酱香型白酒因其“酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长”的独特风格特点而深受广大消费者青睐[1-2]。这些独特的风味跟酱香型白酒复杂传统的制酒工艺密切相关，从下沙、糙沙到7轮次取酒结束[3]，从润粮、蒸粮、摊晾、堆积、入窖、出窖上甑等所有工序均依赖人工操作，因此传统生产方式有生产环境差、劳动强度大、人工成本高、生产效率较低等缺点，难以适应现代化生产要求[4]。
随着白酒产业技术升级，国内众多知名的白酒企业在机械制造高温大曲[5]、机械自动上甑[6]方面实现了机械化生产，显著提高了生产效率。虽然机械化酿造和传统手工酿造同样采用开放式的双边发酵模式，能够网罗、富集生产环境中的微生物[7]，但由于摊晾、堆积等环节的操作方式不同，两者在微生物群落结构上存在显著不同。席德州[8]对比了酱香型白酒机械化堆积发酵酒醅与传统酱香型白酒酿造过程中微生物群落结构组成差异，结果表明，差异菌群有球拟酵母属（Torulaspora）、不动杆菌属（Acinetobacter）等。王欢等[9]研究表明，柄杆菌属（Caulobacter）与红球菌属（Rhodococcus）为酱香型白酒机械化酿造堆积酒醅特有菌属。此外，有机酸是构成酱香型白酒风味的关键物质，也是乳酸乙酯、乙酸乙酯等核心风味酯类的前体，其形成与微生物群落构成及演替相互影响[10]。黄俊秋等[11]研究酱香型白酒第5轮次堆积发酵过程酒醅有机酸，结果表明，乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸是堆积发酵过程中的主体有机酸，相关性分析表明，淀粉、还原糖、乳酸、甲酸是第5轮次堆积酒醅微生物的关键环境因子。目前鲜见机械与手工酿造酱香型白酒第3轮次堆积酒醅微生物群落及有机酸差异分析的研究报道。
本研究应用高通量测序技术、高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）对机械和手工酿造酱香型白酒3轮次堆积酒醅发酵过程中的微生物群落结构与有机酸进行对比分析，并对主要微生物属和有机酸进行相关性分析，以期为酱香型白酒机械化酿造工艺的优化提供参考依据，为白酒品质的提升提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
堆积发酵酒醅采集自赤水河岸某酒企酱香型白酒酿造车间，选取机械车间、手工车间各3口窖池共6口窖池作为实验窖池。选取酱香型白酒第3轮次堆积前（Q）和堆积后（H）作为取样时间点，堆体高约为 1.8 m、直径约为 2.2 m，将堆体分3层，中心1.1 m深为内层、20 cm深为中层、表面为表层，于堆体3个醅层进行分别采样，每个醅层从4个方位分别取样，最后将相同层4个方位的样品混合后按4分法缩样，按机械车间（M）、手工车间（T）分别编号为内层样品（N）、中层样品（Z）、外层样品（W）。采集完毕后将样品及时保存于－20 ℃用于后续检验。
五水硫酸铜、四水酒石酸钾钠、氢氧化钠、一水葡萄糖、三水亚甲基蓝、酚酞、浓盐酸、无水乙醇（均为分析纯） 成都市科隆化学品有限公司；FastDNA®土壤DNA提取试剂盒 美国MP公司；Illumina TruSeq DNA样品制备LT试剂盒 美国Life公司。
1.2 仪器与设备
1260 Infinity液相色谱系统、SB-AQ色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Polaris C18-A色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Agilent公司；ME型分析天平 瑞士 METTLER TOLEDO公司；NC2000 NanoDrop DNA含量测定仪、2720聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Tissuelyser-48研磨仪 上海净信实业发展有限公司；DYY-6C电泳仪 北京六一生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 理化指标检测
水分、酸度、还原糖、淀粉测定：分别参照T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》[12]的恒温干燥法、中和滴定法、葡萄糖标准溶液反滴定法、葡萄糖标准溶液反滴定法。
有机酸含量测定：采用HPLC测定酒醅中有机酸。取5 g酒醅，按照料液比为1∶3（g/mL）置于50 mL离心管中，提取液采用50%的乙醇水溶液，添加提取剂后，于室温超声30 min，然后于4 ℃冰箱静置提取 30 min，静置后在4 ℃条件下10 000 r/min离心30 min得上清液，随后将上清液用0.22 μm滤膜过滤得到酒醅提取液，移至液相色谱小瓶待测。HPLC条件参考赵兴蓉等[13]的方法。
