樱桃因其色泽红润、晶莹剔透、果肉饱满多汁、口感清甜馥郁且营养丰富而深受消费者青睐。此外，其富含多种氨基酸、维生素和矿物质元素以及花青素、黄酮、多酚等天然植物活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗炎等多种生物活性，可促进血液循环、增强新陈代谢，并有助于调节和改善心脑血管功能[1-3]。然而，由于樱桃皮薄易破、含水量高且保鲜期短，给贮藏和运输带来极大挑战[4]。近年来，以樱桃为原料开发果脯、果酱及果酒等产品已成为一种前景广阔的策略，不仅保留了樱桃原有的营养和风味，还促进了其中天然植物活性成分的释放[5-7]。与果脯和果酱相比，樱桃加工成果酒可保留更多营养成分和天然植物活性成分，同时有助于微量元素的释放与吸收[1]。因此，樱桃果酒的开发不仅有效延长了樱桃的保鲜期，还可激发市场活力，提升产业经济效益。
目前，果酒的工业化生产通常以酿酒酵母作为主要发酵剂。尽管单一菌株发酵可最大限度利用原料中的糖分，促进乙醇生成，但由于酿酒酵母缺失关键水解酶（如糖苷酶和酯酶）或其活性较低，难以充分释放水果中的营养物质，限制果酒的营养价值、口感及风味的提升[8]。因此，多菌种协同发酵逐渐受到广泛关注，非酿酒酵母常用于提升果酒的营养价值与香气特征。Xu Xinying等[9]研究发现，粟酒裂殖酵母、陆生伊萨酵母、美极梅奇酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵均可改善草莓果酒的理化特性及抗氧化活性。钟轲等[10]研究发现，克鲁维毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵可显著提高脐橙果酒中总黄酮、总多酚等天然植物活性成分的含量，同时改善其抗氧化活性与感官品质。然而，由于非酿酒酵母基因组稳定性较低、营养竞争激烈且耐受性较弱，其在与酿酒酵母共发酵时易受到抑制，进而影响产品品质并导致批次稳定性差。针对这一问题，研究人员已开始探索可稳定提升果酒品质与营养价值的替代策略，尤其关注非酿酒酵母产生的胞外提取物[11]。这些胞外提取物富含β-葡萄糖苷酶、酯酶、果胶酶、纤维素酶和木聚糖酶等多种生物活性酶，可促进多酚等天然活性成分的释放，提升果酒的抗氧化能力，从而增强其健康效益[12]。此外，非酿酒酵母胞外提取物在低pH值、高糖和高乙醇含量等酿造条件下仍能保持较稳定的相对酶活性[13]。因此，将非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母协同发酵被认为是实现果酒品质稳定性提升的有效策略。
本研究将4种酿酒性能优良的非酿酒酵母胞外提取物分别与酿酒酵母协同发酵，用于樱桃果酒的制备，并系统评价其对樱桃果酒理化指标（乙醇、可溶性固形物、总酸、还原糖、VC和总酯含量和pH值）、色泽特性、酚类物质（花色苷、黄酮、多酚）含量及抗氧化活性的影响，旨在探讨非酿酒酵母胞外提取物提升樱桃果酒营养品质的潜力，为高品质樱桃果酒的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
樱桃 辽宁省大连市旅顺口区樱桃产业园生态基地；果酒酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SY安琪酵母股份有限公司；库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）CICC 33335、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）CICC 32337、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientails）CICC 32346、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombei）CICC 1761 中国工业微生物菌种保藏管理中心。
果胶酶（30 000 U/g） 山东必盛生物科技有限公司；麦芽汁液态培养基 上海复申生物科技有限公司；聚乙二醇20000、硫酸铵、硫酸铜、酒石酸钾钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、氢氧化钠、葡萄糖、盐酸、碳酸钠、柠檬酸钠、对硝基苯酚、亚硝酸钠、福林酚、4-硝基苯丁酸酯、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷等（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力试剂盒、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力试剂盒、羟自由基清除能力试剂盒 南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
