-多样性分析
Fig.3 α-Diversity analysis of bacteria in two types of high-temperature Daqu samples
图4 2种高温大曲样品真菌菌群的α-多样性分析
Fig.4 α-Diversity analysis of fungi in two types of high-temperature Daqu samples
2.3 微生物群落结构分析
2.3.1 基于门水平高温大曲微生物群落结构分析
由图5A可知，从2种高温大曲样品中共注释到18个细菌门，其中花果香和普通高温大曲样品中分别注释到10个和17个细菌门，这与α-多样性分析结果一致，花果香高温大曲物种多样性低于普通高温大曲。2种高温大曲共有的优势细菌门（平均相对丰度≥1%）为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota），且均以Firmicutes为绝对优势细菌门，这主要与Firmicutes微生物在高温制曲的极端环境条件具有很强的适应性有关[11-12]。花果香高温大曲中Firmicutes（90.37%）的相对丰度明显高于普通大曲（79.35%），由此可以推断Firmicutes对花果香高温大曲特征风味的形成可能发挥了重要作用，其是大曲中的主要产香且影响白酒风味和香型的微生物[13-15]。
图5 基于门水平2种高温大曲样品细菌（A）和真菌（B）菌群结构
Fig.5 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the phylum level in two types of high-temperature Daqu samples
由图5B可知，从2种高温大曲样品中共注释到3个真菌门，其中花果香和普通高温大曲样品中分别注释到 2个和3个真菌门，2种大曲均以子囊菌门（Ascomycota）为绝对优势真菌门，且相对丰度均大于99%，其中花果香高温大曲中Ascomycota相对丰度接近100%，与Gan Shuheng[16]、赵驰[17]、孙羊羊[18]等的研究结果一致，即高温大曲均以Ascomycota为绝对优势真菌门。
2.3.2 基于属水平高温大曲微生物群落结构分析
由图6A可知，从2种高温大曲样品中共注释到30个细菌属，其中花果香和普通高温大曲分别注释到6个和 12个优势细菌属（平均相对丰度≥1%）。花果香高温大曲的优势细菌属包括克罗彭斯特德菌属（Kroppenstedtia）（70.51%）、岩石芽孢杆菌属（Scopulibacillus）（8.24%）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）（7.99%）、葡萄球菌属（Staphylococcus）（4.81%）、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）（3.76%）和norank_f__Pseudonocardiaceae（2.65%），且均为普通高温大曲的主要优势细菌属。其中，Kroppenstedtia为高温大曲的绝对优势细菌。唐绍培[19]、郑亚伦[20]等研究发现，不同生产阶段的酱香型高温大曲中Kroppenstedtia逐渐成为绝对优势菌，并在出仓及贮藏期相对丰度达到最高。马叶胜 等[5]研究发现，不同厂家高温大曲中Kroppenstedtia的平均相对丰度均最高。王国峥等[21]也研究发现，象牙色克罗彭斯特德菌（Kroppenstedtia eburnea）为不同轮次高温大曲微生物群落中的优势菌种。2种高温大曲细菌微生物群落结构存在明显差异。花果香高温大曲中Kroppenstedtia（70.51%）、Virgibacillus（3.76%）的相对丰度明显高于普通高温大曲（43.54%、1.43%），尤其是Kroppenstedtia，表明该细菌属的高丰度可能是构成花果香高温大曲特征风味的主要原因之一。已有研究表明Kroppenstedtia与高温大曲芳香类风味化合物的形成呈协同增长关系，因而对白酒特征风味的产生至关重 要[22-25]，这可能与Kroppenstedtia菌群数量与大曲发酵温度、基质含水量、酸度水平及淀粉酶活性呈协同增长趋势有关[14]。作为芽孢杆菌属（Bacillus）的近源属，近年研究表明Virgibacillus作为高温大曲中的优势细菌，也是酱香型白酒主要的产香功能菌，并且还具有高产淀粉酶、蛋白质水解能力，与酯类、吡嗪类物质的生成有关[26-27]。
图6 基于属水平2种高温大曲样品细菌（A）和真菌（B）菌群结构
Fig.6 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the genus level in two types of high-temperature Daqu samples