1.3.2 DNA提取、PCR扩增与高通量测序
DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取酒醅DNA，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，利用NanoDrop 2000测定DNA浓度及纯度。
PCR 扩增：以提取的DNA为模板，使用引物338F/806R扩增细菌16S rRNA的V3～V4高变区；使用引物 ITS1F/ITS2R 扩增真菌的内部转录间隔区。PCR扩增体系：2×ProTaq 10 μL、上游引物（5 μmol/L） 0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、DNA模板10 ng，双蒸水（ddH2O）补足至20 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共进行30个循环，然后72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。扩增结束后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物，利用DNA凝胶回收纯化试剂盒对产物进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖凝胶电泳检测。最后将回收到的PCR产物送至南京派森诺基因科技有限公司进行高通量测序。高通量测序数据使用派森诺基因云平台分析处理。
1.4 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2016整理数据，使用GraphPad Prism 10.1.2绘图。
2 结果与分析
2.1 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后的理化因子差异分析
水是白酒发酵过程中所有生化反应的必需介质[14]，由图1A可知，机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后的水分质量分数差异不大，分别为42.83%～49.10%、45.32%～52.73%，且手工酿造第3轮次堆积酒醅内层的水分含量极显著高于机械酿造（P＜0.01），说明手工酿造工艺能在堆积过程中保留更多水分。
图1 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后理化指标检测结果
Fig.1 Determination results of physicochemical indexes in the thirdround fermented grains before and after stacking fermentation in mechanical and manual brewing processes
合适的酸度能有效抑制杂菌的生长，使发酵酵母在自然环境中具有竞争优势[15]。由图1B可知，机械酿造酒醅堆积发酵前（4.03～4.32 mmol/10 g）、后（3.56～4.58 mmol/10 g）的酸度均极显著高于手工酿造酒醅堆积发酵前（2.65～3.54 mmol/10 g）、后（2.59～3.11 mmol/10 g）（P＜0.01），表明机械酿造酒醅酸度更高。
酒醅中淀粉与还原糖含量可作为反映底物代谢进程的核心指标，为菌群生长代谢提供碳源基础[16]。由图1C可知，手工酿造酒醅堆积发酵前还原糖质量分数（4.88%～5.82%）整体高于机械酿造酒醅（4.41%～4.90%），但机械酿造酒醅堆积发酵后的还原糖质量分数（6.38%～9.28%）均极显著高于手工酿造酒醅（4.69%～6.33%）（P＜0.01）。由图1D可知，手工酿造酒醅堆积发酵前淀粉质量分数（51.19%～55.14%）高于机械酿造酒醅（46.06%～52.59%），但无显著差异，而发酵后淀粉含量与机械酿造酒醅相差不大，表明2种酿造方式对堆积酒醅中淀粉含量无明显影响。
2.2 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后的微生物 群落结构差异分析
2.2.1 微生物群落α-多样性差异
