多糖是广泛存在于植物、动物和微生物中的大分子聚合物[1]，通常由10个以上单糖组成，这些单糖通过线性或支链中的糖苷键连接[2]。多糖具有生物降解性、生物相容性低、生物黏附能力低、抗菌活性高等优异生物学特点，真菌多糖更因富含羟基、羧基和胺等可修饰官能团而展现出优异的化学功能化潜力[3]。乳酸菌是一类食品级安全微生物，具有显著的益生活性，被广泛应用于食品工业与健康产业。乳酸菌所产胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）作为一种高分子物质，具有良好的生物相容性及可降解性，受到科研工作者的高度重视[4-5]。最新研究揭示，特定结构类型的EPS不仅具有抗炎、免疫调节及抗氧化等生物活性[6]，而且在心血管保护、慢性病风险调控、免疫系统增强及肠道微生态平衡等健康领域展现出显著功效[7-8]。通过系统化的菌株筛选与功能强化策略[9]，EPS已从传统食品质构改良剂开发为兼具营养与治疗功能的生物活性分子，在食品医药交叉领域形成独特的应用优势[10]。
目前，产EPS的乳酸菌筛选已有较多报道。陈佩等[11]从泡菜水和酸奶中通过平板涂布及三区划线法分离得到了一株高产EPS的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）S44。陈靖等[12]采用初筛菌落拉丝法和复筛苯酚-硫酸法从来源于牛乳及乳制品的40株菌株中筛选出10株产EPS的菌株，其中2株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、1株干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和 1株短乳杆菌（Lactobacillus brevis）具有较高的EPS产量与潜在的益生特性。李悦等[13]从四川特色传统发酵食品腊肉与泡菜中筛选出3株高产EPS的乳酸菌菌株，经鉴定分别为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）和绿色魏斯氏菌 （Weissella viridescens）。
花粉中含有丰富的糖类等活性物质，为微生物的生长提供了良好的物质基础。然而，从花粉中筛选产EPS的乳酸菌的报道仍较少。因此，本研究以13种来源不同的花粉为实验材料，分离筛选产EPS的乳酸菌，对筛选菌株进行形态学观察、分子生物学鉴定、生长曲线绘制及生理生化实验，并评价其耐酸、耐胆盐、耐尿素、耐NaCl等耐受性，以期为益生菌资源拓展、天然功能性生物制品的开发提供依据与支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中华苦荬菜花粉、蒲公英花粉、金银忍冬花粉、草莓花粉、紫藤花粉、玫瑰花粉、欧洲荚蒾花粉、锦带花花粉、刺槐花粉、大花野豌豆花粉、单柱山楂花粉、心叶山楂花粉、车前花粉采集于山西师范大学校园内。
牛肉浸粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、猪胆盐、牛胆盐（均为生化试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯） 天津博迪化工有限公司；无水乙酸钠（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；硫酸镁（分析纯）天津渤化化学试剂有限公司；吐温80、蔗糖、无水乙醇（均为分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；葡萄糖（分析纯） 天津市江天化工技术股份有限公司；硫酸锰（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；柠檬酸铵（分析纯） 天津大学科威新材料科技开发公司；尿素 美国Sigma-Aldrich公司；碘化钾（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司；琼脂粉（化学纯） 天津市光复精细化工研究所；细菌基因组DNA提取试剂盒、通用型DNA纯化回收试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix II、6×Loading buffer 生工生物工程（上海）股份有限公司；Trans2K®Plus II DNA Marker 北京全式金生物技术股份有限公司；Gel Red凝胶红核酸染料 北京兰博利德生物技术有限公司。
