甜玉米是禾本科玉米属中的亚种，外皮纤薄、质地清脆、籽粒饱满乳嫩，故称“水果玉米”[1]。甜玉米中的植物纤维素可改善肠道蠕动，有效防止便秘和肠炎发生，并能减缓葡萄糖吸收以调控餐后血糖水平；所含多酚化合物还具有抗氧化、抗炎、抗衰老等健康促进作用[2]。甜玉米，主要在乳熟期采收作鲜食或加工，具有水果般的多汁口感和生食适性。
酵素是以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品，其中食用酵素是以新鲜果蔬、糙米及药食同源中药材等为原料，经打浆或萃取后接种酵母菌、乳酸菌等发酵菌株制成的混合发酵液[3]。酵素中的糖类与有机酸主要提供能量并调节肠道环境，矿物质和维生素维持机体正常代谢，酚类与萜类物质发挥抗氧化作用，而酶类则直接催化各类生物化学反应[4]。混合菌种发酵可有效保留果蔬营养与酚类物质，显著提升酵素品质与抗氧化活性[5]。食用酵素主要有水果及谷物酵素等[6-8]，阙斐等[9]研究表明，酵母菌与植物乳植杆菌混合发酵制备的香蕉酵素对体外自由基的清除率优于自然发酵。覃引等[10]研究表明，嗜热链球菌及干酪乳杆菌混菌发酵树莓-石榴复合酵素的抗氧化能力优于单菌发酵与自然发酵。张巧等[11]研究发现，酵母菌＋醋酸菌＋乳酸菌发酵的大果山楂酵素品质最佳。甜玉米营养丰富但加工方式单一、不易贮藏，导致利用率与经济效益低，开发具有抗氧化活性的甜玉米酵素的研究报道较少[12-13]。
本研究以甜玉米为原料，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）混合（1∶1）发酵制备甜玉米酵素，通过单因素试验探究混合菌种接种量、白砂糖添加量、发酵温度和发酵时间对甜玉米酵素中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的影响，结合正交试验优化其最佳发酵工艺条件，并测定其体外抗氧化活性，旨在开发具有高抗氧化活性的甜玉米发酵产物，为甜玉米精深加工及高附加值产品开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甜玉米（中农甜488）购于湖北省荆门市金马购物中心；白砂糖（蔗糖≥99.5%） 莲花健康产业集团股份有限公司；酿酒酵母 安琪酵母股份有限公司；植物乳植杆菌 陕西千维生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三甲基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrohydrazine，DPPH）、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazo-line-6-sulfonic acid)， ABTS）、VC 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SOD试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司。
1.2 仪器与设备
Y915S破壁机 九阳股份有限公司；SHP-160生化培养箱 常州普天仪器制造有限公司；Multiskan Skyhigh全波长酶标仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TGL-20M冷冻高速离心机 常州市英格尔仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 甜玉米酵素的加工工艺流程及操作要点
工艺流程：甜玉米→清洗、剥粒→破碎→调整糖度→巴氏杀菌→冷却→接种混合发酵剂→发酵→成品。
操作要点：
原料预处理：选取新鲜甜玉米，去除玉米须和杂质，用蒸馏水洗净后剥粒后于破壁机中打碎至均匀糊状，得到甜玉米浆。
甜玉米酵素制备[14]：称取一定量的甜玉米浆，按1.0∶2.5（g/mL）料液比加水混合后添加10 g/100 mL白砂糖，65 ℃下巴氏灭菌30 min，冷却至室温后再接种0.2%（V/V）的植物乳植杆菌与酿酒酵母（1∶1）（35 ℃无菌水活化10 min），于30 ℃恒温培养箱中发酵24 h，离心取上清液即获得甜玉米酵素。
1.3.2 甜玉米酵素发酵条件优化
1.3.2.1 单因素试验
以SOD活力为评价指标，采用单因素轮换法依次考察接种量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、白砂糖添加量（5、10、15、20、25 g/100 mL）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）、发酵时间（1、2、3、4、5 d）对甜玉米酵素SOD活力的影响[15]。
1.3.2.2 正交试验
在单因素试验结果的基础上，以SOD活力为评价指标，以接种量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为影响因素，设计4因素3水平的L9(34)正交试验，试验因素与水平见表1。
表1 甜玉米酵素发酵条件优化正交试验因素与水平
Table1 Orthogonal experimental design for optimizing fermentation conditions of sweet corn Jiaosu
水平A接种量/%B白（g砂/1糖00添 m加L）量/C发酵温度/℃D发酵时间/d－10.51030200.71535310.920404
1.3.3 抗氧化能力测定