α-多样性是指局部均匀生境下的物种丰富度、多样性和均匀度等，可有效评估机械和手工2种酿造方式酒醅的微生物群落的丰富度和多样性。Coverage指数反映样本中微生物群落的覆盖度，其数值越高，代表测序深度足够；Chao1指数、Observed_species可反映群落的物种丰富度，数值越大，群落物种越丰富；Shannon指数可反映样品中群落的多样性，Shannon指数越大，表明样品中群落多样性越高，反之则越 低[17]。由表1可知，Coverage指数均大于99.90%，表明测序结果可真实地反映样品中细菌和真菌等微生物的多样性，手工酿造堆积酒醅发酵前细菌群落的Chao1指数 （2 076.93～3 083.81）和Observed_species（1 868～2 675） 均高于机械酿造堆积酒醅，这表明手工酿造酒醅在堆积发酵前细菌丰富度更高，但细菌群落Shannon指数相差不大，表明2种酿造方式对细菌多样性影响不大。机械酿造酒醅堆积发酵前真菌群落的Chao1指数和Observed_species高于手工酿造酒醅。表明机械酿造酒醅在堆积发酵前的真菌丰富度更高。其原因可能是手工酿造模式制堆时间更长，在制堆过程中，真菌菌群对物理环境变化更为敏感[18]，但真菌群落Shannon指数相差不大，表明 2种酿造方式对真菌多样性影响不大。
表1 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后的微生物菌群α-多样性
Table1 α-Diversity of microbial communities in the third-round fermented grains before and after stacking fermentation in mechanical and manual brewing processes
Coverage 样品Chao1指数Shannon指数Observed_species指数/%编号细菌真菌细菌真菌细菌真菌细菌真菌T-N2 076.93104.336.733.261 86815499.9599.95 T-Z2 423.18125.666.683.482 30215599.9699.95发T-W3 083.81117.826.613.312 67514699.9699.96酵前M-N1 765.72178.536.193.241 65217899.9799.96 M-Z2 491.98166.507.273.412 29216699.9799.96 M-W2 238.45146.517.413.102 15315699.9699.97 T-N494.00 129.50 2.11 2.06 488 129 99.9499.93 T-Z467.60 136.50 2.33 1.81 467 135 99.9499.93发T-W430.50 138.50 2.32 1.96 430 138 99.9399.92酵后M-N371.49 109.33 1.99 2.20 371 109 99.9499.92 M-Z232.33 71.33 2.27 1.87 232 71 99.9399.92 M-W282.67 92.89 2.11 1.87 282 92 99.9399.94
手工酿造堆积酒醅发酵后细菌、真菌群落的Chao1指数（430.50～494.00、129.50～138.50）和Observed_species（430～488、129～138）均高于机械酿造堆积酒醅，说明手工酿造酒醅在堆积发酵后细菌及真菌丰富度更高，而细菌、真菌群落Shannon指数相差不大，表明2种酿造方式对细菌及真菌多样性影响不大。以上结果表明，手工酿造在堆积发酵过程中能富集到更多的微生物。
2.2.2 微生物群落结构分析
堆积发酵过程使酒醅富集了大曲及环境微生物，同时也驱动了其微生态的复杂演变。通过高通量测序对2种不同酿造方式酒醅堆积发酵前后的微生物群落结构进行分析，堆积发酵前酒醅中共检出细菌属309种，其中，机械、手工酿造酒醅中独有细菌属分别为83、67个；共检出104种真菌属，其中，机械、手工酿造酒醅中独有真菌属分别为37、18个。堆积发酵后酒醅中共检出细菌属297个，其中，机械、手工酿造酒醅中独有细菌属分别为33、41个；共检出121个真菌属，其中，机械、手工酿造酒醅中独有真菌属分别为12、17个。本研究选取平均相对丰度排名前20的微生物菌属进行分析，结果见图2。
图2 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后微生物菌群结构
Fig 2 Microbial community structure in the third-round fermented grains before and after stacking fermentation in mechanical and manual brewing processes
