醪糟是以糯米为原料，经酵母、霉菌等微生物发酵制成的一种低乙醇含量传统发酵食品，因口感清爽、风味独特而深受消费者喜爱[1]。然而，由于发酵原料与技术相对简单，醪糟的风味层次较为单一，与传统白酒相比缺乏复杂性。醪糟发酵的核心动力来源于甜酒曲中的酵母菌和霉菌[2]，其中霉菌主要通过分泌淀粉酶促进淀粉降解，提高可发酵糖含量，从而提升糖化率与出品率；酵母则主要利用糖类进行乙醇发酵并合成各类风味物质[3]。
酒曲中优良菌株的筛选及接种是决定醪糟风味的关键因素，目前商业酒曲多采用纯种根霉与酿酒酵母进行发酵，所制醪糟普遍存在醇类物质含量不足、风味单一等问题[3]，近年来，非酿酒酵母因其在风味塑造方面的潜力逐渐受到关注。何洋等[4]采用酿酒酵母/胶红酵母协同米根霉发酵米酒，提高了甜米酒乙醇、鲜味氨基酸、甜味氨基酸、挥发性风味物质含量，达到“提醇增酯增香”效果。王金驰等[5]利用马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母协同发酵米酒，发现混菌发酵米酒的乙酸乙酯和乙醇含量优于单菌发酵，对提升米酒风味有重要贡献。Li Rou等[6]利用酿酒酵母与光滑假丝酵母（Candida glabrata）混菌发酵米酒，提高了糖利用率和总挥发性物质含量，酯类（如3-甲基-1-丁醇乙酸酯）、醇类（如香茅醇、2,3-丁二醇）显著富集，香气复杂性提升。以上研究表明，产香酵母与酿酒酵母协同发酵过程中存在相互影响，能够优化米酒的发酵过程和调控微生物代谢[7]。
为获得适用于醪糟风味改良的产香酵母，本研究从甜酒曲及白酒酿造环境中分离筛选具有优良产香特性的酵母菌株，结合其产乙醇能力与感官评价结果，优选菌株进行醪糟协同发酵实验，系统评估产香酵母与商业酒曲混合发酵对醪糟挥发性风味的影响，以期为产香酵母的资源开发与醪糟风味品质提升提供理论依据与实践参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯米粉 黑龙江北纯农产品开发有限公司；糯米沈阳信昌粮食贸易有限公司；甜酒曲 湖北曲子香食品有限责任公司。
辛醇（色谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠（色谱纯） 福晨（天津）化学试剂有限公司；真菌DNA提取试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基 青岛海博生物技术有限公司。
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）培养基：5 g葡萄糖、0.5 g TTC、15 g琼脂溶于1 L纯水，115 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
GCMS-QP2020NX气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）仪 日本岛津公司；57328-U-DVB/CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司；DB-WAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）美国安捷伦科技有限公司；IFA-240-8强制对流型培养箱 新加坡艺思高科技有限公司；HCB-1300V超净工作台 青岛海尔生物医疗股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母的分离纯化
在洁净环境下称取甜酒曲和糟醅各10 g，分别溶解于90 mL无菌带玻璃球的生理盐水中，28 ℃、180 r/min振荡30 min，按10倍系列梯度稀释至10－6，吸取10－6～10－2梯度稀释液100 μL均匀涂布于YPD平板上，在28 ℃培养箱中倒置培养36～48 h。挑取形态特征明显的单菌落划线于固体培养基中，反复划线纯化3次至菌落一致。
保藏：挑取单菌落于YPD培养基中，28 ℃、180 r/min条件下培养12 h，并与50%甘油等体积混合于甘油保藏管中，保存于－20 ℃冰箱，备用。
1.3.2 产香酵母的筛选