DPPH自由基清除率：取1 mL不同质量浓度（2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）甜玉米酵素样品，分别加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH工作液，振荡混匀后避光反应30 min。随后，在波长517 nm处测定样品溶液吸光度（A1），无水乙醇代替DPPH溶液，测得吸光度（A2），蒸馏水代替酵素样品溶液，测得吸光度（A0）[16]。以VC溶液为阳性对照。按下式计算DPPH自由基清除率：
ABTS阳离子自由基清除率：取2 mL不同质量浓度（2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）甜玉米酵素样品，分别加入2 mL ABTS阳离子自由基工作液，充分混匀，避光反应10 min，在波长734 nm处测定样品溶液吸光度（A1），无水乙醇代替ABTS阳离子自由基工作液，测得吸光度（A2），蒸馏水代替样品溶液，测得吸光度（A0），以VC溶液为阳性对照，按式（1）计算ABTS阳离子自由基清除率[17]。
羟自由基清除率实验：取2 mL不同质量浓度（2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）甜玉米酵素样品，分别加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和2 mL 9 mmol/L水杨酸溶液，振荡摇匀后，立即加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，避光反应30 min，在波长510 nm处测定样品溶液吸光度（A1）。蒸馏水代替H2O2溶液溶液，测得吸光度（A2），纯水代替样品溶液，测得吸光度（A0），以VC溶液为阳性对照，按式（1）计算羟自由基清除率。
1.4 数据处理
所有实验重复测定3次，采用Excel 2019处理数据，SPSS 19.0进行单因素方差分析，Origin 2024绘图。
2 结果与分析
2.1 甜玉米酵素发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 混合菌种接种量对SOD活力的影响
由图1可知，随着接种量在0.1%～0.9%范围内的升高，甜玉米酵素的SOD活力先上升后下降。当混合菌种接种量为0.1%～0.7%时，甜玉米酵素的SOD活力随之升高；当接种量为0.7%时，SOD活力最高，为46.95 U/mL；当混合菌种接种量超过0.7%之后，SOD活力有所下降。其原因可能是，当菌种接种量较少时，发酵较为缓慢，当接种量较高时，生长繁殖较为迅速，营养物质和氧气消耗过快，植物乳植杆菌产乳酸导致pH值显著下降，影响SOD活力[18]。因此，确定最佳接种量为0.7%。
图1 混合菌种接种量对SOD活力的影响
Fig.1 Effect of mixed strain inoculum on SOD activity
2.1.2 白砂糖添加量对SOD活力的影响
由图2可知，随着白砂糖添加量在5～25 g/100 mL范围内的升高，甜玉米酵素的SOD活力先上升后下降。当白砂糖添加量为5～15 g/100 mL时，甜玉米酵素的SOD活力随之升高；当白砂糖添加量为15 g/100 mL时，SOD活力最高，为48.46 U/mL；当白砂糖添加量超过15 g/100 mL之后，SOD活力显著下降。其原因可能是，当白砂糖添加量较低时，酿酒酵母和植物乳植杆菌缺乏足够的碳源，无法正常生长，当白砂糖添加量较高时，发酵液渗透压的提高会抑制菌体的生物代谢[19]。因此，确定最佳白砂糖添加量为15 g/100 mL。
图2 白砂糖添加量对SOD活力的影响
Fig.2 Effect of white granulated sugar addition on SOD activity
2.1.3 发酵温度对SOD活力的影响
由图3可知，随着发酵温度在20～40 ℃范围内上升，甜玉米酵素的SOD活力呈先上升后下降趋势。当发酵温度为20～35 ℃时，甜玉米酵素的SOD活力随之升高；当发酵温度为35 ℃时，甜玉米酵素的SOD活力最高，为49.55 U/mL；当发酵温度超过35 ℃之后，甜玉米酵素的SOD活力有所下降。其原因可能是，菌株在低温条件下增殖缓慢，SOD合成速度较慢；但较高的发酵温度条件下，SOD易变性失活[20]。因此，确定最佳发酵温度为35 ℃。
图3 发酵温度对SOD活力的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on SOD activity
2.1.4 发酵时间对SOD活力的影响
由图4可知，随着发酵时间在1～5 d内的延长，甜玉米酵素的SOD活力呈先上升后下降趋势。当发酵时间为1～3 d时，SOD活力随之逐渐上升；当发酵时间为3 d时，SOD活力达到最高，为54.07 U/mL；发酵时间超过3 d时，SOD活力有所下降。其原因可能是，发酵初期溶氧充足，底物丰富，有助于菌体的生长繁殖，可提高酵素中SOD活力，发酵时间过长，发酵液中的营养物质逐渐被消耗导致微生物发酵速度减慢[21-22]。因此，确定最佳发酵时间为3 d。
图4 发酵时间对SOD活力的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on SOD activity
2.2 甜玉米酵素发酵条件优化正交试验结果