由图2A可知，机械酿造酒醅堆积发酵前共检出6个优势细菌属（相对丰度＞1%），包括克罗彭斯特氏菌属（Kroppenstedtia）、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、厌氧盐杆菌属（Anaerosalibacter）；手工酿造酒醅堆积发酵前共检出7个优势细菌属，包括克罗彭斯特氏菌属、枝芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌属、乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属、短杆菌属、假纤细杆芽孢菌属（Pseudogracilibacillus），这与Li Shuai等[19]研究发现的贵州地区酱香型白酒发酵过程中的优势细菌属为枝芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌属、克罗彭斯特氏菌属和芽孢杆菌属等的结果类似，属于典型的酱香型白酒微生物体系。手工酿造酒醅堆积发酵前特有的优势细菌属为乳杆菌属和假纤细芽孢杆菌属，且乳杆菌属仅在手工 堆积发酵前内层酒醅中检出，而机械酿造酒醅堆积发酵前特有的优势细菌属为厌氧盐杆菌属。其中平均相对丰度最高的克罗彭斯特氏菌属在堆积发酵前机械（33.2%）与手工（34.5%）酿造酒醅中相差不大。克罗彭斯特氏菌属为2种酿造方式酒醅堆积发酵前的主要优势细菌属。
由图2B可知，机械酿造酒醅堆积发酵前检出9个优势真菌属，包括嗜热真菌属（Thermomyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、小囊菌属（Microascus）、曲霉属（Aspergillus）、丝衣霉属（Byssochlamys）、拉森霉属（Rasamsonia）、红曲霉属（Monascus）、毕赤酵母属（Pichia）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）；手工酿造酒醅堆积发酵前检出8个优势真菌属，包括嗜热真菌属、嗜热子囊菌属、丝衣霉属、曲霉属、小囊菌属、拉森霉属、红曲霉属、青霉属（Penicillium），嗜热真菌属在手工酿造的堆积酒醅中的平均相对丰度（33.5%）高于机械酿造的堆积酒醅（27.2%），该结果与Zhang Hongxia等[20]研究结论相似。其中，嗜热真菌属为2种酿造方式酒醅堆积发酵前的主要优势真菌属。
由图2C可知，机械酿造堆积酒醅发酵后共检出12个优势细菌属，包括克罗彭斯特氏菌属、芽孢杆菌属、醋杆菌属（Acetobacter）、施努尔氏菌属（Schnuerera）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、伴生乳杆菌属（Companilactobacillus）、短杆菌属、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、魏斯氏菌属（Weissella）、驹形氏杆菌属（Komagataeibacter）、哺乳动物球菌属（Mammaliicoccus）、热芽孢杆菌属（Caldibacillus）；手工酿造堆积酒醅发酵后共检出9个优势细菌属，克罗彭斯特氏菌属、施努尔氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、轻乳杆菌属（Levilactobacillus）、葡萄球菌属、魏斯氏菌属、伴生乳杆菌属、哺乳动物球菌属。堆积发酵后，不同酿造模式的堆积酒醅细菌群落中克罗彭斯特氏菌属相对丰度均增加（样品T_N除外），且其在手工酿造的堆积酒醅中的平均相对丰度（35.8%）低于机械酿造堆积酒醅中的平均相对丰度（51.3%），在样品T_N中施努尔氏菌属的相对丰度最高（32.4%）。
由图2D可知，机械酿造酒醅堆积发酵后共检出7个优势真菌属，包括接合酵母属（Zygosaccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、曲霉属、拟青霉属（Paecilomyces）、利希海姆霉属（Lichtheimia）、毕赤酵母属、红曲霉属；手工酿造酒醅堆积发酵后共检出8个优势真菌属，包括毕赤酵母属、酿酒酵母属（Saccharomyces）、曲霉属、拟青霉属、利希海姆霉属、复膜孢酵母属、红曲霉属、球拟酵母属（Torulaspora）。手工酿造酒醅堆积发酵后的毕赤酵母属平均相对丰度最高（32.2%），而机械酿造酒醅堆积发酵后的接合酵母属平均相对丰度更高（50.3%）。毕赤酵母属和接合酵母属分别为手工、机械酿造酒醅堆积发酵后的主要优势真菌属。