将糯米粉与水按料液比1∶50（g/mL）在烧杯中混合均匀（先用少量冷水混匀后加入热水），在电炉上加热至沸腾，保持2～3 min至液体微透明，用4层纱布过滤糯米颗粒，取滤液121 ℃灭菌20 min冷却后分装在50 mL无菌离心管中，每管20 mL。
酵母种子液的制备：按照10%的接种比例将冻存管的菌液接种到1 mL液体YPD培养基中，28 ℃、 150 r/min培养24 h后全部转入5 mL液体YPD培养基中， 28 ℃、150 r/min培养24 h制成种子液，后按照4%接种比例将酵母种子液接种到装有20 mL糯米汁的离心管中混匀，28 ℃、180 r/min振荡培养1 d后静置培养3 d。
邀请10位（5男、5女）经过3次标准物质阈值培训的食品专业相关人员，在专业白酒品酒室中用定量描述分析法（quantitative descriptive analysis，QDA）对发酵糯米汁的风味进行描述，挑选出超过50%感官评定人员描述词方向一致且风味较独特的酵母菌株作进一步实验[8]。
1.3.3 产香酵母的分子生物学鉴定
将筛选的具有产香功能的酵母菌在28 ℃条件下培养至成熟后，采用真菌DNA提取试剂盒进行DNA提取，采用引物26S-F（5′-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAA AG-3′）、26S-R（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）进行PCR扩增[9]，扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司检测，在NCBI数据库中比对序列，利用MEGA 11 软件构建系统发育树。
1.3.4 酵母菌产乙醇能力检验
初筛：将活化后的酵母菌用接种针接种在YPD固体培养基上培养24 h使之长出单菌落，倒入30 ℃、5 mL TTC培养基（将菌落完全覆盖即可），在28 ℃条件下避光保温3 h，观察菌落颜色变化（在培养的酵母菌落上覆盖1层TTC显色剂后会显不同颜色，产乙醇能力强的酵母菌落呈深红色，次之为红色），根据呈色情况判定酵母菌产乙醇能力的大小，实验重复3次[10]。
复筛：将初筛的酵母菌活化扩培（按照接种量为106 CFU/mL）后分别接入带有杜氏小管的10 mL YPD液体培养基试管中，分别在12、24 h和48 h观察杜氏小管中产气情况，实验重复3次[10]。
1.3.5 产香酵母协同发酵醪糟
将糯米在冷水中浸泡6 h以上，取100 g泡好的糯米分装至270 mL育苗瓶，121 ℃灭菌40 min[11]，冷却至30 ℃后按照1∶1的比例加入无菌水。将活化后的酵母菌在显微镜下用血细胞计数板计数，计算细胞浓度后，在高速离心机中5 000 r/min离心5 min去除培养基，用生理盐水洗涤3次，调整细胞浓度为106 CFU/mL后接入育苗瓶中搅拌均匀，再按照0.2%（m/m）的比例接种甜酒曲曲粉，盖好盖子后在培养箱中30 ℃培养，用失重法确定发酵终点 （每日称质量3次取平均值，质量损失平均值小于0.2 g）[11]。按照下面分组展开实验：1）实验组：按照0.2%比例添加曲粉搅拌均匀后将6株调整好细胞浓度的菌液分别接种至育苗瓶中，混合均匀（细胞浓度为106 CFU/mL），按照接种菌名将其命名为T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、N3-1组和N3-3组，每组设置3个平行；2）空白组（con）：按照0.2%比例添加曲粉搅拌均匀后，添加实验组接种菌液量等量生理盐水。
1.3.6 醪糟感官评价
由10名经专业训练的食品专业相关人员组成感官评价小组，根据T/GZSX 069—2020 《醪糟（米酒）》和相关文献[12]对醪糟进行感官评价（表1）。
表1 醪糟感官评价标准
Table1 Sensory evaluation criteria for Laozao
（分值）感官要求感官标准（评分）项目具有相当含量固浅黄色，透明有光泽，有微量聚集物形态与形物（米粒状糟（16～20）（20）合体、透明有光浅黄色，透明，有少量沉淀物（6～15）香味具有米酒的无异味口感柔和，酒味柔和鲜爽（16～30）滋味味感柔和，口感较柔和，酒味较柔和鲜爽（6～15）（20）具有令人愉悦酒体较协调，具有米酒的香甜（6～15）色泽米）的固液混泽、浅黄色无色，不透明，沉淀物多（0～5）具有糯米的香气，醇香浓郁，无异香（16～30）（30）特殊清香气味，具有糯米的香气，较浓郁，无异香（6～15）糯米的香气不足，有异香（0～5）（30）酸甜可口口感粗糙，酒味不柔和不鲜爽（0～5）酒体协调，具有米酒的香甜（16～20）整体风格酒体协调，的米酒香甜酒体不协调，具有米酒的香甜（0～5）
