新疆杏果自然发酵醪中产香酿酒酵母的分离鉴定及其发酵特性

李 帅1,2,王 英2,吴海虹2,李大婧2,王 愈1,马艳弘2,*

(1.山西农业大学食品科学与工程学院,山西 晋中 030600;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏 南京 210014)

摘 要:为筛选出具有产香能力的本土优良酿酒酵母,以新疆杏果发酵醪为分离源,采用以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷为底物的96孔板高通量显色法进行初筛,进一步通过杏酒模拟发酵实验对初筛菌株进行复筛,综合分析其发酵特性、β-葡萄糖苷酶与酯酶生产能力及多种耐受性,结合形态学观察与分子生物学技术对筛选菌株进行菌种鉴定。结果表明,从4种新疆杏果发酵醪中初筛得到16株酵母菌,进一步从中筛选出2株产香能力较强的优良酵母菌M1-7-2和MS-9,分别鉴定为酿酒酵母布拉迪亚种(Saccharomyces cerevisiae var. boulardii)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。其中菌株M1-7-2的β-葡萄糖苷酶活性和酯酶活性分别为16.31 U/L和18.88 U/L,菌株MS-9的对应酶活性分别为15.96 U/L和18.26 U/L,2株菌株均可耐受10~40 ℃、pH 3~7、300 g/L葡萄糖、150 mg/L SO2及16%乙醇胁迫。研究结果可为杏酒发酵剂的开发及品质提升提供可靠的菌株资源。

关键词:杏;果酒;产香酵母;筛选;耐受性;鉴定

杏(Prunus armeniaca L.)为蔷薇科李亚科杏属植物,原产于中国,目前在我国河北、河南、山东、陕西、山西、新疆等省区广泛分布。其果实风味独特,酸甜适中且具有浓郁芳香气味,富含多种人体必需营养素(主要包括植物蛋白、多酚类化合物、多糖、有机酸、矿物质元素、维生素以及类胡萝卜素等)[1]。杏中所含的扁桃苷被证实具有抗肿瘤功效,适量摄入有助于降低某些癌症的发病风险[2]。然而,杏果实采后呼吸作用旺盛,贮藏耐受性较差,在贮藏过程中易出现腐烂、失水及褐变等品质劣变现象[3]。通过发酵工艺将杏加工为杏酒,既可缓解鲜果集中上市带来的贮藏与销售压力,又能显著提升产品附加值,同时丰富果酒市场的品类多样性[4]

在果酒的发酵过程中,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和非酿酒酵母共同承担关键作用,二者代谢互动有助于形成更为复杂的风味体系,并提升最终产品的营养品质[5]。其中酿酒酵母具有独立完成发酵的能力,能够高效同化碳源,将其转化为乙醇及多种挥发性香气成分(如酯类、高级醇与萜烯类物质),这些代谢产物共同塑造酒体典型且丰富的香气特征[6]。由于商业酵母具有高效稳定的发酵特性,目前被广泛应用于果酒的生产,造成了产品区域特色不明显、风味同质化等问题,因此本土酵母菌的筛选和应用受到果酒酿造领域的广泛关注[7-8]。随着风味组学和微生物组学技术的进步,研究开始重新聚焦于酿酒酵母在风味形成中的重要性[9]。如Peng Qi等[10]通过宏基因组学和代谢组学技术分析了宁夏枸杞酒的发酵过程,揭示了酿酒酵母在发酵过程中不仅主导多种关键风味物质的生物合成,还能够通过与微生物组的互作关系,进一步促进风味轮廓的复杂性与多样性形成。该研究指出,在发酵过程中,酿酒酵母主要通过合成醇类、酯类及萜烯类等化合物,构成果酒特征性香韵的基础。此外,在与乳酸菌、非酿酒酵母等其他微生物的协同互作过程中,发酵体系内风味化合物的种类数量与含量均实现显著提升,进而增强果酒的整体风味复杂性。此类协同互作不仅丰富了果酒中的挥发性风味化合物种类,而且对非挥发性化合物的代谢过程产生调控作用,最终进一步优化果酒的整体感官品质。因此,深入研究酿酒酵母的代谢机制及其在杏酒发酵中的作用,对于优化杏酒的风味品质和发酵工艺具有重要意义。

