从江煨酒酒曲微生物群落结构和功能特性

煨酒是贵州省黔东南苗族侗族自治州从江县壮族村寨的传统特色酒品，以香禾糯米、山泉水及祖制酒曲为原料，经蒸饭、摊晾、发酵、煨制等古法工序酿制而成，酒液呈深褐色且口感绵柔香甜，具有越陈越香的特性。其核心工序包含5个阶段：原料处理、摊晾拌曲、发酵取液、煨制处理、封存熟成。作为黔东南州非物质文化遗产项目，其酿造技艺融合壮族传统饮食文化，在婚丧嫁娶、节庆祭祀等场合具有重要文化功能。但其工艺传承长期局限于经验范式，核心发酵载体—酒曲的微生物组学特征尚未被系统阐明，成为制约传统工艺现代化转型与文化价值转化的关键瓶颈。

近年来，随着微生物组学技术的快速发展，宏基因组测序在揭示传统发酵食品中微生物群落的多样性、功能特征及其与风味形成的关联研究中发挥着重要的作用。酒曲作为酒酿造的核心，其微生物群落的结构、代谢网络与风味物质的合成途径，是决定酒品质与独特性的关键因素。目前，对各种类型的酒曲微生物的组成研究已经较为丰富。如利用高通量测序技术，李仍树等[1]分析了4种芝麻香型酒曲的理化特性、微生物群落及功能，揭示了酒曲微生物对白酒独特风味的不同作用。陈申习等[2]分析了清香型酒曲及酱香型酒曲的真菌群落结构和多样性差异，表明真菌的种类对酒曲的风味有重要的影响，为提升酒曲风味提供了真菌资源方面的参考。谢玲等[3]同样采用高通量测序技术对贵州特色米酒酒曲微生物群落多样性进行分析，结果表明，拟杆菌门（Bacteroidota）、哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）、乳杆菌属（Lactobacillus）和伊萨酵母属（Issatchenkia）是引起黔南州和黔东南州米酒曲样品细菌和真菌类群差异最主要的菌群。煨酒作为贵州特色酒品，鲜有对其酒曲微生物的组成研究，酒曲微生物群落组成、微生物功能及其与酿造环境的互作机制亟待阐明。本研究以从江煨酒传统酒曲为对象，采用宏基因组测序技术结合生物信息学分析，旨在解析其微生物群落结构、群落功能特征，为后续科学阐释煨酒酿造机理、优化工艺参数及提高煨酒酒曲与煨酒产品质量提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3份从江煨酒酒曲采集自贵州从江西部壮族煨窖制酒有限责任公司，充分磨碎、混匀为一个样品，于－20 ℃冰箱保存，JQ1、JQ2和JQ3为其3个生物学重复。

Taq DNA聚合酶（5 U/μL）美国Thermo Fisher Scientific公司；SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司；Rapid Plus Illumina平台DNA文库制备试剂盒（RK20208）武汉爱博泰克生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Covaris超声波破碎仪美国Covaris公司；Qubit 2.0荧光计美国Thermo Fisher Scientific公司；5400片段分析仪美国Agilent公司；NovaSeq X Plus Series PE150 美国Illumina公司。

1.3 方法

采用十六烷基三甲基溴化铵法提取酒曲样品中微生物的总基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计检测DNA的纯度和完整性，并采用荧光计对DNA浓度进行精确定量。

1.3.2 文库构建及质检

取1 μg煨酒酒曲基因组DNA，用超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段后进行文库的构建，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，检测文库片段的完整性及插入片段大小，符合预期后，使用实时荧光定量PCR对文库有效浓度（＞3 nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。文库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量需求pooling后进行PE150测序。

1.4 数据处理

对原始数据进行过滤处理得到有效数据，再进行组装得到个体组装与混合组装基因片段（Scaftigs）。基于组装后的Scaftigs进行基因预测与去冗余，构建基因目录，从而进行相应的基因目录在各样品中的丰度信息计算。对数据进行宏基因组装、物种注释及丰度分析。从基因目录出发，基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active enZYmes，CAZy）数据库对酒曲微生物参与的代谢途径和酒曲中的核心碳水化合物酶类进行分析。

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果分析

2.1.1 数据处理及组装

对原始数据进行预处理，使用MEGAHIT组装软件（http://www.metagenomics.wiki/tools/assembly/megahit）进行组装分析。由表1、2可知，从酒曲样品中一共得到的有效测序量及Scaftigs数量分别为7 G、124 336条。

2.1.2 酒曲样本中微生物菌群多样性分析

微生物群落物种多样性通常使用α-多样性指数表示。Shannon指数、ACE指数、Chaol指数、Simpson指数是评价微生物群落物种丰富度与均匀度的常用综合指标。其中，Shannon指数越大，则表示群落中物种的多样性越高，而Simpson指数与Shannon指数意义相反，其值越大说明群落多样性越低；Chaol指数或ACE指数越大则表明群落物种丰富度越高[4]。由表3可知，煨酒酒曲样品中微生物的Shannon指数为3.08，ACE指数为1 672.83，Chao1指数为1 690.32，Simpson指数为0.68，表明群落中存在一定程度的优势种，多样性保持较高水平。由覆盖率的数值可知实验的取样是否合理，一般认为覆盖率不小于97%时，取样合理。由表3可知，覆盖率分别达到99.99%，均高于97%，说明本次取样合理。