BSA224I-1CCN型电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SPX-150BY-Ⅲ型生化培养箱 上海予卓仪器有限公司；SW-CJ-1F型垂直送风净化工作台 苏州净化工作台设备有限公司；PH111型台式pH计 美国赛默飞世尔科技公司；WAY型手持折光仪、HH-4型恒温水浴锅、LC-Vortex MF型漩涡混合器 上海力辰仪器科技有限公司；Neofuge 15R型高速冷冻离心机 上海力康生物医疗科技控股有限公司；UV-2800A型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；TS8216型台式分光测色仪 深圳三恩时科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 胞外提取物制备
采用麦芽汁液态培养基分别活化库德里阿兹威毕赤酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母和粟酒裂殖酵母，置于28 ℃恒温培养48 h，连续传代3次后，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液；加入硫酸铵至700 g/L饱和度，置于4 ℃沉淀24 h后，再以相同条件离心15 min，弃去上清液；加入0.05 mol/L乙酸缓冲液（pH 4.5）至沉淀完全溶解，相同条件离心15 min，收集上清液；转移至透析袋中（分子质量14 kDa），4 ℃透析24 h，透析后加入聚乙二醇20000，直至沉淀不再增加，收集沉淀，溶解于等体积的柠檬酸缓冲液中（pH 5.0）中，4 ℃保存待用[11]。
1.3.2 樱桃果酒制备
工艺流程：樱桃→去梗、去核→打浆→酶解→调整糖和pH值→灭菌→接种、添加非酿酒酵母胞外提取物→发酵→成品。
选取表面完整、无腐烂的新鲜樱桃，去除果梗与果核后加入3倍果实质量的去离子水打浆，加入质量分数0.03%的果胶酶，置于45 ℃恒温酶解4 h，冷却至室温后加入白砂糖，将糖度调节至210 g/L，65 ℃巴氏灭菌30 min，冷却后装入无菌发酵瓶[7]。
将果浆随机分为5组接种果酒酿酒酵母及不同酿酒酵母胞外提取物：1）接种质量分数0.2%的果酒酿酒酵母，作为对照组，样品编号为SC；2）接种质量分数0.2%的果酒酿酒酵母，发酵12 h后补充质量分数0.5%的库德里阿兹威毕赤酵母胞外提取物，样品编号为PK；3）接种质量分数0.2%果酒酿酒酵母，发酵12 h后补充质量分数0.5%葡萄汁有孢汉逊酵母胞外提取物，样品编号为HU；4）接种质量分数0.2%的果酒酿酒酵母，发酵12 h后补充质量分数0.5%的东方伊萨酵母胞外提取物，样品编号为IO；5）接种质量分数0.2%的果酒酿酒酵母菌，发酵12 h后补充质量分数0.5%的粟酒裂殖酵母胞外提取物，样品编号为SP。置于30 ℃恒温发酵，期间每日测定可溶性固形物，当连续3 d无显著变化即视为发酵结束。发酵完成后，用120目滤布过滤，收集滤液，得到樱桃果酒。
1.3.3 β-葡萄糖苷酶和酯酶活性测定
参考李静[14]的方法测定β-葡萄糖苷酶活性，具体如下：吸取100 μL胞外提取物，依次加入1 mL 0.05 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.8）和900 μL 5 mmol/L对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，37 ℃反应10 min，加入1 mL 1 mol/L碳酸钠溶液终止反应，于410 nm波长处测定吸光度，以去离子水作为空白，每分钟释放1 μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个酶活力单位（U）。
参考Sun Wangsheng等[11]的方法测定酯酶活性，具体如下：吸取200 μL胞外提取物，依次加入1.72 mL 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 5.0）和80 μL 25 mmol/L对硝基苯丁酸酯溶液，37 ℃反应60 min，加入500 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液终止反应，于400 nm波长处测定吸光度，以去离子水作为空白，每分钟释放1 μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个酶活性单位（U）。
1.3.4 常规理化指标测定
参考文献[10,14-15]方法并结合国家标准测定常规理化指标。其中，乙醇体积分数：参照GB 5009.225—2023《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》进行测定；可溶性固形物：参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》进行测定；总酸：参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定（含第1号修改单）》进行测定；pH值：参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行测定；还原糖：参照GB 5009.7—2025《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》进行测定；VC：参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》进行测定；总酯：参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》进行测定。