本研究旨在从自然发酵的杏汁中筛选具有产香能力的本土优良酵母菌。以β-葡萄糖苷酶与酯酶活性作为核心产香潜力的初筛指标,进而对菌株进行多重胁迫耐受性分析及分子生物学鉴定,以期获得兼具突出产香特性与良好环境适应性的酵母菌株,为优质杏酒的开发提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巴仁杏、大白杏、芒果杏、赛买提杏:7~8成熟,于2024年6月28日采集于新疆阿图什三合果业有限公司。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)引物 生工生物工程(上海)股份有限公司;对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG) 上海麦克林生化科技股份有限公司;对硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP) 南京响海生物科技有限公司;乙酸对硝基苯酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙醇含量检测试剂盒 北京赛斯为生物科技有限公司;还原糖含量检测试剂盒 北京一邦成商贸有限公司;甘油含量检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;果酒商业酵母DV10 法国LALLEMAND 公司;无水乙醇、葡萄糖、碳酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、琼脂粉等(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培养基:蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L(固体培养基添加),pH 6.5±0.2,121 ℃灭菌20 min。

筛选培养基:马铃薯20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、p-NPG 10 g/L,自然pH值,121 ℃灭菌20 min。

WL固体培养基 南京荣胜达实验仪器有限公司;模拟葡萄汁培养基 北京萃锋科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZQTY-50摇床 上海知楚仪器有限公司;雷磁ZD-2自动电位滴定仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;3K15离心机 德国Sigma公司;LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;Multiskan SkyHigh全波长酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;Eclipse E200生物显微镜 尼康映像仪器销售(中国)有限公司;T100 Thermal Cycler梯度PCR仪 美国Bio-Rad公司;SW-CJ-2FD百级洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分离

将不同品种杏果实经去核、破碎处理后,置于灭菌三角瓶内于室温条件下进行自然发酵。分别于发酵第0、3、6天时取样,将发酵醪液与无菌生理盐水混合并进行梯度稀释,选取10-8~10-5稀释度的菌悬液各0.1 mL涂布于YPD固体培养基上,28 ℃恒温培养48 h。待菌落长出后,依据形态特征挑取疑似酵母菌的单菌落,并通过连续3次划线纯化培养以获得纯培养物[11]。将分离获得的单菌落接种于YPD液体培养基中,于28 ℃条件下活化24 h。取活化后的菌液,用无菌生理盐水进行梯度稀释,选取10-8~10-5稀释度的菌悬液各0.1 mL涂布于WL鉴别培养基平板上,28 ℃恒温培养5 d后,观察并记录菌落形态与颜色特征,据此选取代表性菌株。进一步通过结晶紫染色法对菌株进行预处理,并在光学显微镜下观察其细胞形态。最后,依据形态学观察结果对菌株进行初步分类,并进行低温甘油管保藏及系统编号[12]

1.3.2 产香菌株初筛

基于β-葡萄糖苷酶可催化底物p-NPG分解生成p-NP,该产物在碱性条件下呈黄色的原理,对菌株进行初筛。在96孔板每孔中加入200 μL以p-NPG为底物的筛选培养基,凝固后接种15 μL纯化菌液,每株菌设3个重复孔,并详细记录菌株编号与孔位对应关系。将96孔板于28 ℃恒温培养72 h后,每孔加入10 μL 1 mol/L碳酸钠溶液以终止反应并显色,静置10 min后,根据孔中黄色深浅初步判断β-葡萄糖苷酶活性高低,选取显色较深的菌株进行复筛。

1.3.3 产香菌株复筛

1.3.3.1 高产β-葡萄糖苷酶菌株筛选

参照Sun Wangsheng等[13]的方法,分别取初筛获得的酵母菌液500 μL接种于5 mL YPD液体培养基中,28 ℃、180 r/min振荡培养箱培养72 h。将培养完成后的发酵液于4 ℃、12 000 r/min离心15 min,收集上清液,即为酵母菌株的β-葡萄糖苷酶粗酶液。取0.1 mL粗酶液与0.2 mL 35 mmol/L p-NPG(pH 5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制)混匀,50 ℃保温30 min,加入2 mL、1 mol/L碳酸钠溶液以终止反应并显色,于400 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线(y=0.009 3x+0.046 4,R2=0.999 9)计算最终酶活性。产酶活性高的菌株即为高产β-葡萄糖苷酶菌株。