MRS培养基：吐温80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.5 g、MnSO4·H2O 0.25 g、柠檬酸铵2 g、无水乙酸钠5 g、磷酸氢二钾2 g、酵母浸粉5 g、牛肉浸粉10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。108 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
MRS-S培养基：将MRS培养基中的葡萄糖含量调整为5 g，再加入50 g蔗糖，其他保持不变。108 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
MS303TS电子天平、LE438 pH计 梅特勒-托利多（上海）有限公司；Multitron Standar恒温培养箱 瑞士伊浮森公司；CPH-300-300光学显微镜 上海缔伦光学仪器有限公司；ProFex PCR仪 新加坡Life Technoiogies公司；PowerPacTM电泳仪、Gel DocTM XR+ with Image LabTM Software凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；Specord 200 Plus紫外分光光度计 德国耶拿公司；JSM-7500F扫描电子显微镜 日本JEOL公司。
1.3 方法
1.3.1 产胞外多糖乳酸菌初筛与复筛
菌株的初筛[14]：将采集到的13种花粉分别放置于装有10 mL MRS液体培养基的离心管中，30 ℃恒温培养24 h。随后吸取100 μL培养液，依次稀释至10－5，取100 μL稀释液均匀地涂布于MRS-S培养基平板并编号。观察表面是否有黏稠且能明显拉丝的菌落出现。挑取能够产糖的菌落于新的MRS-S培养基平板，获得单一产糖菌落。
菌株的复筛[14]：从初筛培养基中挑选出能够产胞外多糖的单一菌落，通过三区划线法，稀释10－5后接种于MRS和MRS-S琼脂培养基上。30 ℃条件下培养24 h，观察产糖情况。
1.3.2 胞外多糖产量测定
将菌株在MRS液体培养基中充分活化2代，取菌液以5%（V/V）的接种量接种至100 mL MRS-S液体培养基中进行产糖培养，培养条件为110 r/min、30 ℃、48 h。将得到的发酵液在8 000 r/min、4 ℃条件下离心1 h以去除菌体。向上清液中加入3倍体积预冷的95%乙醇，4 ℃过夜醇沉。再次离心，离心条件同上。得到粗多糖并溶于 20 mL的去离子水。将粗多糖溶液于－80 ℃冷冻处理后，冻干并称质量，即为粗多糖产量。
1.3.3 筛选菌株鉴定
1.3.3.1 溶液配制
草酸铵结晶紫染液：溶液A（称取结晶紫2 g，加入95%乙醇定容至20 mL）和溶液B（称取草酸铵0.8 g，加入去离子水定容至80 mL）混合，滤纸过滤后使用。
卢戈碘液：碘片1 g、碘化钾2 g，加入去离子水定容至300 mL，置于棕色瓶中备用。
0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：72 mL 0.2 mol/L Na2HPO4溶液和28 mL 0.2 mol/L NaH2PO4溶液混合，搅拌均匀，待用。
1.3.3.2 形态学观察
革兰氏染色：从已充分活化的菌液中吸取100 μL，将菌液滴在载玻片中央并进行固定。先用草酸铵结晶紫染色液对涂片进行初染，再用卢戈碘液媒染，最后用95%乙醇进行脱色处理。脱色完成后，用番红染色液对涂片进行复染。每次染色或脱色操作后，都需要用去离子水仔细冲洗载玻片并用吸水纸轻轻吸干水分，避免影响观察效果。将处理好的载玻片置于显微镜100倍油镜下观察菌株形态。