1.3.5 色泽测定
利用台式分光测色仪测定樱桃果酒的色泽参数，分别记录L*、a*、b*值，并按下式计算ΔE：
式中：L1、a1和b1分别表示样品的L*、a*和b*值；L0、a0和b0分别表示对照的L*、a*和b*值。
1.3.6 酚类物质测定
参考文献[16]方法并结合国家标准测定酚类物质含量。其中，总黄酮：参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》进行测定；总多酚：参照SN/T 5658.3—2023《蒸馏酒质量鉴别方法 第3部分：多酚总量的测定 分光光度法》进行测定；总花色苷：参照T/ZNZ 320—2025《植物源性食用农产品中总花色苷含量的测定 分光光度法》进行测定。
1.3.7 抗氧化活性测定
吸取400 μL果酒样品，根据DPPH自由基清除能力试剂盒、ABTS阳离子自由基清除能力试剂盒和羟自由基清除能力试剂盒说明书分别检测樱桃果酒的DPPH、ABTS阳离子和羟自由基的清除率[16-18]。以0.1 mg/mL VC溶液作为对照。清除率计算公式如下：
式中：A空白、A测定和A对照分别为空白、测定样品和对照的吸光度。
1.4 数据处理
所有实验均重复3次，结果以
表示。使用GraphPad Prism 8.5软件绘制图形，利用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，其中P＜0.05表示差异显著，采用SCIMA 14.0软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。
2 结果与分析
2.1 不同非酿酒酵母胞外提取物β-葡萄糖苷酶和酯酶活性比较
β-葡萄糖苷酶是一类重要的纤维素水解酶，能催化水解芳香糖苷前体非还原端的β-葡萄糖苷键，促进芳香物质释放，从而提升产品的营养品质与抗氧化活性。由表1可知，不同非酿酒酵母胞外提取物中β-葡萄糖苷酶活性存在显著差异（P＜0.05），其中菌株PK的β-葡萄糖苷酶活性最高，为15.23 U/L。酯酶可在果酒发酵过程中促进酯类物质的合成，从而提升酯类含量，增强果酒风味[19]。不同非酿酒酵母胞外提取物中酯酶活性存在显著差异（P＜0.05），其中菌株IO的酯酶活性最高，为15.06 U/L。非酿酒酵母产生的β-葡萄糖苷酶和酯酶，分别通过水解糖苷键和催化酯键释放更多游离酚类和酯类前体物质，促进酯类积累，从而有效改善产品的营养价值和感官品质[11]。综上，不同非酿酒酵母的β-葡萄糖苷酶和酯酶活性存在显著的菌株特异性。
表1 不同非酿酒酵母胞外提取物β-葡萄糖苷酶和酯酶活性比较
Table1 Comparison of the activities of β-glucosidase and esterase from different non-Saccharomyces yeasts extracellular extracts
非酿酒酵母β-葡萄糖苷酶活性/（U/L）酯酶活性/（U/L）PK15.23±1.02a3.95±0.37d HU8.54±0.75b11.48±1.01b IO5.96±0.56 c15.06±1.13 a SP4.72±0.68d7.11±0.66c
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），下同。
2.2 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒常规理化特性的影响
果酒的理化特性是衡量其内在品质、稳定性及安全性的重要参数。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒乙醇体积分数和可溶性固形物含量的影响见图1。经非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母协同发酵后，樱桃果酒的乙醇体积分数显著高于SC组（P＜0.05），其中，PK组较SC组提高8.52%，说明胞外提取物具有协同增效作用，可促进酿酒酵母增殖。非酿酒酵母胞外提取物可通过水解原料释放可被酿酒酵母直接利用的小分子碳水化合物，促进其生长繁殖与乙醇代谢，从而提高樱桃果酒乙醇体积分数[20]。PK组和HU组的乙醇体积分数分别为11.08%和10.75%，显著高于IO组和SP组（P＜0.05），这与不同非酿酒酵母胞外提取物中酶活性水平差异密切相关，尤其是β-葡萄糖苷酶活性。此外，不同处理组的可溶性固形物含量差异显著（P＜0.05）。SC组的可溶性固形物含量最高，可达6.43 °Brix，与HU组和SP组无显著差异（P＞0.05），显著高于PK组和IO组（P＜0.05）。这一现象主要归因于不同非酿酒酵母在基因组成和代谢途径上的差异，导致胞外提取物酶活性不同，进而影响可溶性固形物的分解速率。在樱桃果酒酿造过程中，非酿酒酵母胞外提取物能维持较高的酶活性，持续促进原料中多糖和单宁等大分子的水解，释放小分子糖类，为酿酒酵母提供直接可利用的碳源，促进其生长代谢，从而影响乙醇体积分数和可溶性固形物含量[11]。因此，非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵有助于提升果酒的乙醇体积分数，并提升原料利用率。