1.3.7 理化指标检测
还原糖含量的测定：采用3,5-二硝基水杨酸法[13]；总酸、乙醇体积分数的测定：参照GB/T 13662—2018《黄酒》中的方法。
1.3.8 醪糟挥发性风味成分分析
取1 mL酒样于20 mL顶空瓶，加NaCl固体饱和，并加入10 µL内标（0.164 4 g/L 2-辛醇）后盖上瓶盖[14]。
萃取头老化：首次使用萃取头时，将50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在GC进样口270 ℃老化1 h。
萃取条件：将装有样品的顶空瓶在60 ℃摇床内平衡5 min，用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头萃取40 min，然后将萃取头置于GC进样口中，250 ℃解吸5 min进行GC-MS分析。
GC条件：HP-INNOWAX色谱柱（60 m× 0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持1 min；以2.5 ℃/min升至75 ℃，以3 ℃/min升至162 ℃，以6 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，载气为高纯氦气（1.0 mL/min）；进样口温度250 ℃，不分流。
MS条件：电子电离源，电子能量70 eV；电子倍增器电压350 V；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；质量范围m/z 40～450。
定性、定量分析：以保留时间及保留指数为定性依据，通过NIST 20谱库检索，保留相似度大于80%的物质进行定性；采用内标法进行半定量分析。
1.4 数据分析
使用Excel 2016和SPSS 27.0软件对实验数据进行分析处理，R 4.3.0绘图，MEGA 11软件构建系统发育树，对每个挥发性风味物质分别采用Z-score方法标准化，ChiPlot（http://www.chiplot.online/）绘制相关热图；通过SIMCA 14.1软件对醪糟香气成分进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。基于该模型计算各挥发性风味物质的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，以VIP＞1.0作为筛选标准，识别醪糟中的差异香气成分。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的分离和鉴定
2.1.1 酵母菌形态学观察
将分离纯化得到的酵母菌在YPD平板上划线培养48 h，观察其菌落形态，结果见图1。
图1 酵母菌落形态
Fig.1 Morphological diagram of yeast colonies
由图1可知，T1-1和T1-4菌落呈乳白色，边缘光滑，表面粗糙；T1-2和N3-3菌落呈乳白色，表面光滑，边缘较粗糙；T1-3菌落呈乳白色，边缘和表面光滑；N3-1菌落呈乳白色，边缘光滑，表面光滑。
2.1.2 酵母菌的分子生物学鉴定
由图2可知，T1-1和T1-4与Saccharomycopsis fibuligera SF7、QY1同源性较高，鉴定为扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）。孙雅芳等[13]研究发现，扣囊复膜孢酵母发酵玉米淀粉时，苯乙醇质量浓度达到36.34 mg/L，苯乙醇是米酒风味的重要贡献物质，具有宜人的玫瑰花香[14]。T1-2、N3-3与Pichia kudriavzevii IFM、B17同源性较高，鉴定为库德里阿威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。