扫描电子显微镜观察：取800 μL充分活化的菌液8 000 r/min离心5 min。向离心后的菌体中加入2.5 g/100 mL 戊二醛固定液，室温固定4 h。随后用0.2%、pH 7.2的磷酸缓冲液按上述离心条件对菌体进行3次洗涤。随后用30%、50%、70%、85%、90%（V/V）乙醇进行脱水处理，每次离心后弃上清液。再用无水乙醇处理2次（每次静置15min后离心），用乙酸异戊酯处理2次，每次静置20 min后按上述条件离心。将最后得到的菌体样品进行冻干处理，以去除样品中的残余水分并保持其形态。将样品喷金等预处理后，置于扫描电子显微镜下进行观察。
1.3.3.3 分子生物学鉴定
将复筛获得的菌株接种于MRS液体培养基上充分活化，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组总DNA。以DNA样本为扩增模板，16SF（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和16SR（5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为通用引物，参照2×Taq PCR Master Mix II使用说明书进行PCR扩增。PCR扩增体系（20 μL）：Mix-Taq酶10 μL、模板DNA 2 μL、正向引物（16SF）1 μL、反向引物（16SR）1 μL、双蒸水（ddH2O）6 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16S rDNA序列测定。测序所得结果在NIST的GenBank数据库中进行BLAST比对，进行同源性分析，利用MEGA 11.0软件，通过邻接法构建系统发育树。
1.3.4 筛选菌株生物学特性分析
生理生化实验：参照左凯悦等[14]的方法进行糖发酵等实验。
生长曲线测定：将充分活化后的菌液按5%（V/V）接种量接种于MRS液体培养基中，30 ℃恒温静置培养，每3 h取样一次并测定OD600 nm值，以培养时间为横坐标，OD600 nm值为纵坐标绘制该菌株的生长曲线。
1.3.5 筛选菌株耐受性分析
最适pH值测定：将充分活化后的菌液以5%（V/V）的接种量接种于不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9）的MRS液体培养基中，30 ℃静置培养21 h，测定各pH值下菌株的OD600 nm值，对比各菌株在不同pH值下的存活情况。
NaCl耐受性测定：将充分活化后的菌液以5%（V/V）的接种量接种于不同NaCl质量分数（0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）的MRS液体培养基中，30 ℃静置培养21 h，测定各NaCl质量分数下菌株的OD600 nm值，对比各菌株在不同NaCl质量分数下的存活情况。
尿素耐受性测定：将充分活化后的菌液以5%（V/V）的接种量接种于不同尿素质量分数（0、2%、4%、6%、8%、10%、12%）的MRS液体培养基中，30 ℃静置培养21 h，测定各尿素质量分数下菌株的OD600 nm值，对比各菌株在不同尿素质量分数下的存活情况。
胆盐耐受性测定：将充分活化后的菌液以5%（V/V）的接种量接种于不同猪（牛）胆盐质量分数（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的MRS液体培养基中，30 ℃静置培养21 h，测定各猪（牛）胆盐质量分数下的OD600 nm 值，对比各菌株在不同胆盐质量分数下的存活情况。
1.4 数据处理
以上实验均重复进行3次，数据以
表示。利用Microsoft Excel 2010进行数据处理，采用GraphPad Prism 10.1.2进行单因素方差分析及作图。
2 结果与分析
2.1 产胞外多糖乳酸菌菌株的筛选及鉴定
2.1.1 乳酸菌的初筛与复筛
通过对产糖菌株初筛和复筛结果对比观察，获得产糖现象最明显的3株菌，分别编号为YF、A01、A02，计算其胞外多糖产量。由图1可知，菌株YF的胞外多糖产量最高，为（5.213 5±0.034 5）g/L。因此，选择菌株YF进行后续研究。
图1 复筛菌株胞外多糖产量
Fig.1 EPS yield of strains in the re-screened screening
2.1.2 筛选菌株的形态学观察
2.1.2.1 菌落形态
