在当代经济快速发展的社会背景下，人们面临着巨大的生活压力，这一状况加剧了乙醇过度饮用，进而造成肝脏损伤，加重肝脏代谢负担[1]。世界卫生组织的评估报告指出，全球每年由过量饮酒导致的死亡人数有300万以上，并有5%以上的人因摄入过量乙醇患病[2]。当前酒精性肝损伤的临床干预主要依赖戒酒行为干预及护肝药物，但二者均存在一定局限性，通过戒酒避免酒精性肝损伤的发生难度较大且成功率较低；而以药物预防酒精性肝损伤会呈现一定的副反应甚至毒副作用，因此寻找和开发具有改善急性酒精性肝损伤的产品具有重要意义。
灵芝（Ganoderma lucidum）为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，其含三萜类、甾体化合物、生物碱、多糖以及氨基酸等多种生物活性成分[2]，具有肝脏保护、抗炎、免疫系统调节及抗肿瘤等药理活性[3-5]。除此之外，灵芝具备缓解急性肝损伤的功效，尤其在乙醇、对乙酰氨基酚、四氯化碳造成的肝损伤方面具有改善作用[6-9]，但灵芝酒对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究还鲜见报道。
网络药理学作为一门交叉学科，融合了系统生物学、计算生物学以及实验验证生物学的研究方法，其核心在于揭示中药药效成分的科学基础，阐明中药药效物质基础[10]。网络药理学在中药成分功效研究、机制研究探索、药物安全性评估、药物再利用以及药物/药物组合设计及预测领域至关重要[11]，不仅为传统中药研究提供新思路与方法，有助于阐释其药效物质基础与作用机制，也可为药效及安全性评价提供理论支撑[12]。因此，本研究基于灵芝提取物具有可改善小鼠酒精性肝损伤的作用，将灵芝提取物应用于乙醇饮料验证其是否具备缓解小鼠酒精性肝损伤的作用，为灵芝应用于乙醇饮料行业提供学术参考，同时结合网络药理学预测灵芝中与急性肝损伤相关的成分及潜在分子机制，为后续研究开展提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱香型白酒（乙醇体积分数53%） 贵州贵酱令酱香型白酒生产公司；灵芝 贵州黔芝灵药业有限公司。
丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司；水飞蓟宾胶囊 天津天士力圣特制药有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
60只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级健康雄性C57BL/6小鼠，质量合格证号No.110324241106187637，体质量为18～22 g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，生产许可证号SCXK（京）2024-0001，动物饲养条件为温度（22±2）℃；相对湿度（55±5）%；每天光照12 h；自由进食和饮水。
1.2 仪器与设备
DK-98-II电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；VICTOR Nivo酶标仪 珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司；JA2003电子天平 上海菁海仪器有限公司；SWE-FP研磨仪 武汉塞维尔生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 灵芝酒的配制
将灵芝粉碎后按照料液比1∶10（g/mL）采用90%乙醇回流提取3次，每次3 h，得到的提取液进行浓缩干燥后得到灵芝浸提物。称取灵芝浸提物，采用酱香型白酒（乙醇体积分数53%）作为溶剂配制成灵芝浸提物质量浓度分别为0.1、0.2、0.4 mg/mL的灵芝酒。
1.3.2 灵芝酒对急性酒精肝损伤小鼠的缓解作用
1.3.2.1 实验动物分组及给药
60只SPF级健康雄性C57BL/6小鼠适应性喂养1周后，分为空白组、模型组、阳性组及灵芝酒低、中、高剂量组，每组10只，持续灌胃7 d。各组小鼠给药剂量见表1。
表1 实验小鼠分组及给药剂量
Table1 Grouping and dosage of experimental mice