β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义:50 ℃条件下,每分钟内催化底物p-NPG水解,释放出1 μmol p-NP所需的酶量。

1.3.3.2 高产酯酶菌株筛选

参照严幻汝等[14]的方法制备粗酶液。分别取初筛的酵母菌液500 μL接种于5 mL YPD液体培养基中,28 ℃、180 r/min振荡培养24 h。将培养完成后的发酵液4 ℃、12 000 r/min离心15 min,收集上清液,即为酯酶粗酶液。取100 μL粗酶液,加入860 μL 0.1 mol/L柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 5.0)、40 μL 25 mmol/L溶于无水乙醇的乙酸对硝基苯酯,混合均匀。40 ℃条件下反应2 h。然后加入100 μL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液以终止反应。对照组用柠檬酸磷酸缓冲液代替酶液。反应完成后在波长400 nm处测定吸光度。根据标准曲线(y=0.009 3x+0.046 4,R2=0.999 9)计算最终酶活性,具有较高酶活性的菌株即为高产酯酶的酵母菌株。

酯酶活性单位(U)定义:40 ℃条件下,每分钟内催化底物乙酸对硝基苯酯水解,释放1 μmol p-NP所需的酶量。

1.3.4 产香酵母菌株发酵特性分析

将复筛所得菌株接种于YPD液体培养基中连续活化3代,调整菌液浓度至1×107 CFU/mL,用于后续发酵特性分析。分别取200 μL上述菌悬液接入含8 mL模拟葡萄汁的试管中,28 ℃静置培养7 d,结束后测定发酵液中还原糖、乙醇及甘油的含量。

1.3.5 产香酵母菌的耐受性分析

温度耐受性[15]:将活化好的菌株种子液以10%接种量接种于pH 5.0的无菌模拟葡萄汁培养基中,分别在不同温度(10、20、30、40、50 ℃)恒温培养48 h。以商业酵母DV10为对照,测定OD600 nm值,分析酵母菌对温度的耐受性。

pH值耐受性[16]:将活化好的菌株种子液以10%接种量接种于不同pH值(3、4、5、6、7)的无菌模拟葡萄汁培养基中,28 ℃恒温培养48 h。以商业酵母DV10为对照,测定OD600 nm值,分析酵母菌对pH值的耐受性。

葡萄糖耐受性[17]:将活化好的菌株种子液以10%接种量接种于pH 5.0的无菌模拟葡萄汁培养基中,加入不同质量浓度的无水葡萄糖(葡萄糖终质量浓度分别为100、150、200、250、300 g/L),28 ℃恒温培养48 h。以商业酵母DV10为对照,测定OD600 nm值,分析酵母菌对葡萄糖的耐受性。

乙醇耐受性[18]:将活化好的菌株种子液以10%接种量接种于pH 5.0的无菌模拟葡萄汁培养基中,加入无水乙醇(乙醇终体积分数分别为4%、8%、12%、16%),28 ℃恒温培养48 h。以商业酵母DV10为对照,测定OD600 nm值,分析酵母菌对乙醇的耐受性。

SO2耐受性[19]:将活化好的菌株种子液以10%接种量接种于pH 5.0的无菌模拟葡萄汁培养基中,加入不同质量浓度的偏重亚硫酸钾(SO2终质量浓度分别为0、50、100、150、200 mg/L),28 ℃恒温培养48 h。以商业酵母DV10为对照,测定OD600 nm值,分析酵母菌对SO2的耐受性。

1.3.6 酵母菌的分子学鉴定

参照《真菌鉴定手册》和《酵母菌的特征与鉴定手册》对复筛得到的优质酵母菌进行形态学鉴定,重点观察单菌落的形态特征。将上述菌株活化培养后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定,并利用NCBI数据库对所获序列进行BLAST同源性比对分析。

1.4 数据统计分析

实验分别设置3次平行,采用Excel 2019对数据进行处理,数据以-表示,结果通过Origin 2022软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离与初筛