图1 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒乙醇体积分数和可溶性固形物的影响
Fig.1 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on the alcoholic content and soluble solids content of cherry fruit wine
酸度是影响果酒口感平衡和风味协调的关键因素，且适宜的酸度有助于抑制杂菌生长，保障果酒品质[21]。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒pH值和总酸含量的影响见图2。与SC组相比，添加不同非酿酒酵母胞外提取物后，PK组的pH值显著升高（P＜0.05），达到3.93；IO组和SP组的pH值分别为3.87和3.90，与SC组无显著差异（P＞0.05）；值得注意的是，HU组的pH值则下降至3.82，显著低于其他各组（P＜0.05）。此外，樱桃果酒的总酸含量与pH值变化呈相反趋势，其中HU组的总酸质量浓度最高，可达9.11 g/L，显著高于其他各组（P＜0.05）；SC组、IO组和SP组的总酸质量浓度分别为8.46、8.27 g/L和8.5 g/L，3组之间无显著差异（P＞0.05）；而PK组的总酸质量浓度仅为7.88 g/L，显著低于其他各组（P＜0.05）。果酒的总酸和pH值与其中有机酸的种类及含量密切相关，不同有机酸的酸性强弱各异[22]。不同非酿酒酵母的产酸能力差异主要来源于菌株间的代谢特异性，导致其胞外提取物中有机酸的种类和含量不同，进而影响酿酒酵母的生长代谢[16,23]。
图2 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒pH值和总酸的影响
Fig.2 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on pH and total acidity of cherry fruit wine
还原糖不仅是酿酒酵母生长代谢的重要碳源，还与酸、醇共同构成果酒的主体风味骨架，影响其口感的圆润度、饱满度和平衡感[24]。VC作为强抗氧化剂，有助于果酒色泽及品质的稳定性。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒还原糖和维生素C含量的影响见图3。添加不同非酿酒酵母胞外提取物后，樱桃果酒的还原糖含量显著低于SC组（P＜0.05），表明胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵有助于提高原料中糖分的利用与转化效率，促进乙醇生成。这一结果与图1所示的乙醇体积分数变化趋势一致。与SC组相比，PK、HU、IO组和SP组的还原糖含量分别降低43.65%、29.56%、20.72%和9.12%。这种差异主要归因于非酿酒酵母菌株的特异性，导致胞外提取物中酶的种类及活性不同，进而影响酿酒酵母对糖分的利用效率[11]。此外，添加不同非酿酒酵母胞外提取物后，樱桃果酒的VC含量均有不同程度提高，表明其有助于减少樱桃原料中VC的流失与氧化分解。HU组的VC质量浓度最高，可达89.72 mg/L，显著高于其他各组（P＜0.05），PK组较SC组提高5.13%。因此，非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵有助于提高原料还原糖的利用效率，并降低VC的损失，其效果受非酿酒酵母菌株特异性影响。
图3 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒还原糖和VC的影响
Fig.3 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on reducing sugar and vitamin C of cherry fruit wine