库德里阿威毕赤酵母常见于白酒发酵环境中[15]，如赵港国[16]研究发现，毕赤酵母FJZ通过强化发酵显著提升了清香型白酒中乙酸乙酯及总酯含量，并协同促进了多种酯类与醇类物质的积累。T1-3与Cyberlindnera fabianii CF同源性较高，鉴定为费比恩塞伯德林纳氏酵母（Cyberlindnera fabianii）。Liang Jinglong等[17]研究发现，费比恩塞伯德林纳氏酵母可在米香型白酒发酵中提高总醇和总酯含量，同时增加白酒中8种酯类物质。N3-1与Kazachstania exigua D2.1 同源性较高，鉴定为少孢哈萨克斯坦酵母（Kazachstania exigua）。贾勇磊等[18]研究发现，少孢哈萨克斯坦酵母是酒糟中的优势微生物，具有较强的产乙醇能力。以上酵母在食品发酵领域均有良好的发酵、产香性能，在传统米酒、白酒的酿造中应用广泛。
图2 基于26S rDNA基因序列6株酵母的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic trees of six yeast strains based on 26S rDNA gene sequence
2.2 产香酵母糯米汁发酵风味感官特性和挥发性风味物质组成分析
2.2.1 发酵风味感官特性分析
对前期鉴定所得6株酵母分别进行单菌糯米汁发酵，对其进行感官品评。QDA作为一种描述性分析感官评定方法，能够定量评价样品的多种感官特性，清晰地展现样品间差异，广泛应用于葡萄酒、啤酒、米酒等食品的感官评价[19]。综合感官评价将6株酵母糯米汁发酵产物的主体风味归为酒酿香、发酵香、花香3大类。由表2可知，菌株T1-1和N3-1主体香味均为酒酿香，带有清甜味，T1-1的清甜感和蜜糖香优于N3-1；菌株T1-2和N3-3主体香味为发酵香，T1-2的糯米香和香蕉香优于N3-3，N3-3的甜酒酿香、清甜感和蜜糖香优于T1-2；T1-3和T1-4主体香味为花香，T1-3的菠萝香最明显，T1-4的玫瑰花香、清雅花香和香蕉香较T1-3明显。
表2 酵母菌来源及其发酵糯米汁主体风味
Table2 Source of yeast and main flavor of fermented glutinous rice juice
菌株编号T1-1T1-2T1-3T1-4N3-1N3-3菌株名称Saccharomycopsis kudriavzeviiCyberlindnera PichiaSaccharomycopsis Kazachstania Pichia fibuligerafabianiifibuligeraexiguakudriavzevii来源甜酒曲甜酒曲甜酒曲甜酒曲糟醅糟醅主体感官风味酒酿香、清甜发酵香、咸香花香、菠萝花香、猕猴桃酒酿香、清甜发酵香、茶香
2.2.2 挥发性风味物质组成分析
为阐明筛选出的酵母产香特性，本研究对6株酵母在糯米汁单菌发酵体系中所产生的挥发性风味物质进行分析，在糯米汁发酵液中共检测出110种挥发性风味物质，其中酸类12种、醇类29种、酯类34种、醛类8种、酮类7种和其他20种。由表3可知，空白对照组仅检测出24种挥发性风味物质，而在T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、N3-1、N3-3分别检测出了43、31、34、55、34、29种挥发性风味物质，空白组各类别挥发性风味物质（除醇类外）均显著低于酵母菌发酵组，T1-1组酸类物质相对含量最高，达到8.54%，相比于对照组，显著提高 （P＜0.05），说明菌株发酵显著促进了酸类物质的生成；T1-1（33.67%）和T1-4（29.16%）组醇类物质显著（P＜0.05）高于其他组，T1-3（15.94%）和T1-4（14.09%）组酯类物质相对含量较高，说明醇类和酯类都是酵母发酵的主要产物，与赵婷婷等[20]研究结论一致。醛类物质各组相对含量普遍较低，T1-2（34.35%）和N3-3（49.60%）组酮类物质相对含量较高，N3-1组酚类物质相对含量最高，达到51.94%。
表3 不同菌株发酵糯米汁挥发性风味物质种类和相对含量
Table3 Types and relative contents of volatile flavor compounds in glutinous rice juice fermented by by different strains