由图2A可知，菌株YF在MRS培养基上呈现出表面隆起的状态，其质地光滑且带有湿润感，边缘整齐，整体呈半透明状，形状为圆形。对比图2B和图2C，菌株YF在MRS-S培养基上有明显的产糖现象，说明菌株YF能够利用MRS-S培养基中的蔗糖合成并且分泌胞外多糖。
图2 筛选菌株在不同培养基上的菌落形态
Fig 2 Colony morphology of selected strains on different culture media
2.1.2.2 革兰氏染色
革兰氏染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌2类[15]。经革兰氏染色后的菌株YF的菌落形态见图3。染色后的菌株YF呈紫色，为革兰氏阳性菌，形态呈杆状或短棒状，无鞭毛，以单个细胞形式存在。
图3 筛选菌株的革兰氏染色
Fig.3 Gram staining image of selected strain
2.1.2.3 扫描电子显微镜观察
扫描电子显微镜可以更直观地观察菌株的微观结构特征。由图4可知，细胞呈杆状或短棒状，细胞的两端均呈圆形，以单个形式存在。该结果与革兰氏染色观察到的菌株形态一致。
图4 不同放大倍数下筛选菌株的扫描电镜图
Fig.4 Scanning electron microscopic images of selected strain at different magnifications
2.1.3 筛选菌株的分子生物学鉴定
由图5可知，菌株YF与Apilactobacillus kunkeei strain LK VN07聚于一个分支，相似度最高。因此，菌株YF被鉴定为昆氏乳杆菌（Apilactobacillus kunkeei）。
图5 基于16S rDNA基因序列筛选菌株的系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree of selected strain based on 16S rDNA gene sequences
2.2 筛选菌株的生物学特性
2.2.1 生理生化实验
微生物生理生化鉴定是微生物鉴定和分类的常规方法[16]。糖发酵实验可以作为检测微生物能否利用糖类作为碳源的指标。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解不同糖类物质的能力上有很大区别[17]。利用16种不同的糖源进行糖发酵实验，根据溴甲酚紫指示剂颜色的变化（溶液是否由紫变黄）[17-18]，判断菌株对碳源的利用情况，结果见表1。菌株YF能够利用鼠李糖、D-果糖、蔗糖、D-甘露糖、山梨醇、赤藓糖醇、麦芽糖和乳糖。表明该菌株虽对不同碳源的利用具有差异，但整体利用碳源能力较强。另外，菌株YF不产硫化氢、不液化明胶，脲酶、脂酶以及纤维素水解实验均为阴性。
表1 筛选菌株的生理生化实验结果
Table1 Physiological and biochemical experiment results of strain YF
糖类结果糖类结果水苏糖－D-核糖－鼠李糖＋D-果糖＋L-阿拉伯糖－山梨醇＋D-半乳糖－赤藓糖醇＋D-棉子糖－壳聚糖－海藻糖－麦芽糖＋D-木糖－乳糖＋D-甘露糖＋蔗糖＋硫化氢－明胶液化－脲酶－脂酶－纤维素水解－
注：＋.阳性；－.阴性。
2.2.2 生长曲线
微生物生长曲线常用测量方法为称重法、平板计数法、血球计数法和比浊法[19-20]。本研究采用比浊法，菌株YF的生长曲线见图6。菌株YF在0～6 h内生长速度较为缓慢，OD600 nm值上升趋势不明显，处于生长迟滞期；在6～21 h，菌株的生长速度显著提高，处于生长对数期；在21～33 h，菌株的生长基本趋于稳定，进入生长稳定期，OD600 nm值接近平稳，稳定在0.480 9±0.000 4。因此，依据生长曲线，选取培养21 h的菌株进行后续实验。
图6 筛选菌株的生长曲线
Fig.6 Growth curve of strain YF
2.3 筛选菌株的耐受性
2.3.1 酸耐受性