由图6B可知，从2种高温大曲中共注释到31个真菌属，花果香和普通高温大曲分别注释到2和7个优势真菌属（平均相对丰度≥1%），2种高温大曲的真菌微生物群落结构组成存在明显差异。花果香高温大曲以嗜热丝孢菌属（Thermomyces）（74.74%）为绝对优势真菌，以嗜热子囊菌属（Thermoascus）（24.92%）为次优势真菌属。其中Thermoascus也是普通高温大曲的绝对优势真菌属（56.30%），但Thermomyces在普通高温大曲中的相对丰度较低（0.61%），说明Thermomyces对花果香大曲特征风味的形成可能具有重要作用。已有研究表明不同高温大曲优势真菌属可能不同，但主要以Thermomyces和Thermoascus为主[19,28-29]。孙羊羊等[18]对比研究发现，天津高温大曲分别以Thermoascus、Thermomyces为第1、2优势真菌，而贵州高温大曲正好相反。Thermoascus和Thermomyces能够在高温条件下生长代谢，具有很强的糖化力、液化力、酯化力和蛋白质水解能力等，对酱香型白酒风味的形成具有重要意义，是高温大曲中常见的2种真菌[30-32]。花果香高温大曲中2种嗜热真菌属的总相对丰度明显高于普通高温大曲，达99.66%，由此可推测花果香高温大曲中耐热水解酶含量更高[33]，也可能是构成花果香大曲特征风味的主要原因之一。
2.4 2种高温大曲中微生物群落差异分析
基于Bray-Curtis距离的NMDS分析对2种高温大曲中微生物群落差异进行分析，结果见图7。2种高温大曲中细菌和真菌群落NMDS分析结果的Stress值均小于0.1，表明该模型具有良好的代表性。普通高温大曲样品均分布在第2、3象限，花果香高温大曲样品均分布在第1、4象限，表明花果香高温大曲的微生物组成与普通高温大曲具有明显差异，结合2种高温大曲的微生物菌群α-多样性及结构分析结果可知，此种差异主要来源于微生物群落结构及其相对丰度的差异。综上，花果香高温大曲的微生物群落特征显著区别于普通高温大曲。
图7 2种高温大曲样品细菌（A）及真菌（B）群落的NMDS分析
Fig.7 NMDS analysis of bacteria (A) and fungi (B) in two types of high-temperature Daqu samples
为进一步分析花果香高温大曲与普通高温大曲微生物菌落的差异，对2种高温大曲的菌群丰度差异特征进行LEfSe分析，结果见图8。基于LDA＞4且P＜0.05，在属水平从2种高温大曲中共检出6种差异细菌属和5种差异真菌属，其中普通高温大曲中的差异细菌属有4种：分别为Staphylococcus、Bacillus、短杆菌属（Brevibacterium）和无色杆菌属（Achromobacter）；花果香高温大曲中的差异细菌属为Kroppenstedtia、Virgibacillus；普通高温大曲中的差异真菌属有4种，分别为Thermoascus、Leiothecium、罗萨氏菌属（Rasamsonia）、unclassified_f__Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis；花果香高温大曲中的差异真菌属只有Thermomyces。
图8 2种高温大曲样品中细菌（A）和真菌（B）菌群的LEfSe分析
Fig.8 LEfSe analysis of bacteria (A) and fungi (B) in two types of high-temperature Daqu samples
以上结果表明，Kroppenstedtia、Virgibacillus在2种高温大曲中的代谢及其对风味物质生成的作用相对一致，但作用强度不同，这可能是构成2种高温大曲风味差异的主要原因。普通高温大曲的差异细菌属除Staphylococcus外，Bacillus、Brevibacterium和Achromobacter均不属于花果香高温大曲的优势细菌属，表明这3种差异细菌属对花果香高温大曲的特征风味形成作用较小。花果香高温大曲中的差异真菌属Thermomyces不属于普通高温大曲的优势真菌属，说明其对花果香高温大曲的风味形成具有较大的作用。普通高温大曲中的差异真菌属除Thermoascus外，Leiothecium、Rasamsonia、unclassified_f_Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis均不属于花果香高温大曲的优势真菌属，表明这3种差异真菌属对花果香大曲的风味形成作用较小。综上可以推测，与普通高温大曲相比，花果香高温大曲中产生的代谢产物因发酵过程中差异微生物的不同而有所差异，从而使其本身以及生产白酒的风味品质有所差异。其中，Kroppenstedtia、Virgibacillus和Thermomyces的代谢产物对花果香高温大曲的风味形成有重要作用。
2.5 挥发性风味物质分析