分组数量/只药物灌胃剂量空白组10生理盐水10 mL/kg模型组10酱香型白酒＋生理盐水10 mL/kg阳性组10酱香型白酒＋酱香型白酒10 mL/kg，水飞蓟水飞蓟宾宾溶液（3 mg/mL）10 mL/kg灵芝酒低剂量组10生理盐水＋生理盐水10 mL/kg，灵芝酒0.1 mg/mL灵芝酒10 mL/kg灵芝酒中剂量组10生理盐水＋生理盐水10 mL/kg，灵芝酒0.2 mg/mL灵芝酒10 mL/kg灵芝酒高剂量组10生理盐水＋生理盐水10 mL/kg，灵芝酒0.4 mg/mL灵芝酒10 mL/kg
1.3.2.2 体质量测定
持续灌胃7 d后称量小鼠的体质量。
1.3.2.3 血清生化指标测定
在最后一次灌胃给药之后，实验组小鼠经过12 h的禁食处理（不禁水），通过眼球摘除法采集血液样本。随后，将血液样本静置以便血清充分分离，并在4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min。取上清液，依照试剂盒的说明书测定AST和ALT的活力。
1.3.2.4 肝脏指数测定
取血结束后，采用颈椎脱臼法将小鼠处死后立即解剖，将肝脏完整取出称质量，记录肝脏质量，按下式计算各组肝脏指数：
1.3.2.5 肝组织MDA含量测定
采取小鼠肝组织样本，依照1∶9（g/mL）的质量体积比，将样本与预冷的生理盐水混合，随后置入匀浆机进行充分研磨。匀浆完成后，于4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min。取上清液，依照试剂盒的说明书测定MDA含量。
1.3.2.6 肝脏组织病理学考察
取各组小鼠肝脏组织的同一部位，用生理盐水将表面多余的血渍洗去，滤纸擦干水分，置于4%（V/V）多聚甲醛组织固定液中固定24 h以上，经洗涤脱水、石蜡包埋、苏木精-伊红染色后制成切片，置于光学显微镜下观察肝组织的病理形态学变化，拍照记录。
1.3.3 网络药理学分析
1.3.3.1 灵芝潜在活性成分及作用靶点的收集及筛选
运用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），依据药物的吸收、分布、代谢和排泄等药代动力学特性，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及药物相似性（druglikeness，DL）≥0.18为筛选标准，对灵芝中的潜在活性成分进行筛选。通过PubChem数据库检索，获取这些潜在活性成分的分子结构及Smiles编号。进一步将Smiles编号输入SwissTargetPrediction数据库，经整合与去重处理，确定灵芝中潜在活性成分的作用靶点。
1.3.3.2 急性肝损伤相关靶点的筛选
以“Acute Liver Injury”为关键检索词，在GeneCards 数据库和在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库中检索并筛选已知急性肝损伤疾病相关靶点，整合、去重2个数据库的检索结果得到已知的与急性肝损伤相关的疾病靶点。
1.3.3.3 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建
通过对灵芝潜在活性成分的作用靶点与急性肝损伤相关靶点进行交集分析得到共有的靶点。随后，将这些共有靶点输入String数据库，并指定物种为“Homo sapiens”，以获取相应的PPI数据。所得数据进一步导入Cytoscape 3.10.1软件中，以构建PPI网络，并进行可视化处理。
1.3.3.4 灵芝缓解急性肝损伤关键靶点通路与功能富集分析
将灵芝中潜在活性成分和急性肝损伤的共同靶点作为关键靶点，通过DAVID数据库，限定物种为“Homo sapiens”，对关键靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，得到关键靶点富集具显著性的生物学注释。其中，GO分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF），分别以P＜0.05为筛选标准筛选前10个功能和信号通路进行展示。
1.3.3.5 灵芝缓解急性肝损伤潜在活性成分-关键作用靶点-信号通路网络图构建
将灵芝的潜在活性成分、关键靶点、前10条信号通路导入Cytoscape 3.10.1软件构建灵芝缓解急性肝损伤潜在活性成分-关键作用靶点-信号通路网络图。
1.4 数据处理
采用SPSS 26.0软件分析数据并用GraphPad Prism 6.01及Origin 2022软件作图，结合Cytoscape 3.10.1软件完成网络药理学作图，数据结果均以