2.1.3 基因预测及丰度分析

由图1可知，酒曲样本中各个基因的长度分布状态较为均匀，整体呈现平缓而连续的分布形态，无明显尖峰或断层；低长度区域和高长度区域均有数据点，不同长度的基因数量分布相对均衡，未出现某些长度基因严重缺失或过度富集，表明测序过程中基因片段提取与拼接效果良好，文库构建完整，能够较为全面和准确地反映出酒曲样本中所含微生物的基因组组成和结构特征。同时，基因长度分布的宽度较大且分布均匀，进一步提示该样本中微生物的种类较为丰富，基因多样性水平较高，可以满足后续微生物组成与功能分析。

2.2 酒曲中微生物菌群组成分析

2.2.1 门水平菌落结构

由图2可知，基于门水平从江煨酒酒曲丰度排名前10的微生物分别为广古菌门（Euryarchaeota）、弯曲菌门（Campylobacterota）、壶菌门（Chytridiomycota）、放线菌门（Actinomycetota）、担子菌门（Basidiomycota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、子囊菌门（Ascomycota）、假单胞杆菌门（Pseudomonadota）、芽孢杆菌门（Bacillota）及接合菌门（Mucoromycota）。其中按丰度由高到低排序为Mucoromycota＞Ascomycota＞Bacillota＞ Pseudomonadota。Mucoromycota是传统酒曲中一类重要的丝状真菌，尤其在中国白酒曲、日本米曲中占据关键地位，其主要包括根霉属、毛霉属、犁头霉属等，通过分泌高效的糖化酶和代谢活性物质，主导酒曲的糖化过程并影响发酵风味[5]。Ascomycota是酒曲微生物群落的核心成员之一，主要包括酵母属、曲霉属、青霉属等，广泛参与糖化、发酵及风味形成过程[6-7]。Ascomycota在酒曲中的丰度较高，与原料（如小麦、大米）及制曲工艺密切相关[8]。从江煨酒酒曲的原料中含有米粉、米糠等，推测煨酒酒曲中检测到的Ascomycota可能来源于原料中。Bacillota是一类革兰氏阳性菌，广泛分布于自然环境和发酵系统中。在传统酒曲中，芽孢杆菌门的成员虽非主导菌群，但研究发现其在复杂碳水化合物的降解、代谢物合成及微生物互作中可能发挥独特作用[9]。 Pseudomonadota是酒曲微生物群落中的一部分，在酒曲中的丰度通常低于5%，宁亚丽等[10]通过高通量测序发现，其在以杂粮为原料或混合原料的酒曲中更易检出。在酒曲中检测到少量的Pseudomonadota的原因可能是从江煨酒酒曲混合了多种原料如辣蓼草、茯苓、甘草、米粉、米糠。因此，在今后的工艺优化上，可以通过高温制曲、乳酸菌接种或原料灭菌抑制假单胞菌生长，从而减少酒曲腐败或酒体异味。

2.2.2 属水平菌落结构

由图3可知，基于属水平从江煨酒酒曲丰度排名前10的微生物分别为毛霉属（Mucor）、不动杆菌属（Acinetobacter）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、曲霉属（Aspergillus）、毕赤氏酵母属（Hyphopichia）、酵母属（Saccharomyces）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）及根霉属（Rhizopus）。其中，优势菌属为Rhizopus、Aspergillus、Saccharomycopsis及Mucor。按照丰度占比由高到低排序为：Rhizopus＞Aspergillus＞Saccharomycopsis＞Mucor。Rhizopus是从江煨酒酒曲微生物群落的核心成员之一，属于Mucoromycota，这与门水平上的结果一致。Rhizopus以其高效的糖化能力和独特代谢活性在传统酒曲发酵中占据重要地位[11-12]。研究表明，Rhizopus菌株能分泌α-淀粉酶和糖化酶，将淀粉高效降解为葡萄糖，糖化效率可达80%以上[13]。另外，Rhizopus菌株产生的脂肪酶催化酯类合成，直接贡献酒体香气[14]。Aspergillus在传统酒曲中较为常见，分泌α-淀粉酶、糖化酶等，将淀粉高效降解为葡萄糖[15]，代谢物中的氨基酸生成高级醇，能增强酒体风味层次[16]。张二豪[17]、侯强川[18]等的研究表明，Saccharomycopsis作为一种天然发酵剂，可在发酵时通过糖类产生二氧化碳和乙醇，增加发酵食品中香气物质的含量，改善发酵的品质与风味；Mucor可分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶及酯化酶。李绍亮等[19]从宋河大曲中分离的毛霉菌株产纤维素酶活力达11.87 U/mL，酯化酶活力达16.03 U/mL。总状毛霉（Mucor racemosus）代谢产生3-羟基丁酮，作为吡嗪类香气物质的前体，间接影响白酒风味[20]。根据以上结果推测煨酒酒曲中的4种优势菌属对从江煨酒的特殊风味具有贡献。