基于单因素试验结果，以接种量（A）、白砂糖添加量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为影响因素，以SOD活力（Y）为评价指标，进行4因素3水平（L9(34)）正交试验对甜玉米酵素的发酵条件进行优化，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。
表2 甜玉米酵素发酵条件优化正交试验结果与分析
Table2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions of sweet corn Jiaosu
试验号ABCDY SOD活力/（U/mL）1111154.78±1.932212253.99±1.843313351.45±1.734123254.49±1.525221349.51±0.406322155.50±0.307132348.45±1.218233158.47±1.089331254.81±1.99 k152.5753.4153.0356.25 k253.9953.1752.6554.43 k 353.9253.9154.8049.80 R1.420.742.156.45
表3 正交试验结果方差分析
Table3 Variance analysis of orthogonal experimental results
平方和自由度均方F值P值显著性A11.47625.7382.686＜0.05*B2.59021.2950.6060.121 C23.801211.9005.571＜0.05*D198.834299.41746.541＜0.001**因素离差误差38.450182.136
注：*.影响显著（P＜0.05）；**.影响极显著（P＜0.01）。
由表2可知，由极差R值可知，影响甜玉米酵素SOD活力因素的高低排序依次为D＞C＞A＞B，即发酵时间＞发酵温度＞混合发酵菌种接种量＞白砂糖添加量。甜玉米酵素的最佳发酵工艺条件组合为A2B3C3D1，出现在设计的第8组正交试验中，其SOD活力为58.47 U/mL，即接种量0.7%、白砂糖添加量20 g/100 mL、发酵温度40 ℃和发酵时间2 d。
由表3可知，发酵时间（D）对SOD活力影响极显著（P＜0.01）；接种量（A）、发酵温度（C）对SOD活力影响显著（P＜0.05），而白砂糖添加量（B）对SOD活力影响不显著（P＞0.05）。
2.3 甜玉米酵素抗氧化活性分析
DPPH自由基是一种比较稳定的自由基，其清除率常用于快速评价样品的抗氧化活性[23]。由图5A可知，随着甜玉米酵素与VC溶液的质量浓度在2.5～15.0 mg/mL范围内的增加，其对DPPH自由基清除能力明显增加；当质量浓度大于15.0 mg/mL，其对DPPH自由基清除能力趋于平稳；当质量浓度为20.0 mg/mL时，甜玉米酵素与VC溶液清除率分别达最高值（81.2%、82.4%）。随着酵素质量浓度的增加，一系列具有抗氧化活性的多酚类、黄酮类化合物含量增加，这些物质能够与DPPH自由基发生反应，使DPPH自由基清除率快速升高[24]。
图5 甜玉米酵素样品对DPPH自由基（A）、ABTS阳离子自由基（B）及羟自由基（C）清除能力的影响
Fig.5 Scavenging abilities of sweet corn Jiaosu on DPPH radical (A), ABTS cation radical (B) and hydroxyl radical (C)
ABTS在强氧化剂（如K2S2O8或H2O2）作用下生成蓝绿色的ABTS阳离子自由基，在波长734 nm处具有特征性吸收峰。抗氧化剂可通过给ABTS阳离子自由基提供电子或氢原子，使其被还原为无色或浅黄色ABTS[25]，由图5B可知，随着甜玉米酵素与VC溶液的质量浓度在2.5～15.0 mg/mL范围内的增加，其对ABTS阳离子自由基清除能力明显增加；当质量浓度超过15.0 mg/mL后，其对ABTS阳离子自由基清除能力趋于平稳。当质量浓度为20.0 mg/mL时，甜玉米酵素与VC溶液清除率分别达最高值（88.2%、90.3%）。
Fenton反应能够引发具有强氧化性的羟自由基的形成。当水杨酸与羟自由基相遇时，氧化反应随即发生，生成2,3-二羟基苯甲酸，通过检测水杨酸捕获羟自由基后产生的2,3-二羟基苯甲酸的含量可评估羟自由基清除能力[26]，由图5C可知，甜玉米酵素与VC溶液的质量浓度在2.5～15.0 mg/mL范围内的增加，其对羟自由基清除能力明显增加；当质量浓度超过15.0 mg/mL后，其对羟自由基清除能力趋于平稳；当质量浓度为20.0 mg/mL时，甜玉米酵素与VC 溶液清除率分别达最高值（69.1%和86.3%）。综上，甜玉米酵素具有一定的抗氧化能力。
3 结 论
本研究以甜玉米为主要原料，采用酿酒酵母与植物乳植杆菌混合（1∶1）发酵制备甜玉米酵素。通过单因素与正交试验获得其最佳发酵工艺条件为：混合菌种接种量0.7%、白砂糖添加量20 g/100 mL、发酵温度40 ℃、发酵时间2 d。在此优化条件下，甜玉米酵素中SOD活力可达58.47 U/mL。甜玉米酵素质量浓度为20.0 mg/mL时，对DPPH、ABTS阳离子及羟自由基的清除率分别为81.2%、88.2%、69.1%。因此，甜玉米酵素具有一定的抗氧化活性。本研究优化了甜玉米酵素的混合菌种发酵工艺条件，并证实其具有良好的抗氧化活性。研究结果为甜玉米的深加工利用提供了新途径，也为功能性酵素产品的开发奠定基础。
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