表示。2组间的均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 灵芝酒对急性酒精性肝损伤小鼠的缓解作用
2.1.1 灵芝酒对小鼠体质量的影响
研究证实长期摄入乙醇会影响人的体质量，导致体质量下降，但成年男性受影响程度小于成年女性[13]，由图1可知，与空白组相比，模型组小鼠体质量极显著下降（P＜0.01），造模成功；与模型组相比，阳性组、灵芝酒各剂量组小鼠的体质量均极显著升高（P＜0.01），说明灵芝酒可以改善小鼠长期摄入乙醇导致的体质量下降。
图1 灵芝酒对小鼠体质量的影响
Fig.1 Effect of G. lucidum Baijiu on the body weight of mice
2.1.2 灵芝酒对小鼠肝脏指数的影响
乙醇的主要代谢过程发生在肝脏组织内，若其代谢作用未能彻底完成，则可能导致体内产生氧化应激反应，进而引发肝细胞的毒性反应及损害[14]，使脏器发生肿大，因此常以肝脏指数作为衡量肝脏肿大及肝脏损伤的指标[15]。由图2可知，与空白组相比，模型组肝脏指数极显著升高14.78%（P＜0.01），表明小鼠连续7 d摄入乙醇导致乙醇代谢受阻，使脂质代谢发生紊乱，对肝脏造成损伤使得肝脏发生肿大。与模型组相比，阳性组，灵芝酒低、中、高剂量组肝脏指数分别极显著降低16.85%、9.19%、12.02%、14.27%（P＜0.01），因此，向酱香型白酒中加入一定量的灵芝提取物可缓解乙醇造成的小鼠肝脏损伤。
图2 灵芝酒对小鼠肝脏指数的影响
Fig.2 Effect of G. lucidum Baijiu on liver indices in mice
2.1.3 灵芝酒对小鼠血清中氨基转移酶活力的影响
乙醇代谢障碍可引发肝脏细胞损害，进而增加细胞膜的渗透性，导致肝细胞浆及线粒体内的ALT、AST释放至血液循环中，引起血清AST、ALT活力上升[16-18]。由图3可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中的AST、ALT活力分别极显著升高131.57%、353.32%（P＜0.01），表明乙醇导致小鼠肝细胞发生损伤，酒精性肝损伤模型建立成功。而与模型组相比，阳性组，灵芝酒低、中、高剂量组小鼠血清中的AST活力分别极显著下降60.54%、31.64%、66.67%、60.54%（P＜0.01），ALT活力分别极显著下降73.85%、60.64%、76.06%、72.45%（P＜0.01），说明灵芝提取物可通过降低乙醇诱导的小鼠体内AST、ALT活力，进而改善肝损伤。
图3 灵芝酒对小鼠血清中AST（A）及ALT（B）活力的影响
Fig.3 Effect of G. lucidum Baijiu on the activities of AST (A) and ALT (B) in mouse serum
2.1.4 灵芝酒对小鼠肝组织中MDA含量的影响
MDA是脂质过氧化产物，是用于评价氧化应激对肝脏损害程度的指标之一[19-21]，乙醇在肝脏中代谢不畅时，氧化损伤产物MDA含量便会升高，诱导细胞损伤，因此，以MDA含量作为评价小鼠肝脏损伤或改善程度的指标。由图4可知，与空白组相比，模型组小鼠肝组织中的MDA含量极显著升高61.87%（P＜0.01），小鼠出现肝细胞损伤，并且发生氧化应激，说明小鼠急性酒精性肝损伤模型建立成功。与模型组相比，阳性组小鼠肝组织中的MDA含量极显著下降30.24%（P＜0.01），灵芝酒低、中、高剂量组极显著下降29.58%、39.79%、29.66%（P＜0.01），说明灵芝酒中灵芝提取物可调节小鼠酒精性肝损伤。综上，灵芝酒可通过降低体内MDA含量改善氧化应激损伤，降低乙醇对肝细胞的损伤。
图4 灵芝酒对小鼠肝脏MDA含量的影响
Fig.4 Effect of G. lucidum Baijiu on the MDA content in the liver of mice
2.1.5 灵芝酒对小鼠肝组织病理变化的影响
肝脏病变的病理组织学评估对于确定肝脏损伤的严重性至关重要，可评估肝脏损害程度[22]。由图5可知，空白组小鼠肝细胞形态完整，排列较为规则，细胞核圆而清晰且无炎性浸润和脂肪病变，无明显空泡；模型组小鼠肝细胞发生肿胀、细胞核固缩，细胞间隙变大，局部细胞出现脂肪变性，细胞质中出现脂滴，空泡化明显；阳性组及灵芝酒各剂量组肝细胞损伤较模型组均有所改善，且并未观察到明显的炎性细胞浸润和空泡现象，能够在一定程度上抑制病变。