2.2.3 种水平菌落结构

由图4可知，基于种水平从江煨酒酒曲丰度排名前10的微生物分别为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、克拉通复膜孢酵母（Saccharomycopsis crataegensis）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、戴尔根霉（Rhizopus delemar）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、棉子糖乳球菌（Lactococcus raffinolactis）、伯顿丝孢毕赤酵母（Hyphopichia burtonii）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）。其中，优势种为R. arrhizus、R. delemar、R. microsporus及S. crataegensis。研究表明，R. arrhizus是黄酒酒药中的优势霉菌，其产酶特性与代谢活性对黄酒的糖化效率和风味形成至关重要[21]。 R. microsporus是浓香型、清香型白酒曲中的优势霉菌，参与糖化与风味物质合成。其可分泌β-葡聚糖酶、淀粉酶、糖化酶等，高效分解谷物原料中的大分子物质，为发酵提供可发酵糖[22-23]。而对S. crataegensis的研究主要集中在葡萄酒酿造中，研究发现，S. crataegensis YC30作为发酵剂核心菌株，可显著提升葡萄酒的香气多样性，尤其在威代尔冰酒中，其对花香味和果香味的贡献突出[24]。煨酒酒曲种水平上的优势菌以根霉菌为主，这与其他酒曲中的研究结果一致。在种水平上，超过50%的菌未描述到种，推测可能的原因是煨酒是贵州省从江县壮族村寨的特有酒类，其酒曲微生物群落具有鲜明的地域特异性，相关菌株的序列数据在数据库中缺失或极少，导致测序结果无法找到匹配的种级参考序列。

2.3 酒曲微生物功能预测分析

2.3.1 从江煨酒酒曲微生物的KEGG分析

根据煨酒酒曲样品微生物的Unigene在KEGG数据库的注释结果，绘制相对丰度前10的相对丰度统计图。由图5可知，酒曲中微生物主要参与各种代谢途径，如碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、能量代谢等，表明酒曲微生物在能量代谢和物质转化中高度活跃，这可能与酿酒过程中糖类分解、乙醇生成等关键生化反应相关[25]。富集到碳水化合物代谢、氨基酸代谢的微生物可能为后期酿酒过程中糖酵解和氨基酸转化为风味物质（如酯类、醇类）提供核心功能[26]。参与环境适应及膜转运的微生物也较多。值得注意的是，有大量的微生物功能无法明确，推测可能的原因是煨酒酒曲作为黔东南苗族侗族自治州从江县壮族村寨传统特色发酵体系，其微生物群落具有鲜明的地域和工艺特异性，很多菌株是该体系特有的，其基因序列与KEGG数据库中已知参考序列的匹配度低，在KEGG数据库中无法匹配到具体代谢途径因而被归属为“其他”。由排名前10的酒曲微生物的Unigene KEGG注释分析推测煨酒酒曲具备高效的碳水化合物代谢和环境适应性。

2.3.2 从江煨酒酒曲微生物的CAZy分析

在基于KEGG数据库对酒曲微生物参与的代谢途径解析的基础上，进一步基于CAZy数据库注释揭示从江煨酒酒曲中的核心碳水化合物酶类。由表4可知，从江煨酒酒曲样品的核心碳水化合物酶类为GH28（糖苷水解酶）、GH13（α-淀粉酶）、GH18（几丁质酶）及GT2/GT4（糖基转移酶）。

3 结论

从江煨酒作为传统发酵工艺的代表，其独特风味和品质依赖于酒曲中复杂的微生物群落及其功能。本研究利用宏基因组测序技术对从江煨酒酒曲的微生物菌群多样性进行分析及功能预测。发现酒曲样品中的优势门为接合菌门（Mucoromycota）、子囊菌门（Ascomycota）、芽孢杆菌门（Bacillota）及假单孢杆菌门（Pseudomonadota）。优势属为根霉属（Rhizopus）、曲霉属（Aspergillus）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）及毛霉属（Mucor）。优势种为少根根霉（Rhizopus arrhizus）、戴尔根霉（Rhizopus delemar）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）及克拉通复膜孢酵母（Saccharomycopsis crataegensis）。基于KEGG数据库对酒曲微生物可能参与的代谢途径、核心酶类及其功能进行预测分析，发现酒曲中的微生物主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、能量代谢等。进一步基于及CAZy数据库对碳水化合物酶类分析，发现从江煨酒酒曲的核心碳水化合物酶为糖苷水解酶、α-淀粉酶、几丁质酶及糖基转移酶。本研究结果对后续深入探究煨酒制曲及风味工艺奠定良好的基础。

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