采用纯培养技术,从杏自然发酵液中共分离得到63株菌。利用WL培养基培养、显微镜观察,p-NPG显色反应筛选培养基初筛,获得16株具有典型酵母菌落特征、产β-糖苷酶活性较强的酵母菌株。分别编号为PS-9、M1-4-1、M1-4-2、M1-7-1、M1-7-2、M1-9-1、M2-1、M2-4-1、M2-4-2、M2-5-1、M2-5-2、MS-10、MS-9、MX3-1-1、PX3-1-1、PZ-13。

2.2 酵母菌复筛

β-葡萄糖苷酶和脂酶的活性是评价酵母产香能力的重要指标,因为这些酶能够水解非挥发性前体物质,释放出具有香气活性的化合物,如酯类、高级醇以及萜烯类物质,从而显著增强果酒的芳香复杂性[20]。将16株酵母菌接种于YPD液体培养基中,检测16株酵母菌在YPD液体培养基中的产酶能力,结果见图1。

图1 酵母菌的产酶特性评价
Fig.1 Evaluation of enzyme-producing characteristics of yeast

由图1可知,菌株M1-4-2、M2-4-2、PX3-1-1、M1-7-2 的β-葡萄糖苷酶活性显著高于其他菌株(P<0.05),分别为16.96、16.80、16.48、16.31 U/L;菌株M1-7-2的酯酶活性最高,为18.88 U/L,其次为MS-9,其β-葡萄糖苷酶活性为15.96 U/L,酯酶活性为18.26 U/L,显著高于其他菌株(P<0.05)。菌株M1-4-2与M2-4-2具有突出的β-葡萄糖苷酶活性,而菌株M1-7-2与MS-9则在酯酶活性上表现最佳,综合2项关键产香酶活性,菌株M1-4-2、M1-7-2、M2-4-2和MS-9展现出相对均衡且较高的产酶能力。与商业化酵母DV10相比,β-葡萄糖苷酶活性分别提高53.33%、47.53%、51.88%、44.32%,酯酶活性分别提高44.84%、77.12%、41.38%、71.37%。

2.3 发酵特性分析

发酵液中残留糖含量较低通常指示酵母发酵过程较为完全,反映出菌株对还原糖具有较高的利用效率与较强的发酵活力[21]。以残糖量、乙醇体积分数、甘油含量为指标,通过菌株发酵模拟葡萄汁检测M1-4-2、M1-7-2、M2-4-2和MS-9酵母菌的发酵特性,结果见表1。发酵结束后,4株酵母菌在模拟汁体系中对还原糖的利用率均超过60%,略低于商业酵母DV10的还原糖消耗率(68.55%),表明这些菌株具备高效的糖代谢能力。其中,菌株MS-9表现出较强的发酵性能,其发酵液中残留还原糖为61.12 g/L,乙醇体积分数达7.24%,甘油质量浓度为7 g/L。

表1 酵母菌的发酵特性评价
Table1 Evaluation of fermentation characteristics of yeast

编号还原糖质量还原糖乙醇体积甘油质量浓度/(g/L)消耗率/%分数/%浓度/(g/L)M1-4-266.15±0.0163.856.92±0.056.54±0.01 M1-7-270.80±0.0261.316.62±0.066.97±0.00 M2-4-265.03±0.0364.466.98±0.066.68±0.01 MS-961.12±0.0466.607.24±0.077.00±0.01 DV1057.55±0.0668.557.38±0.036.78±0.01

2.4 耐受性分析

2.4.1 温度耐受性

在发酵过程中,温度是调控酵母菌生长的关键环境因子,其变化显著影响酵母的代谢活性与繁殖速率,不同菌株对温度的适应范围与耐受能力也存在显著差异[22]

由图2可知,在10~50 ℃的温度区间内,各菌株OD600 nm值均随温度升高呈现先升后降的变化趋势。菌株M1-4-2、M1-7-2和MS-9在10 ℃条件下OD600 nm值均高于0.4,且在40 ℃条件下仍可达到1.5以上,表明这3株菌均具备一定的低温和高温适应能力。其中,M1-7-2表现出最强的低温生长性能,MS-9则具有最优的高温耐受性。在果酒酿造实践中,发酵温度通常需控制在10~28 ℃,该范围有助于维持酵母活性,保障发酵过程平稳进行,从而有助于形成良好的产品风味与口感。综上所述,所有测试菌株在适宜发酵温度段内均能良好生长;其中,菌株M1-4-2、M1-7-2和MS-9因其在低温(10 ℃)与高温(40 ℃)端点的稳健表现,展现出更为突出的宽温适应性和发酵稳定性潜力。

