白酒大曲以小麦、大麦等谷物为主要原料、经高温发酵制备而成[1]，是白酒酿造所需的糖化发酵剂和增香剂，其通过发酵实现微生物的演替和各种酶类的有效积累，是影响白酒品质的重要因素[2-3]。酱香型高温大曲的生产依靠传统工艺，依赖于自然的发酵环境和各种微生物的富集，并产生以糖化酶为主的丰富酶类和各类微生物代谢物，这些代谢产物是酱香风味的重要来源[4-6]。Gan Shuheng等[7]通过成熟高温大曲的宏基因组数据揭示，超过50%的基因在NCBI非冗余蛋白数据库中未能获得注释，这提示存在大量传统技术研究所遗漏的未培养或低丰度微生物；其中，芽孢链菌属（Desmospora）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）为优势细菌属，曲霉菌属（Aspergillus）、罗萨氏菌属（Rasamsonia）和丝衣霉属（Byssochlamys）为优势真菌属。大曲生产工艺复杂，制曲原料和开放的环境为大曲微生物提供了丰富的来源。Du Hai等[8]研究发现，小麦原料是大曲细菌微生物的主要来源，而真菌微生物大多来源于制曲环境。
稻草是酱香型大曲生产重要辅料，由于其良好的保温性能，常作为曲块保温材料在培菌过程中包裹曲块，起到隔离曲块，防止粘连、保温、保湿、透气的作用[9]。稻草携带丰富的微生物，对大曲微生物群落具有一定影响。首次投入使用的新稻草中的微生物可以丰富大曲培菌初期微生物的种类，使用过的老稻草因附着酿酒微生物，还可作为下一轮制曲的辅料重复使用，起到接菌的作用[10-11]。张原頔等[12]通过高通量测序研究稻草中的微生物群落发现，细菌主要包括泛菌属（Pantoea）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和芽孢杆菌属（Bacillus），真菌主要包括四折叠球菌属（Quadrisphaera）、微杆菌属（Microbacterium）、曲霉属（Aspergillus）、孢堆黑粉菌属（Sporisorium）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、变形闭囊鞘属（Chromocleista）和节担菌属（Wallemia）。
为进一步探究稻草真菌菌群的种类及功能特性，本研究以酱香型白酒大曲的覆曲稻草为研究对象，采用传统培养分离方法对覆曲稻草表面的真菌进行分离纯化，通过分子生物学技术对其种属进行鉴定，并对其环境耐受性、产酶活性以及挥发性代谢产物进行解析，为优化酿酒工艺、提高产品质量奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
覆曲稻草取自贵州仁怀茅台镇某酒厂。
月桂酸钠、羧甲基纤维素钠（均为化学纯），葡萄糖、氯化钠、氯化钾 、磷酸氢二钾、七水合硫酸亚铁、可溶性淀粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（均为分析纯），琼脂粉（生化试剂）、刚果红（纯度为80%） 上海沪试实验室器材股份有限公司；糊精、单宁酸（均为分析纯），酵母浸粉、牛肉浸膏、酸水解酪蛋白（均为生化试剂） 天津市众联化学试剂有限公司；蛋白胨（生化试剂） 南京全隆生物技术有限公司；三丁酸甘油酯（纯度≥95%） 合肥博美生物科技有限责任公司；2×Taq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix（含染料） 北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为分析纯或生化试剂。
孟加拉红培养基 广东环凯微生物科技有限公司；PDA培养基 北京陆桥技术股份有限公司；葡萄糖发酵培养基[13]：七水合硫酸镁0.2 g/L、葡萄糖5 g/L、七水磷酸氢二钠1 g/L、氯化钠5 g/L、磷酸氢二钾1 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
DSX-18L-1手提式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD超净工作台 上海乔跃电子科技有限公司；3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；DH124D恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司 ；GelDoc-XR+凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；7890B-5977A气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 覆曲稻草表面真菌分离纯化
取10 g覆曲稻草样品加入盛有90 mL无菌生理盐水（1 mol/L NaCl）的三角瓶中，于室温下120 r/min振荡2 h，使附着在稻草表面的微生物充分分散于生理盐水中，制成菌悬液母液。吸取1 mL菌悬液加入9 mL无菌水中，制成10－1稀释液；同样的方法，制备10－2、10－3稀释液。分别从母液、10－1、10－2、10－3稀释液中吸取100 μL涂布至孟加拉红培养基上，倒置于30 ℃培养箱中培养2～3 d。挑取单菌落接种到新的孟加拉红平板上，进行纯化。
1.3.2 分子生物学鉴定