采用HS-SPME-GC-MS分别在花果香高温大曲和普通高温大曲中共检测到挥发性化合物66种和70种，总含量分别为376.14 μg/g和296.96 μg/g。由图9可知，挥发性风味物质主要包括醇类、酯类、醛类、酮类、吡嗪类、芳香类等，其中均以吡嗪类物质含量最高，与李登勇[2]、郑灿杰[34]等的研究结果一致。花果香高温大曲中分别检测到11种吡嗪类（164.83 μg/g）、19种芳香类（64.83 μg/g）、5种酮类（61.29 μg/g），普通高温大曲中分别检测到11种吡嗪类（74.68 μg/g）、13种芳香类（51.16 μg/g）、11种酮类（46.16 μg/g），且花果香高温大曲中吡嗪类、芳香类和酮类物质的含量均高于普通高温大曲，特别是吡嗪类化合物，推测其可能为形成花果香大曲特征风味的重要成分。吡嗪类物质主要为白酒提供烘焙香、坚果香及花香等风味，并对其他香味物质具有明显的烘托叠加作用，是酱香型白酒的关键呈香呈味特征风味化合物[35]。适量酮类物质可以起助香和提升白酒品质作用，也是白酒中重要香味物质[36]。芳香族化合物主要为白酒提供花果香和蜂蜜似的芳香[37]，对形成独特香气起着关键作用。2种大曲的醇类物质含量相当，普通高温大曲的酯类物质含量高于花果香高温大曲。其次，花果香高温大曲中酚类和呋喃类物质含量高于普通大曲，虽然含量较少，但主要呈甜香、焦糖、坚果和烟香香气特征，是酱香型白酒风味的主要贡献者之一[38]。
图9 2种高温大曲样品中挥发性风味物质GC-MS分析结果
Fig.9 Volatile substances in two types of high-temperature Daqu samples by GC-MS
2.6 高温大曲挥发性风味物质与微生物间的相关性分析
为探究花果香高温大曲中关键挥发性风味物质的形成机制，利用Spearman相关性分析评估花果香高温大曲与普通高温大曲中挥发性风味物质与优势微生物属的内在联系。由图10A可知，吡嗪类物质、芳香类物质均与Kroppenstedtia、Virgibacillus呈正相关，其中2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪呈显著正相关（P＜0.05）。酮类物质与Staphylococcus、Bacillus、Brevibacterium、Achromobacter、Sebaldella、Pantoea、Lactobacillus呈正相关，其中主要酮类物质3-辛酮与Kroppenstedtia、Virgibacillus呈正相关。酯类物质如乙酸丁酯、γ-丁内酯、十二酸丁酯等与Brevibacterium、Lactobacillus呈极显著或显著正相关（P＜0.01或P＜0.05）。γ-己内酯、丙位壬内酯、异戊醇、愈创木酚、2-乙酰基呋喃与Virgibacillus呈极显著正相关（P＜0.01）。
图10 高温大曲样品中挥发性风味物质与细菌（A）、真菌（B）的相关性分析热图
Fig.10 Correlation heatmap between volatile substances and bacteria (A), fungi (B) in high-temperature Daqu samples
由图10B可知，主要挥发性风味化合物吡嗪类、芳香类、酮类物质均与Thermomyces呈正相关，其中吡嗪类、主要芳香类物质（苯甲醛、苯乙酮）、主要酮类物质（3-辛酮）与Thermomyces呈极显著或显著正相关（P＜0.01或P＜0.05）。酯类物质如丁酸乙酯、乙酸丁酯、γ-十二内酯与Thermoascus、unclassified_f_Saccharomycetales_fam_Incertae_sedis呈极显著或显著正相关（P＜0.01或P＜0.05）。γ-己内酯、丙位壬内酯、异戊醇、愈创木酚、2-乙酰基呋喃与Thermomyces呈正相关。
3 结 论
本研究通过高通量测序结合NMDS和LEfSe系统对比分析了花果香高温大曲与普通高温大曲的微生物群落多样性及组成差异，结果表明，花果香高温大曲的物种多样性和丰富度均显著低于普通高温大曲（P＜0.05）；基于LDA＞4及P＜0.05，从2种高温大曲中共检出6种差异细菌属和5种差异真菌属，其中Kroppenstedtia、Virgibacillus及Thermomyces为花果香高温大曲中的主要差异菌属。通过HS-SPME-GC-MS分别从花果香高温大曲和普通高温大曲中检测到挥发性化合物66种和70种，花果香高温大曲的挥发性风味物质总含量（376.14 μg/g）与主要风味物质吡嗪类（164.83 μg/g）、芳香类（64.83 μg/g）、酮类物质（61.29 μg/g）含量均高于普通高温大曲。通过Spearman相关性分析发现，主要风味物质与差异微生物属Kroppenstedtia、Virgibacillus、Thermomyces呈正相关性。综上，花果香高温大曲的微生物群落结构、挥发性风味物质均与普通高温大曲有显著差异，且挥发性风味物质含量、组成均与微生物群落结构息息相关，主要风味物质与差异微生物呈正相关。本研究对调控大曲微生物群落结构、稳定生产高质量花果香高温大曲及提高酱香型白酒品质具有重要意义。
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