图2 不同温度对酵母菌生长的影响
Fig.2 Effect of different temperature on the growth of yeast

2.4.2 pH值耐受性

环境pH值是影响酵母菌代谢过程及酶活性的关键参数,适宜的酸碱环境有助于维持酵母细胞正常的生理功能,从而促进其生长与增殖[23]。4株酵母菌在不同pH值下的生长情况见图3。

图3 不同pH值对酵母菌生长的影响
Fig.3 Effect of different pH on the growth of yeast

研究表明,酵母在葡萄酒发酵中的最适pH值范围为3.0~3.6,这一环境可有效抑制杂菌生长并维持酵母代谢活性,而当环境pH值低于3.0时会对其生长产生显著抑制。由图3可知,在pH 3~7范围内,菌株M1-4-2、M1-7-2、M2-4-2及MS-9均能维持正常生长,其生长未因酸性环境(pH 3~4)而表现出显著抑制,说明该4株菌均能够满足果酒发酵的实际需求。

2.4.3 葡萄糖耐受性

在果酒酿造过程中通常需补充外源葡萄糖以满足碳源需求。较高浓度的葡萄糖环境会对酵母菌的生长代谢产生调控作用[23],进而影响其发酵性能及最终产品的酒质特征[24]。4株酵母菌在不同葡萄糖质量浓度下的生长情况见图4。

图4 不同葡萄糖质量浓度对酵母菌生长的影响
Fig.4 Effect of different glucose mass concentration on the growth of yeast

果酒发酵体系中初始葡萄糖质量浓度通常为100~250 g/L,高糖环境易对酵母造成渗透胁迫,因此耐高糖能力是果酒发酵优良酵母菌株的重要筛选指标。由图4可知,4株菌株在100~300 g/L的葡萄糖质量浓度范围内均表现出生长能力。当葡萄糖质量浓度达到300 g/L时,其中3株菌株的OD600 nm值均超过1.0,说明这些菌株具备较强的高糖耐受性,可适应果酒发酵的高糖环境。然而,随着葡萄糖质量浓度的升高,各菌株的生长均受到一定程度抑制,呈现出高糖下的生长胁迫特征;在200~300 g/L的葡萄糖质量浓度区间内,菌株MS-9的发酵液OD600 nm值均高于其他3株,表明该菌株具有更优的耐高糖特性。

2.4.4 乙醇耐受性

在厌氧发酵条件下,酵母菌代谢生成乙醇;随发酵进程推进,乙醇逐渐积累并对酵母细胞产生毒性效应,进而抑制其生长与代谢活性[25]。酵母菌的乙醇耐受性越高,越有利于发酵过程的持续高效进行。4株菌株对乙醇的耐受性实验结果见图5。

图5 不同乙醇体积分数对酵母菌生长的影响
Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on the growth of yeast

在果酒酿造中,最终乙醇体积分数因原料而异,常见范围为5%~15%。由图5可知,在乙醇体积分数为4%~16%的范围内,所有测试菌株的生长均随乙醇体积分数升高而受到抑制。菌株M1-4-2、M1-7-2、M2-4-2与MS-9在4%~8%乙醇体积分数条件下仍可维持显著生长;当乙醇体积分数提高至12%~16%时,菌株MS-9和M1-7-2的生物量明显高于其他2株。上述结果表明,菌株MS-9表现出最优的乙醇耐受性,M1-7-2次之,而M1-4-2和M2-4-2的耐受能力相对较弱,这预示着MS-9和M1-7-2在酿造高乙醇体积分数果酒或保障发酵后期效率方面可能更具应用潜力。

2.4.5 SO2耐受性

在酿酒工艺中,适宜含量的SO2不仅可有效抑制杂菌污染,还能够发挥抗氧化及稳定色泽的功能[26],因此,选育对SO2具有较高耐受性的酵母菌株,对保障发酵顺利进行及最终产品风味与色泽的稳定性具有关键意义。检测4株菌对不同SO2质量浓度的耐受性,结果见图6。