2.2.3 微生物群落差异分析
采用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后的微生物群落差异。根据LDA值及方差分析结果确定具有显著差异的微生物种类（LDA值＞2.5、P＜0.05），LDA值越大表明物种的富集程度越高，结果见图3。
图3 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后显著差异微生物
Fig 3 Significantly differential microorganisms in the third-round fermented grains before and after stacking fermentation in mechanical and manual brewing processes
机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前共有3个显著差异细菌属（图3A），其中乳杆菌属及岩石芽孢杆菌属（Scopulibacillus）在手工酿造的堆积酒醅中显著富集（LDA值＞2.5、P＜0.05），而醋杆菌属在机械酿造堆积酒醅中显著富集（LDA值＞2.5、P＜0.05），其中乳杆菌属为乳酸的主要生产者，而醋杆菌属为乙酸的主要生产者，两者均为白酒酿造的主要功能菌，其原因可能是，机械酿造酒醅在堆积发酵过程中的酸度更高，因此更耐酸的醋杆菌属更具有优势。机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前共有6个显著差异真菌属（图3B），其中红曲霉属、青霉属、酿酒酵母属在手工酿造酒醅中显著富集（LDA值＞2.5、P＜0.05）。曲霉属、嗜热真菌属、根霉属及毛霉属在机械车间酿造堆积酒醅中显著富集（LDA值＞2.5、P＜0.05）。
由图3C可知，机械酿造第3轮次酒醅堆积发酵后共有3个显著差异细菌属，为醋杆菌属、高温放线菌属、驹形氏杆菌属，而手工酿造酒醅堆积发酵后共有10个显著差异细菌属，其中主要富集的细菌属（LDA值＞4、P＜0.05）为施努尔氏菌属、短杆菌属、轻乳杆菌属。由图3D可知，机械酿造酒醅堆积发酵后共有3个显著差异真菌属，为接合酵母属、裂殖酵母属、哈萨克斯坦酵母属；而手工酿造酒醅堆积发酵后共有12种显著差异真菌属，其中主要富集的真菌属（LDA值＞4，P＜0.05）为毕赤酵母属、酿酒酵母属、青霉属，其中酿酒酵母属和毕赤酵母属会将还原糖发酵为乙醇和CO2[21]，是乙醇发酵的核心功能菌。醋杆菌属、高温放线菌属、驹形氏杆菌属等产酸菌在机械酿造堆积酒醅中显著富集，这与上述理化结果一致，而施努尔氏菌属、毕赤酵母属等功能菌群在传统手工酿造酒醅中显著富集（LDA值＞2.5、 P＜0.05）。结果表明，2种不同酿造方式的堆积酒醅在堆积发酵前的显著差异微生物属较少，而在堆积发酵后显著差异微生物属增加。
2.3 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后的有机酸差异及相关性分析
2.3.1 有机酸含量差异
堆积过程的非挥发性有机酸能减少白酒的刺辣感，增加醇厚度，同时影响酒醅酸度，改变酒醅微生物群落结构[11]，同时还是最终酒体香气挥发物的前体物质[22]。由表2可知，不同酒醅中共定性出9种有机酸，分别为草酸、酒石酸、甲酸、L-苹果酸、柠檬酸、丁二酸、丙酸、乳酸、乙酸。其中，乳酸含量（21.77～42.57 mg/g）最高；乙酸（10.18～19. 28 mg/g）、丙酸（3.81～14.47 mg/g）、 丁二酸（3.70～6.53 mg/g）和甲酸（2.25～3.79 mg/g） 含量较高，这5种酸为第3轮次酒醅堆积发酵前后的主要有机酸，其中，乳酸提供绵长、柔和的酸味，是形成乳酸乙酯的关键前体物质[23]，而乙酸是形成乙酸乙酯的关键前体物质[24]，这2种酯类物质在决定白酒风味方面起重要 作用[25]。
表2 机械与手工酿造第3轮次酒醅堆积发酵前后有机酸含量检测结果
Table2 Determination results of organic acid contents in the thirdround fermented grains before and after stacking fermentation in mechanical and manual brewing processes