挥发性相对含量/%（种类）风味物质con（24）T1-1（43）T1-2（31）T1-3（34）T1-4（55）N3-1（34）N3-3（29）酸类0.09（1）8.54（5）0.16（4）0.29（5）1.59（8）1.33（5）0.34（4）醇类53.56（6）33.67（11）8.15（9）19.35（9）29.16（13）14.05（8）8.74（7）酯类1.12（7）13.78（9）10.80（7）15.94（8）14.09（12）12.53（8）12.63（8）醛类1.30（2）1.61（4）1.34（2）0.40（3）0.89（6）0.97（4）0.98（3）酮类0.34（2）1.47（5）34.35（3）25.33（4）0.56（6）4.55（5）49.60（4）酚类13.00（2）27.85（7）32.42（3）28.48（2）22.79（3）51.94（2）4.15（1）其他26.59（4）13.08（2）12.78（3）12.57（3）30.92（7）14.63（2）23.56（2）
2.3 产香酵母的产乙醇能力分析
由表4可知，菌株T1-1、T1-3和T1-4产乙醇能力较强，菌株T1-2、N3-1和N3-3产乙醇能力不足，在发酵乙醇类食品时可能需要与其他发酵能力较强的酵母进行协同发酵以获得更好的发酵效果[21]。
表4 酵母菌产乙醇能力
Table4 Alcohol production capacity of yeast strains
菌株编号T1-1T1-2T1-3T1-4N3-1N3-3显色结果＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋产气结果＋＋＋－＋＋＋＋＋＋＋－－
注：显色结果：＋＋＋＋.菌落完全变成深红色；＋＋＋.菌落完全变为
红色；＋＋.群落变成浅红色；＋.群落边缘变红或红色很浅；－.群落不
变色。产气结果：＋＋＋＋.杜氏小管中充满气体；＋＋＋.杜氏小管中
充满3/4气体；＋＋.杜氏小管中充满1/2气体；＋.杜氏小管中充满1/4气
体；－.杜氏小管中没有气体。
2.4 产香酵母协同发酵醪糟感官和理化指标分析
由图3A可知，产香酵母协同发酵醪糟的发酵期为8 d，第8天时，质量损失小于0.2 g，此时微生物活动大幅降低，其中发酵旺盛期在0～4 d。由图3B可知，发酵结束后con组乙醇体积分数为（5.60±0.25）%，显著低于T1-1组（（7.85±0.18）%）、T1-3组（（8.46±0.87）%）和T1-4组（（8.27±0.27）%）（P＜0.05），其中T1-1组在发酵期前期质量损失最大，这与其乙醇体积分数较高的结果相符；T1-2组、N3-1组和N3-3组乙醇体积分数与con组差异不显著（P＞0.05）。由图3C可知，con组和实验组的总酸含量差异不显著（P＞0.05），表明产香酵母协同发酵对醪糟的总酸没有显著影响。由图3D可知，con组还原糖质量浓度最高（（9.91±0.42）g/L），显著高于实验组（P＜0.05），T1-2组还原糖含量显著高于T1-3组（P＜0.05），T1-4组还原糖含量显著高于N3-1组（P＜0.05），说明不同产香酵母与商业甜酒曲协同发酵对醪糟还原糖含量具有显著影响，产香酵母提高了微生物对发酵环境中糖分的利用效率。由图3E可知，T1-3组在形态与香味、滋味和整体风格上优于其他组，感官评价总分最高，为88分，其次是T1-2组和N3-3组，感官评价总分分别为87、75分，再次为T1-1、N3-1组和T1-4组，感官评价总分分别为70、67分和61分，感官评价人员判别发酵醪糟的核心指标为香味和滋味，也间接说明消费者在选择醪糟类发酵食品时对于香味和滋味的感受度最大。
图3 产香酵母协同发酵醪糟感官和理化指标
Fig.3 Sensory and physicochemical indicators of Laozao fermented co-culturally with aroma-producing yeasts
2.5 产香酵母协同发酵醪糟挥发性风味成分分析
2.5.1 挥发性风味物质组成分析