图6 不同SO2质量浓度对酵母菌生长的影响
Fig.6 Effect of different SO2 mass concentration on the growth of yeast

SO2是果酒酿造中用于抑菌、抗氧化的关键添加剂,其生产常规添加质量浓度为50~150 mg/L,过高的SO2会对酵母细胞产生毒性与氧化胁迫,进而抑制酵母的生长代谢。由图6可知,当SO2质量浓度不高于150 mg/L时,所有测试菌株均能维持正常生长,其生长状态未受明显抑制;当SO2质量浓度升高至200 mg/L时,虽然菌体最终生物量有所下降,但仍可观察到明显的生长现象。结果表明,该4株酵母在超过常规工艺添加量乃至接近部分法规上限条件下仍能生长,均表现出较强的SO2耐受性,这有助于确保在采用必要SO2工艺的发酵中酵母活性的稳定。

综合4株酵母菌的发酵特性及温度、pH值、葡萄糖、乙醇、SO2 5大环境胁迫耐受性的系统评价结果,并结合杏酒发酵的实际生产需求,从抗逆性、代谢适配性等维度进行综合筛选,最终选取M1-7-2和MS-9这2株菌株开展菌种鉴定。其中,菌株M1-7-2展现出最优的低温生长性能,在果酒发酵低温启动阶段具备明显生长优势,且其pH值、SO2耐受能力与杏酒发酵的酸性、护色剂添加环境高度适配,还原糖消耗效率与产香关键酶(β-葡萄糖苷酶、酯酶)活性均表现优异;菌株MS-9为综合抗逆性最优的菌株,在高温、高葡萄糖、高乙醇胁迫下的生长状态优于其他菌株,尤其在果酒发酵后期乙醇大量积累的关键阶段,仍能维持较高的生物量与代谢活性,同时其各项产香酶活性与还原糖消耗率均处于较高水平。相较于这2株菌株,其他2株酵母菌虽能适应果酒发酵的基础环境,但在核心抗逆指标(如高乙醇耐受性、高糖耐受性)及产香关键酶活性上均表现稍逊,综合发酵性能与应用潜力不及M1-7-2和MS-9。基于此,为明确上述2株优良菌株的分类学地位,为其后续在杏酒发酵中的开发应用提供菌种学基础,特对M1-7-2和MS-9进行形态学观察与分子生物学鉴定。

2.5 菌株鉴定

2.5.1 M1-7-2、MS-9的菌体及菌落形态特征

由图7可知,菌株M1-7-2与MS-9在WL固体培养基上形成的菌落多呈近圆形,表面隆起、光滑湿润且具光泽,边缘规整,质地偏黏稠、颜色呈白色或淡绿色。菌体大多呈现椭圆形,繁殖方式为出芽生殖。

图7 酵母菌MS-9(A)和M1-7-2(B)在WL培养基上的菌落特征以及显微形态(×100)
Fig.7 Colony characteristics and micromorphology of yeast strains MS-9 (A) and M1-7-2 (B) on WL medium (×100)

2.5.2 26S rDNA扩增结果

选取产酶活性较高且耐受性良好的菌株M1-7-2与MS-9进行分子生物学鉴定。以所提取的酵母基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果见图8。结果显示,2株菌均在约600 bp处出现清晰可见的特异性条带,表明PCR扩增成功,产物符合测序要求。

图8 酵母菌MS-9、M1-7-2 26S rDNA D1/D2 区PCR扩增产物凝胶电泳图
Fig.8 Gel electrophoresis image of PCR-amplified 26S rDNA D1/D2 region from yeast strains MS-9 and M1-7-2

2.5.3 酵母菌系统发育树的建立

对菌株M1-7-2和MS-9的PCR扩增序列进行BLAST相似性搜索及系统发育分析。由图9可知,2株菌的序列与GenBank中所有的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)参考序列共同形成了一个高支持率的单系群,经序列同源性比对与系统发育聚类结果确认,菌株M1-7-2为酿酒酵母布拉迪亚种(Saccharomyces cerevisiae var. boulardii),菌株MS-9为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),从而在分子水平上确证了二者的分类地位为酿酒酵母。