酯是果酒中香气与口感的重要载体，可赋予果酒复杂的风味特征与丰富的层次感，主要源于酶促合成和酵母代谢[25]。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒总酯含量的影响见图4。SC组的总酯质量浓度为96.78 mg/L。不同非酿酒酵母胞外提取物的添加显著提高了樱桃果酒的总酯含量，表明其可促进酯类物质的合成，进而增强果酒的风味特征。与SC组相比，PK、HU、IO组和SP组的总酯含量分别提高8.69%、22.28%、29.37%和14.11%。该结果与表1中酯酶活性的变化趋势一致，说明非酿酒酵母胞外提取物的添加提高了发酵过程中酯酶活性，利用醇类和酸类化合物作为底物，促进酯类物质的合成，进而增加总酯含量，提升果酒香气品质[25] 。此外，还原糖的消耗量也会影响酯类物质的合成，消耗越多，酵母代谢越活跃，合成的酯类产物越多，并通过外排作用转运至胞外，最终提高果酒中的总酯含量[26]。综上，非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵能有效地改善樱桃果酒理化特性。
图4 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒总酯的影响
Fig.4 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on total ester of cherry fruit wine
2.3 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒色泽特征的影响
色泽是吸引消费者的重要感官因素，与消费者的心理接受度密切相关[27]。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒色泽的影响见表2。SC组的L*、a*和b*值分别为80.75、8.89、30.51。添加不同非酿酒酵母胞外提取物后，樱桃果酒的L*、a*和b*值均有所提升，范围分别为80.87～81.66、9.08～10.21和30.69～31.26。该结果与Fazio等[24]研究结果一致，表明非酿酒酵母胞外提取物的β-葡萄糖苷酶可特异性水解花色苷等呈色物质的糖苷键，释放出更稳定、色泽更明亮、含量更丰富的苷元，从而改善樱桃果酒色泽，使其色泽更红亮[24]。此外，通过色差（ΔE）综合评估不同非酿酒酵母胞外提取物添加对樱桃果酒色泽的影响。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒的色差影响不同，其中PK组的色差（ΔE）最大，为1.64，而HU、IO、SP组的色差（ΔE）分别为1.02、0.95、0.29。通常，ΔE＜2时，认为色泽变化不显著，消费者难以感知到明显差异[27]。综上，不同非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵有助于改善樱桃果酒色泽，但色差变化较小，不足以影响消费者的感官感知。
表2 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒色泽的影响
Table2 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on color of cherry fruit wine
样品L*a*b*ΔESC80.75±0.12d8.89±0.08e30.51±0.09d PK81.66±0.25a10.21±0.21a30.87±0.13bc1.64±0.19a HU81.23±0.13b9.62±0.18b31.03±0.12ab1.02±0.14b IO81.08±0.14bc9.37±0.16c31.26±0.15a0.95±0.11b SP80.87±0.17cd9.08±0.11d30.69±0.05cd0.29±0.12c
2.4 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒酚类物质的影响
黄酮、多酚和花色苷是水果中至关重要的天然植物活性成分，不仅赋予产品色泽，影响其感官接受度，还因其抗氧化活性和调节肠道菌群的作用，有助于维护肠道健康[18]。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒中总黄酮、总多酚和总花色苷含量的影响见图5。SC组的总黄酮、总多酚和总花色苷质量浓度分别为253.18、3 218.57、317.24 mg/L。添加不同非酿酒酵母胞外提取物后，樱桃果酒中总黄酮、总多酚及总花色苷含量均有所增加，表明非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵可有效促进天然植物活性成分的转化与积累，是提升其含量的有效策略。其中PK组的总黄酮、总多酚和总花色苷含量均最高，与SC组相比，总黄酮、总多酚和总花色苷含量显著增加21.78%、14.27%和33.50%（P＜0.05）。该结果可能与非酿酒酵母胞外提取物中水解酶的活性有关。非酿酒酵母分泌的β-葡萄糖苷酶和果胶酶等水解酶可显著提高发酵过程中的水解效率，一方面促进结合态天然活性成分前体的释放，另一方面加速其向游离态的转化，并增强游离态成分的稳定性[28]。此外，游离态天然活性成分含量的增加可减少黄酮、多酚和花色苷与蛋白质形成的大分子絮凝沉淀，增强酒体结构，改善色泽均匀性，并促进辅色作用，使果酒色泽更为明亮稳定[27]。因此，非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵有助于提高樱桃果酒中总黄酮、总多酚和总花色苷含量，改善酒体稳定性，并进一步增强其保健功能。