图5 灵芝酒对小鼠肝脏组织病理变化的影响
Fig.5 Effect of G. lucidum Baijiu on histopathological changes in the liver of mice
2.2 基于网络药理学分析灵芝酒缓解急性肝损伤作用机制
2.2.1 灵芝中潜在活性成分的筛选
通过TCMSP数据库输入“灵芝”共检索得到242个活性成分，以OB值及DL值为筛选条件共筛选得到符合条件的61个潜在活性成分。
2.2.2 灵芝中潜在活性成分与ALI共有靶点的筛选及PPI网络的构建
利用SwissTargetPrediction数据库预测灵芝中61种潜在活性成分共涉及526个作用靶点。通过GeneCards数据库及OMIM数据库共筛选得到1 125个急性肝损伤相关靶点，将其与灵芝潜在活性成分的作用靶点相映射并绘制Venn图。由图6可知，共获得162个共同靶点，将其作为关键靶点。
图6 灵芝潜在活性成分作用靶点-急性肝损伤相关靶点Venn图
Fig.6 Venn diagram of potential active ingredient targets of G. lucidum and acute liver injury-related targets
将关键靶点导入String数据库进行PPI分析，得到PPI网络图，结果见图7。对其进行拓扑分析得到Betweenness值、Closeness值、Degree值，根据Closeness值＞0.0035、Betweenness值＞130.35、Degree值＞41.21，得到36个核心靶点，结果见图8。其中排名前10的靶点分别是白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、肿瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）、白细胞介素1B（interleukin-1B，IL1B）、成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）、缺氧诱导因子-1A（hypoxia inducible factor-1A，HIF1A）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL2）、胱天蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、JUN，研究发现，IL-6在启动和加速急性肝衰竭中起关键作用[23]，IL-6驱动的反应可能会促进小鼠从稳定的慢性状态转变为进行性肝损伤[24]；此外，在急性组织损伤阶段，失调的TNF-α信号通路不仅会诱导细胞凋亡，还能激活组织内的中性粒细胞与巨噬细胞[25-29]，并通过促炎级联反应的放大效应及对组织修复过程的调控，成为急性损伤后组织修复的主要调节剂，主导相关病理进展[30-32]。经AKT1基因修饰的骨髓间充质干细胞在体外和体内均具备增强免疫调节的功能，因此具备预防和改善肝脏移植抗宿主病和其他免疫相关肝损伤的治疗潜力[33]。除此之外，AKT1[34]、TP53[35]、IL1B[36]、FGFR[37]、HIF1A[38]、BCL2[39]、CASP3[40]、JUN[41]在减轻急性肝损伤中发挥着一定的作用。
图7 关键靶点PPI网络图
Fig.7 Protein-protein interaction network diagram of key targets
图8 核心靶点PPI网络图
Fig.8 Protein-protein interaction network diagram of core targets
2.2.3 关键靶点的GO功能和KEGG信号通路富集分析
将162个关键靶点导入DAVID数据库进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，以P＜0.05为筛选条件分别得到排名前10的CC、BP、MF及KEGG信号通路进行分析，结果见图9。由图9A可知，BP主要涉RNA聚合酶II对转录的正调控、信号转导、染色质重塑、凋亡过程的负调控等过程；CC主要涉及细胞质、胞质溶胶、胞质/细胞膜、细胞核、核质等；MF主要涉及蛋白质结合、ATP结合、金属离子结合、蛋白激酶活性、锌离子结合、酶结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。