图9 菌株M1-7-2和MS-9的系统发育树
Fig.9 Phylogenetic tree of strains M1-7-2 and MS-9

3 结 论

酵母菌在果酒酿造中具有重要作用,果酒的良好风味不仅来源于原料本身,更与优良酵母菌株的代谢活动密切相关。酵母通过发酵作用转化基质,产生包括有机酸、醇类、酯类及氨基酸等多种代谢产物,这些挥发性及非挥发性的组分共同构成了果酒的风味基质,对改善并丰富发酵饮品的感官品质具有关键作用[27-28],这些物质的产生对改善发酵制品的风味至关重要[29]。本研究通过平板分离与纯化技术,自新疆4种杏样品中筛选得到2株酵母菌株——M1-7-2与MS-9,分别鉴定为酿酒酵母布拉迪亚种(Saccharomyces cerevisiae var. boulardii)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。该菌株在发酵性能方面表现突出:还原糖利用率超过60%,可耐受10~40 ℃、pH 3~7、300 g/L 葡萄糖、150 mg/L SO2及16%乙醇胁迫;同时,其β-葡萄糖苷酶与酯酶活性分别较商业化酵母DV10提高40%和70%,显示出优良的产香潜力。上述特性表明,M1-7-2与 MS-9菌株具备作为高性能酿造酵母的潜质,可用于工业化果酒生产,具有良好的开发与应用前景。

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Isolation and Identification of Aroma-Producing Saccharomyces cerevisiae from Naturally Fermented Xinjiang Apricot Mash and Its Fermentation Characteristics

LI Shuai1, WANG Ying2, WU Haihong2, LI Dajing2, WANG Yu1, MA Yanhong2,*

(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030600, China;2. Institute of Agro-products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

Abstract: To screen for indigenous Saccharomyces cerevisiae strains with superior aroma-producing capability, using the fermentation mash of Xinjiang apricot fruit as the isolation source, strain was screened preliminarily using a 96-well plate high-throughput colorimetric method with p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside as the substrate, and the obtained strains were screened secondarily via simulated apricot wine fermentation experiments. The fermentation characteristics, β-glucosidase and esterase production capacities, and multiple stress tolerances of the target strains were comprehensively analyzed,and morphological observation combined with molecular biological techniques was performed for strain identification.The results showed that 16 yeast strains were preliminarily screened from the fermentation mash of 4 Xinjiang apricot varieties, among which 2 strains with strong aroma-producing performance, designated M1-7-2 and MS-9, were further obtained and identified as S. cerevisiae var. boulardii and S. cerevisiae, respectively. The β-glucosidase activity and esterase activity of strain M1-7-2 were 16.31 and 18.88 U/L, respectively, while those of strain MS-9 were 15.96 and 18.26 U/L,respectively. Both strains exhibited tolerance to stresses of 10-40 ℃, pH 3-7, glucose 300 g/L, SO2 150 mg/L, and 16%ethanol. The results of this study can provide reliable strain resources for the development of apricot wine starters and the quality improvement of apricot wine.

Keywords: apricot; fruit wine; aroma-producing yeast; screening; tolerance; identification

DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.05.015

中图分类号:TS261.1

文献标志码:A

文章编号:0254-5071(2026)05-0120-07

收稿日期:2025-09-22

基金项目:新疆自治区重点研发计划项目(2023B02028-2)

第一作者简介:李帅(2002—),男,硕士研究生,研究方向为食品生物工程。E-mail: 1825657166@qq.com

*通信作者简介马艳弘(1972—),女,研究员,博士,研究方向为果蔬加工与功能食品。E-mail: ma_yhhyy@126.com

引文格式:李帅, 王英, 吴海虹, 等. 新疆杏果自然发酵醪中产香酿酒酵母的分离鉴定及其发酵特性[J]. 中国酿造, 2026, 45(5): 120-126.DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.05.015. http://www.chinabrewing.net.cn

LI Shuai, WANG Ying, WU Haihong, et al. Isolation and identification of aroma-producing Saccharomyces cerevisiae from naturally fermented Xinjiang apricot mash and its fermentation characteristics[J]. China Brewing, 2026, 45(5): 120-126. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.05.015. http://www.chinabrewing.net.cn