由图7可知，菌株在过酸或过碱条件下生长均受到较大抑制。当pH值为2～6时，菌株OD600 nm值显著升高（P＜0.05）；当pH值为6时OD600 nm值最高，为0.168 7±0.002 3，此时菌株表现出良好的生长性能；当pH值为6～9时，菌株OD600 nm值显著降低（P＜0.05）。尚天翠[21]研究了不同温度及pH值对乳酸菌生长的影响，结果表明pH值在6.5时乳酸菌生长最好。许媛等[22]研究了pH值对乳酸菌生长和乳酸产量的影响，结果表明pH值控制在6.0左右时，乳酸产量最高。这与本研究结果基本一致。当pH值为2～3时，菌株的OD600 nm值仍维持在0.106 6～0.112 7，说明其具有较强的酸耐受能力，且菌株YF可在较宽泛的pH值范围内生长，这一特性为其在食品、医药等领域的工业化应用奠定了基础。
图7 筛选菌株的酸耐受性
Fig.7 Acid tolerance of strain YF
2.3.2 NaCl耐受性
研究表明，人体胃肠道内的NaCl含量介于1%至4%之间[23]。本研究通过调节培养基中NaCl质量分数梯度构建不同渗透压环境，分析菌株YF渗透胁迫的耐受力，结果见图8。当NaCl质量分数为0%～2%时，菌株的OD600 nm值显著升高（P＜0.05），生长状况较好；当NaCl质量分数为2%时，菌株OD600 nm值达到最高，为0.546 6±0.000 7；当NaCl质量分数为4%～14%时，菌株的OD600 nm值开始大幅下降，生长受到明显抑制。这与罗开莲等[24]的研究结果一致，菌株YF耐盐性较差，不适用于具有高盐含量的食品中。
图8 筛选菌株的NaCl耐受性
Fig.8 NaCl tolerance of strain YF
2.3.3 尿素耐受性
由图9可知，当尿素质量分数为0%～2%时，菌株OD600 nm值持续上升；当尿素质量分数为2%时，OD600 nm 值达到最大，为1.164 6±0.000 7；当尿素质量分数为2%～12%时，菌株OD600 nm值逐渐下降，生长受到显著抑制。在成人体内，尿素的生理浓度通常维持在0.02%～0.04%[25]，而本研究中菌株对尿素的耐受性显著高于此生理范围，表明该菌株具备在宿主肠道等复杂微环境中定植并发挥益生功能的潜在能力。
图9 筛选菌株的尿素耐受性
Fig.9 Urea tolerance of strain YF
2.3.4 胆盐耐受性
乳酸菌对胆盐胁迫的耐受能力是其在肠道存活的关键因素，且胆盐胁迫耐受力具有菌株差异性[26]。在人体小肠中，胆盐质量分数范围在0.03%～0.3%之间[27]。由图10A可知，猪胆盐质量分数为0%～0.1%时，菌株生长较弱；0.1%～0.4%时，菌株YF的OD600 nm值显著升高（P＜0.05），生长得到改善；当猪胆盐质量分数为0.4%时，OD600 nm值达到最高，为1.035 5±0.001 1；猪胆盐质量分数为0.4%～0.5%时，OD600 nm值下降。由图10B可知，牛胆盐质量分数为0.1%～0.5%，菌株YF的OD600 nm值均较低，生长被抑制，可能原因之一是2种胆盐的性质存在一定差异，对菌株细胞膜的通透性有一定的影响[28]。 李哲远等[29]对罗伊斯粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）AR673进行了胆盐耐受性测试，结果表明在0.2%～0.3%范围内，提高胆盐浓度有利于AR673生物量积累。这与本研究实验结果一致。以上结果表明菌株YF的生长对不同来源的胆盐适应性具有明显差异，但可在胆盐存在的情况下生长，有助于其适应胃肠道胆盐环境。
图10 筛选菌株的胆盐耐受性
Fig.10 Bile salt tolerance of strain YF
3 结 论
本研究通过稀释涂布及三区划线的方法从13种不同花粉中分离筛选出1株产胞外多糖的乳酸菌YF，经鉴定其为昆氏乳杆菌（Apilactobacillus kunkeei），革兰氏阳性菌，形态呈杆状或短棒状，无鞭毛。菌株YF胞外多糖产量为（5.213 5±0.034 5）g/L，具有较强的酸、尿素及猪胆盐耐受性，对高质量分数NaCl和牛胆盐的耐受能力较弱。综上，本研究成功从花粉中分离筛选出具备产胞外多糖能力的乳酸菌，扩充了益生菌资源库的范畴，为天然功能性生物制品的开发提供了更多选择。未来，研究可深入聚焦于菌株YF胞外多糖产量的优化以及合成机制等，为胞外多糖规模化生产奠定基础。
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