图5 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒总黄酮、总多酚和总花色苷的影响
Fig.5 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on total flavonoids, total polyphenols and total anthocyanins of cherry fruit wine
2.5 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒抗氧化活性的影响
果酒的抗氧化活性与其中天然植物活性成分的含量密切相关，这些化合物可通过氢原子或质子转移抑制自由基的生成及链式反应的传递，或通过过渡金属螯合、单电子转移、过氧化氢还原及超氧化物和单线态氧的猝灭阻止自由基形成，最终发挥清除自由基作用[29]。不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒抗氧化活性的影响见图6。
图6 不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒抗氧化活性的影响
Fig.6 Effect of different non-Saccharomyces yeast extracellular extracts on antioxidant activity of cherry fruit wine
由图6可知，SC组的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率分别为60.08%、54.53%和49.79%。添加不同非酿酒酵母胞外提取物后，樱桃果酒的抗氧化活性均显著提高（P＜0.05），其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率分别增加至62.94%～72.15%、56.97%～62.26%和51.84%～57.55%。其中PK组的抗氧化活性最强，DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率相比SC组分别显著提高20.09%、14.18%和15.59%（P＜0.05），该结果与图5中添加不同非酿酒酵母胞外提取物后樱桃果酒的总黄酮、总多酚和总花色苷含量变化一致，说明果酒发酵过程中代谢产生的天然植物活性成分显著增加，进而增强其抗氧化活性。综上，不同非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵能显著增强樱桃果酒的抗氧化活性，且活性强弱与胞外提取物中酶的活性密切相关。
2.6 樱桃果酒综合品质的PCA
PCA是一种常用的降维方法，可通过线性变换将原始数据投影到新的坐标系中，最大化量化方差，以便判断不同分组间的差异[30]。为评估不同非酿酒酵母胞外提取物对樱桃果酒综合品质的影响，本研究将其常规理化指标、色泽特征、酚类物质含量及抗氧化活性纳入PCA。由图7可知，PC1和PC2的方差贡献率分别为74.13%和19.08%，两者累计可解释93.21%的总变异量，说明前2个PCA足以对不同发酵方式的樱桃果酒进行有效评估和区分[30]。PCA结果显示，SC组位于第1象限，PK组位于第2象限，IO组和HU组位于第3象限，而SP组位于第4象限，表明樱桃果酒的理化特性、色泽、酚类物质含量及抗氧化活性均与发酵方式密切相关。因此，不同非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同发酵可显著改善樱桃果酒的综合品质，且效果与胞外提取物中酶活性密切相关。
图7 樱桃果酒综合品质的PCA得分图
Fig.7 Principal component analysis score plot of the comprehensive quality of cherry fruit wine
3 结 论
本研究以樱桃为原料，通过添加不同非酿酒酵母胞外提取物与酿酒酵母协同发酵制备樱桃果酒，系统比较不同发酵方式下樱桃果酒的常规理化性质、色泽特性、酚类物质含量及抗氧化活性的差异。结果表明，与单独使用酿酒酵母相比，协同发酵可显著提高樱桃果酒的乙醇、VC和总酯含量，降低可溶性固形物和还原糖水平，改善pH值与酸度。此外，协同发酵不仅有效地改善了樱桃果酒的L*、a*和b*值，使其色泽更加鲜艳红亮，还提高了总黄酮、总多酚及总花色苷含量，并增强了DPPH、ABTS阳离子及羟自由基的清除能力，从而提升了其潜在健康效益。使用非酿酒酵母胞外提取物可有效提升樱桃果酒的品质、色泽及抗氧化活性，且效果与其胞外提取物的酶活性密切相关。其中，库德里阿兹威毕赤酵母胞外提取物与酿酒酵母的协同效果最为突出。总之，在发酵体系中补充非酿酒酵母胞外提取物是一种前景广阔的发酵调控策略，本研究为高品质樱桃果酒的开发提供了理论依据与数据支持。
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