使用改良月桂酸钠法[14]提取菌株的基因组DNA，以其为模板，使用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）扩增菌株的ITS基因序列。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环； 72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果提交到NCBI的GenBank数据库中，采用BLAST进行比对搜索，下载与菌株ITS基因序列同源性较高的模式菌株的ITS基因序列，使用MEGA 7.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定菌株种属[15-16]。
1.3.3 环境耐受性分析
温度耐受性：将分离菌株接种至PDA培养基上，分别置于30、40、50、60 ℃条件下培养3～5 d，观察菌株的生长情况。
乳酸耐受性：将分离菌株接种至乳酸质量浓度分别为20、40、60、80、100 g/L的PDA培养基上，置于30 ℃条件下培养3～5 d，观察菌株的生长情况。
pH值耐受性分析：将分离菌株接种至pH值分别为5、6、7的YPD培养基上，30 ℃条件下培养3～5 d，观察菌株生长情况。
乙醇耐受性：将分离菌株接种至乙醇体积分数分别为2%、4%、6%、8%的PDA培养基中，30 ℃条件下培养3～5 d，观察菌株的生长情况。
1.3.4 酶活性测定
参照王新叶等[17]的方法对菌株的纤维素酶、糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、蛋白酶、酯化酶和单宁酶活性进行测定。
1.3.5 挥发性代谢成分解析
使用无菌水配制菌株的孢子悬液，将孢子悬液菌体浓度稀释至109个/mL，按1%的接种量接种至葡萄糖发酵培养基中，于30 ℃、150 r/min条件下培养48 h后， 8 000 r/min离心10 min，去除菌体。在上清液中加入等量的乙酸乙酯进行萃取，混合均匀后，静置分层，获得有机相，使用旋转蒸发仪对有机相进行浓缩，参照赵腾飞等[18]的方法使用GC-MS法对有机相中的物质进行检测。
1.4 数据分析
采用Excel 2019完成实验数据整理与预处理，借助 R平台pheatmap包绘制代谢产物相对含量热图。
2 结果与分析
2.1 覆曲稻草表面真菌的分离纯化
从覆曲稻草表面共分离纯化得到8株真菌，分别编号为DC-9、DC-16、DC-21、DC-23、DC-27、DC-28、DC-36、DC-39。基于ITS基因序列构建8株菌的系统发育树，结果见图1。菌株DC-28与Cladosporium xanthochromaticum MEFC077聚于一支，将菌株DC-28鉴定为黄褐枝孢霉（Cladosporium xanthochromaticum）；菌株DC-39与Cladosporium cladosporioides D41B5聚于一支，将菌株DC-39鉴定为枝孢样枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）；菌株DC-27与Saccharomycopsis fibuligera AUMC聚于一支，将菌株DC-27鉴定为扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）；菌株DC-16和DC-36均与Aspergillus spinulosporus NRRL 2395聚于一支，将菌株DC-16和DC-36均鉴定为刺孢曲霉（Aspergillus spinulosporus）；菌株DC-23与Penicillium citrinum NRRL 1841聚于一支，将菌株DC-23鉴定为桔青霉（Penicillium citrinum）；菌株DC-9和DC-21与Paecilomyces variotii CBS 101075 聚于一支，将菌株DC-9和DC-21均鉴定为多变拟青霉（Paecilomyces variotii）。这8株菌属于5个属，分别为枝孢属（Cladosporium）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和拟青霉属（Paecilomyces）。曹丹等[19]研究发现，曲霉属和复膜孢酵母属是大曲中属水平上的优势微生物。
图1 基于ITS基因序列构建的8株分离菌株系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree of eight isolated strains based on ITS gene sequences
2.2 分离菌株的环境耐受性分析
为了探究菌株对培养逆境条件因子的适应性，对 8株分离菌株的温度、乳酸、pH值和乙醇耐受能力进行测定。由表1可知，随着培养温度的升高，各菌株的生长能力均逐渐减弱。其中，菌株DC-23、DC-28和DC-39最高可耐受温度30 ℃，菌株DC-9、DC-16、DC-21和DC-27最高可耐受温度40 ℃，而菌株DC-36最高可耐受温度达 50 ℃。随着乳酸质量浓度的升高，各菌株的生长能力均逐渐受到抑制。其中，菌株DC-28最高可耐受乳酸质量浓度10 g/L，菌株DC-23和DC-39最高可耐受乳酸质量浓度15 g/L，菌株DC-16、DC-27和DC-36最高可耐受乳酸质量浓度20 g/L，菌株DC-9和DC-21最高可耐受乳酸质量浓度80 g/L。随着pH值的降低，各菌株的生长能力均逐渐减弱。8株菌株在pH 7的培养基中长势最好，在pH 5的培养基中也能生长，但长势较弱，说明各菌株均可耐受 pH 5。随着乙醇体积分数的升高，各菌株的生长能力均逐渐受到抑制。其中，菌株DC-39最高可耐受乙醇体积分数4%，菌株DC-9、DC-23、DC-28和DC-36最高可耐受乙醇体积分数6%，菌株DC-16、DC-21和DC-27最高可耐受乙醇体积分数8%。综上，菌株DC-21对温度、乳酸、 pH值和乙醇的综合耐受性较好，可耐受温度40 ℃、乳酸质量浓度80 g/L、pH 5、乙醇体积分数8%。