由表5可知，产香酵母协同发酵醪糟的风味物质主要组成为醇类和酯类物质，其中醇类物质占比最大。con组共检测到50种挥发性风味物质，其中酸类4种、醇类9种、酯类24种、醛类3种、酮类4种，而T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、N3-1、N3-3组分别检测到78、71、65、54、46、82种挥发性风味物质。添加产香酵母混合发酵醪糟后，挥发性风味物质种类增多，且主要增加醇类物质和酯类物质的种类，表明酵母菌主要影响酯类、醇类物质等风味物质的合成[22]。这些物质风味各异，共同构成了醪糟的特色风味。T1-4组醇类、酯类、酮类、其他类含量最高，分别为（36.70±2.58）、（8.86±0.60）、（1.10±0.08）、（2.65±0.18）μg/g；T1-1组的醛类物质含量最高，为（0.64±0.05）μg/g；N3-1组的酸类物质含量最高，为（1.82±0.12）μg/g。从总量来看，T1-4组挥发性物质总量（（51.17±2.84）μg/g）最高，这一结果与扣囊复膜孢酵母的独特风味合成机制相关，扣囊复膜孢酵母可高效分泌α-淀粉酶、糖化酶及酸性蛋白酶，将发酵基质中的淀粉和蛋白质转化为葡萄糖、氨基酸等，为风味物质合成提供充足前体物质[23]，同时，其基因组中编码醇乙酰转移酶的多个功能基因（如SfATF(A)2、SfATF(B)2）在适宜条件下高表达，催化高级醇与乙酰辅酶A生成乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等关键酯类[24]。T1-4组的发酵条件（温度、水分、接种量等）可能恰好处于该菌株酶活性与基因表达的最适范围，同时构建了高效的微生物互作网络，使得代谢流最大程度地流向风味物质合成[25]，最终表现为总风味物质含量的显著提升。
表5 产香酵母协同发酵醪糟挥发性风味物质含量
Table5 Volatile flavor compound content in Laozao co-fermented with aroma-producing yeast
挥发性含量/（μg/g）风味物质con（50种）T1-1（78种）T1-2（71种）T1-3（65种）T1-4（54种）N3-1（46种）N3-3（82种）酸类1.35±0.111.59±0.111.09±0.051.00±0.041.61±0.091.82±0.121.21±0.08醇类32.15±2.2122.08±1.3916.13±1.0618.92±1.4536.70±2.5829.77±2.1117.15±1.12酯类5.95±0.388.72±0.714.71±0.386.25±0.468.86±0.606.46±0.515.20±0.38醛类0.24±0.020.64±0.050.13±0.010.56±0.040.25±0.020.22±0.020.36±0.02酮类0.23±0.020.51±0.040.45±0.030.13±0.011.10±0.080.31±0.020.19±0.02其他1.00±0.070.89±0.070.43±0.030.41±0.032.65±0.180.86±0.060.75±0.05总量40.92±1.79 34.43±2.05 22.43±1.89 27.27±1.04 51.17±2.84 39.45±2.43 24.86±1.48
醇类物质是醪糟风味中的重要呈味物质，来源于氨基酸脱氨、脱羧反应和降解氧化，酯类物质由发酵过程中酸和醇的酯化作用形成[26]。酵母协同发酵可以丰富发酵产物中的酯类、醇类挥发性物质[27]，对醪糟香气品质提升及特色风味改善起到重要作用。虽然醛酮类物质种类较少，但醛酮类多源于不饱和脂肪酸的酶促或自氧化，属高活性中间体，易与醇、氨及巯基物缩合、转位，生成香气阈值低、类型多样的次级挥发物[28]。其中3-羟基-2-丁酮呈甜润黄油香，可在醇-酯-酸矩阵中起“桥梁”作用，填补玫瑰-果香与奶香之间的嗅觉空隙，从而提升醪糟香气的立体度与平衡感[29]。
2.5.2 挥发性风味物质种类及相对含量对比分析