由9B可知，灵芝缓解急性肝损伤的机制通路主要涉及癌症通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、脂质和动脉粥样硬化、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路、Ras信号通路等。 Wu Kejia等[42]通过代谢组学分析得到盐酸益母草碱对急性酒精性肝损伤保护作用的主要机制可能归因于参与脂质代谢的PI3K-/AKT通路；Yang Tianyuan 等[43]通过药理学及体内实验证实，雷公藤红素抑制MAPK和PI3K/AKT相关信号通路，减少炎症反应、细胞凋亡和氧化应激，以保护脂多糖诱导的急性肝损伤。 Wang Haojie等[44]总结了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的3个上游通路：PI3K/AKT信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，探讨其在肝纤维化、乙型肝炎、非酒精性脂肪肝、肝癌、肝缺血再灌注中的作用和其他肝脏疾病通过mTOR介导的自噬调节，证实上述通路在急性肝损伤中发挥着重要作用，为调节肝损伤提供了指导。
图9 灵芝酒缓解急性肝损伤关键靶点GO功能富集（A）及KEGG信号通路富集（B）分析结果
Fig.9 Analysis of Gene Ontolog functional enrichment (A) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment (B) of key targets for G. lucidum Baijiu against acute liver injury
2.2.4 灵芝缓解急性肝损伤潜在活性成分-关键靶点-信号通路网络图的构建
将灵芝61个潜在活性成分、162个关键靶点、10条信号通路导入Cytoscape 3.10.1软件，构建灵芝缓解急性肝损伤潜在活性成分-关键作用靶点-信号通路网络图，结果见图10。进一步对其进行拓扑分析，以Degree值＞30为筛选指标得到灵芝中与急性肝损伤疾病相关的13个关键活性成分，结果见表2。13个关键活性成分均为三萜及甾醇，说明灵芝可通过灵芝三萜改善急性肝损伤。
图10 灵芝缓解急性肝损伤潜在活性成分-关键靶点-信号通路网络图
Fig.10 Network diagram of G. lucidum-potential active components for acute liver injury-key targets-pathways
表2 灵芝中与急性肝损伤疾病相关的关键活性成分
Table2 Key active components in G. lucidum associated with acute liver injury disorders
成分分子式Degree值分子质量/（g/mol）灵芝甲酯QC28 H42 O647474.6赤灵芝酸A甲酯C30H44O644500.7环氧灵芝醇AC30H48O444472.7啤酒甾醇C28H46O336430.75α-羊毛甾-7,9(11),24-三烯-15α,26-二羟基-3-酮C 30 H 46 O 336454.7灵芝醛 AC30H46O336454.7赤芝醛CC30 H46 O335454.7甲基灵芝酸FC28H38O634470.6环氧灵芝醇BC30H46O334454.7丹芝酸EC30H44O534484.7赤芝酸AC27H38O634458.6灵芝萜酮二醇C 30 H 48 O 332456.7灵芝酸DMC30H44O431468.7
3 结 论
本研究采用不同剂量的灵芝酒灌胃小鼠后，发现与模型组相比，灵芝酒各剂量组小鼠的肝脏指数均有改善，低、中、高剂量组小鼠的MDA含量分别极显著降低29.58%、39.79%、29.66%（P＜0.01）；AST活力分别极显著降低31.64%、66.67%、60.54%（P＜0.01）；ALT活力分别极显著降低60.44%、76.06%、72.45%（P＜0.01）；各剂量组小鼠受损肝脏均得到不同程度改善。通过网络药理学分析发现，灵芝酒可能通过三萜及甾醇调控氧化应激、炎症反应及肝脏代谢，进而发挥肝脏保护作用。本研究结果证实灵芝酒可缓解饮酒导致的酒精性肝损伤，为灵芝酒改善酒精性肝损伤提供了学术参考。
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