表1 8株分离菌株的环境耐受能力分析结果
Table1 Environmental tolerance analysis results of eight isolated strains
环境因素DC-9DC-16DC-21DC-23DC-27DC-28DC-36DC-3930＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋40＋＋＋－＋－＋＋－温度/℃50－－－－－－＋－60－－－－－－－－10＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+＋＋＋＋＋15＋＋＋＋＋＋＋＋+＋＋－＋＋＋20＋＋＋＋＋－＋－＋－乳酸质量浓度/ 40＋＋－＋＋－－－－－（g/L）60＋－＋－－－－－80＋－＋－－－－－100－－－－－－－－5＋＋＋＋＋+++pH6＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋7＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋乙醇4＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋体积分数/%6＋＋＋＋＋＋＋＋＋－8－＋＋－＋－－－
注：＋.生长，数量越多生长越好；－.不生长。
2.3 分离菌株的产酶能力分析
由表2可知，在检测的7种酶中，这8株菌能够产生4种酶，分别为纤维素酶、糖化酶、α-淀粉酶和单宁酶，纤维素酶、糖化酶和α-淀粉酶属于糖苷水解酶类，能够把原料中的纤维素、淀粉转化成可发酵糖[20]，单宁酶能够降解植物组织的单宁生成丁香酸、丁香醛、4-乙基愈创木酚等香味物质[21]。菌株DC-28和DC-39产纤维素酶，菌株DC-16和DC-27产糖化酶，菌株DC-9、DC-36和DC-39产α-淀粉酶，菌株DC-28产单宁酶。综上，菌株DC-28和DC-39产酶能力较好，均能产生2种酶。
表2 8株分离菌株产酶能力测定结果
Table2 Determination results of enzyme-producing capacity of eight isolated strains
DC-9－－－＋－－－DC-16－＋－－－－－菌株编号纤维素酶糖化酶果胶酶α-淀粉酶蛋白酶酯化酶单宁酶DC-21－－－－－－－DC-23－－－－－－－DC-27－＋－－－－－DC-28＋－－－－－＋DC-36－－－＋－－－DC-39＋－－＋－－－
注：＋.产酶；－.不产酶。
2.4 分离菌株挥发性代谢产物解析
由图2可知，从8株菌株的发酵液中共检出22种挥发性代谢产物，包括1种醇类（2-丁氧基乙醇）、1种酮类（环己酮）、2种醛类（乙醛、甲基醛）、10种酯类（乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸仲丁酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、1-甲氧基-2-丙基乙酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯）和8种其他物质。在这8株菌株中，菌株DC-27和DC-28的挥发性代谢产物最多，各有18种；菌株DC-9、DC-36和DC-39的挥发性代谢产物较少，各有14种。此外，所有菌株都能够代谢产生甲基醛、乙酸正丙酯、乙酸仲丁酯、乙酸丁酯、环己酮、2-丁氧基乙醇、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯和己二酸二甲酯共9种物质。其中，戊二酸二甲酯在所有菌株中含量最高。醛类和酯类对白酒风味具有非常重要的贡献作用[22-24]，其中乙醛是白酒的主要醛类物质，味甜带涩，含量过高可能造成酒体刺鼻、口感辛辣[25]；乙酸丁酯和乙酸异丁酯具有梨香[26]；丙酸乙酯是酱香型高温大曲的特征风味物质[27]。
图2 8株分离菌株发酵液中挥发性代谢产物相对含量热图
Fig.2 Heatmap of relative contents of volatile metabolites in fermentation broths of eight isolated strains
3 结 论
本研究从覆曲稻草表面共分离鉴定得到8株真菌，分别属于5个属和6个种，包括多变拟青霉（Paecilomyces variotii）DC-9、DC-21，刺孢曲霉（Aspergillus spinulosporus）DC-16、DC-36，桔青霉（Penicillium citrinum）DC-23，扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）DC-27，黄褐枝孢霉（Cladosporium xanthochromaticum）DC-28及枝孢样枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）DC-39。其中，菌株DC-21的环境耐受性较好，可耐受温度40 ℃、乳酸质量浓度80 g/L、pH 5、乙醇体积分数8%；菌株DC-28和DC-39产酶能力较好，均能产生2种酶；从8株菌株的发酵液中共检出22种挥发性代谢产物，其中菌株DC-27和DC-28的挥发性代谢产物最多，均有18种。本研究分离得到的这些菌株对酿酒微环境具有一定的耐受性，具有特定的产酶能力，代谢过程中能产生白酒重要风味物质，为优化大曲微生态及强化发酵提供菌种资源，同时也为这些功能菌株进一步在白酒发酵等工业中的应用提供了理论依据。
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