为了比较产香酵母协同发酵对醪糟挥发性风味物质的含量影响情况，共筛选出各组共有的25种挥发性风味物质。其中，醇类6种、酯类15种、醛类1种、酸类2种、噻吩类1种。由图4可知，产香酵母与商业甜酒曲协同发酵能够提升醪糟中部分挥发性风味物质的含量。与con组相比，T1-1组中丁二酸二乙酯、棕榈油酸乙酯、己酸、肉豆蔻酸乙酯、亚油酸乙酯、乙醇、棕榈酸乙酯含量提高；N3-1组、N3-3组、T1-4组苯乙醇、异戊醇的含量提高。T1-4组己酸乙酯、苯乙酸乙酯、1-辛醇含量也有明显提升；其中苯乙醇、己酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯等是赋予醪糟特征风味的重要风味物质，赋予醪糟馥郁的甜香、水果香、花香等多种特征香气[30]，对醪糟风味的形成具有重要的影响作用。酯类物质阈值较低，在含量较低的情况下也对醪糟的香气具有很大的贡献作用[31]。棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯是醪糟中最丰富的挥发性香气成分[32]，在米酒、清酒、醪糟等发酵食品中普遍存在。合成酯类物质的前提是酸，作为前体物质存在，同时也可以和醇类物质为醪糟贡献特殊的口感，但酸类物质过多易使醪糟具有酸涩味、腐败味等不良香气，因此酸、醇、酯的平衡也是影响醪糟风味的重要因素之一。
图4 不同发酵组醪糟共有的挥发性风味物质热图
Fig.4 Heatmap of volatile components common to different fermentation groups of Laozao
2.6 产香酵母协同发酵醪糟挥发性风味物质的差异比较分析
为明确不同酵母菌协同发酵醪糟的香气差异性，以25种共有挥发性风味物质为因变量、不同菌种协同发酵为自变量进行OPLS-DA，实现不同样本的有效区分。由图5A可知，不同发酵组得到有效区分，同组样本之间聚集性较强。由图5B可知，经过200次置换验证，R2＞Q2且Q2的纵轴截距为负数，证明OPLS-DA模型可靠，认为该结果可用于解释不同产香酵母发酵醪糟香气的差异分析。由图5C可知，根据VIP＞1共筛选出5种特征差异化合物，分别为异戊醇、苯乙醇、乙醇、棕榈酸乙酯、异丁醇。由图5D可知，6株酵母菌分别与商业甜酒曲协同发酵后，T1-4、N3-1和N3-3对特征差异化合物苯乙醇、异戊醇、异丁醇具有明显促进作用，T1-1对乙醇、棕榈酸乙酯具有促进作用。结果表明，产香酵母协同发酵有助于提高醪糟风味品质，可为生产上通过添加产香酵母发酵醪糟提高醪糟的风味和品质提供理论依据。
图5 不同发酵组醪糟风味物质组间差异分析OPLS-DA得分图（A）、200 次置换检验（B）、VIP值（C）及差异组分热图（D）
Fig.5 OPLS-DA score plot (A), 200-permutation test (B), VIP value (C), and differential component heatmap (D) of differential analysis of flavor substances in fermented glutinous rice in different fermentation groups
3 结 论
本研究以甜酒曲及白酒发酵环境为菌株来源，分离鉴定获得6株优良产香酵母。通过感官评价、产乙醇能力及挥发性风味物质分析筛选，明确T1-4（扣囊复膜孢酵母）为最优产香菌株；T1-3（费比恩塞伯德林纳氏酵母）协同发酵组感官评分最高（88分）。产香酵母与商业甜酒曲协同发酵可显著丰富醪糟中醇类、酯类挥发性风味物质的种类与含量，有效提升还原糖利用效率，且对醪糟总酸含量无显著影响，维持酸度平衡；结合OPLS-DA识别出5种关键差异风味物质，证实产香酵母可有效改善醪糟风味的复杂性与协调性，为醪糟风味品质提升提供理论支撑。在应用中可将产香酵母开发为补充菌剂，依据风味需求添入醪糟发酵体系，丰富产品风味。本研究创新性地从甜酒曲和白酒酒醅双环境筛菌，结合GC-MS、OPLS-DA等量化风味调控作用，突破传统感官评价局限，提升结果科学性，明确产香酵母与商业甜酒曲协同发酵风味品质提升的原因和关键风味物质，弥补市售醪糟菌株单一、风味不足的缺陷，为工业化升级提供新方案。
综上，产香酵母的筛选与协同发酵是提升醪糟风味品质的有效途径，为传统发酵食品的风味改良与功能性菌株资源开发提供了理论依据与实践参考。未来研究可结合传统发酵技术与现代生物技术，推动醪糟等传统食品向风味多元化、品质标准化方向发展。
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