mg/g有机酸Q-NQ-ZQ-WH-NH-ZH-W TMTMTMTMTMTM草酸0.31 0.41 0.30 0.33 0.40 0.36 0.28 0.38 0.28 0.41 0.33 0.34 酒石酸1.12 1.50 0.99 1.67 1.43 1.31 1.16 1.44 1.21 1.84 1.42 1.43 甲酸2.50 3.45 2.25 3.79 3.26 3.02 2.32 3.02 2.65 3.69 3.17 2.77 L-苹果酸2.23 2.57 1.86 2.79 2.62 2.16 2.16 2.68 3.13 3.91 2.90 3.07 乳酸25.86 38.89 23.16 42.57 32.16 33.87 24.47 34.67 22.24 35.26 21.77 28.93 乙酸11.53 17.24 10.61 17.45 15.11 19.28 10.18 15.28 10.72 16.26 12.29 12.15 柠檬酸0.25 0.76 0.24 0.88 0.31 0.73 0.26 0.68 0.28 0.73 0.33 0.55 丁二酸4.09 5.99 3.70 6.53 5.27 5.29 3.67 5.20 4.27 6.28 5.44 5.18 丙酸9.46 3.81 8.33 4.21 12.60 3.30 8.94 7.61 7.47 14.47 11.71 11.88
丙酸在手工酿造酒醅堆积发酵前含量较高，堆积发酵后，其含量有所降低；丁二酸含量在2种酿造方式酒醅堆积发酵前后相差不大，其他7种有机酸含量在机械酿造酒醅堆积发酵前后比手工酿造酒醅更高。其中，草酸、酒石酸、甲酸和柠檬酸含量在手工酿造的外层堆积酒醅中含量普遍更高，其可能与裂殖酵母属、醋杆菌属、根霉属等优势菌属产酸有关，其中醋杆菌属在有氧条件下将乙醇转化为乙酸，是酿造体系中乙酸的最主要来 源[26]；根霉属是高产乳酸的菌属[27]；裂殖酵母属在进行乙醇发酵期间，能代谢产生多种有机酸。堆积发酵后乙酸含量有所下降的原因可能是裂殖酵母属通过直接代谢及竞争性抑制的方式降低乙酸[28]。
2.3.2 主要微生物属与有机酸间的相关性
采用Pearson相关性分析与Mantel检验对相对丰度排名前5的细菌属、真菌属及有机酸的相关性进行分析。由图4A、B可知，酒醅堆积发酵前各有机酸与丙酸均呈负相关，除丙酸外，其他有机酸之间均为正相关。乳杆菌属与草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸和柠檬酸呈显著正相关（P＜0.05），表明乳杆菌属对这5种有机酸的生成具有促进作用。其他主要细菌属和有机酸间均无显著相关性，其中，克罗彭斯特氏菌属与乙酸呈负相关，与其他有机酸呈正相关；枝芽孢杆菌属与甲酸、乳酸、乙 酸、丙酸呈正相关，与其他有机酸呈负相关；海洋芽孢杆菌属与除丙酸外的8种有机酸均呈正相关；芽孢杆菌属与丙酸呈正相关，与其他有机酸呈负相关。由图4B可知，嗜热子囊菌属与甲酸、乳酸和乙酸呈显著正相关（P＜0.05），嗜热真菌属与L-柠檬酸呈显著正相关（P＜0.05）。其他真菌属均无显著相关性（P＞0.05），其中，丝衣霉属、曲霉属与甲酸等8种有机酸呈正相关，与丙酸呈负相关，小囊菌属则与甲酸等8种有机酸呈负相关，与丙酸呈正相关。这表明乳杆菌属、嗜热子囊菌属、嗜热真菌属是堆积发酵前主要的产有机酸菌属。
图4 机械与手工车间酿造第3轮次堆积酒醅发酵前后 主要微生物属与有机酸间的相关性
Fig.4 Correlation between dominant microbial genera and organic acids in the third-round fermented grains before and after stacking fermentation in mechanical and manual brewing processes
由图4C、D可知，除L-苹果酸外，其他有机酸之间均为正相关，L-苹果酸与乳酸、乙酸、柠檬酸、草酸负相关，与丁二酸、丙酸、酒石酸、甲酸呈正相关。克罗彭斯特氏菌属、施努尔氏菌属与丙酸呈显著正相关（P＜0.05），芽孢杆菌属与L-苹果酸呈显著正相关（P＜0.05），醋杆菌属与酒石酸、甲酸、丙酸等有机酸呈正相关，葡萄球菌属与L-苹果酸、丙酸等有机酸呈正相关，但均不显著（P＞0.05）。酿酒酵母属、接合酵母属和裂殖酵母属均与丙酸呈显著正相关（P＜0.05）。曲霉属是三羧酸循环中的一个中间产物，与L-苹果酸呈显著正相关（P＜0.05）。L-苹果酸[29]；这可能表明芽孢杆菌属、曲霉属主要通过三羧酸循环进行产酸，毕赤酵母属与乳酸等7种有机酸呈负相关，但结果均不显著（P＞0.05），丙酸与克罗彭斯特氏菌属等5种微生物属有显著相关，表明其是堆积发酵过程中微生物群落结构的关键影响因子。结果表明，堆积发酵后，克罗彭斯特氏菌属、施努尔氏菌属、酿酒酵母属、接合酵母属、裂殖酵母属和曲霉属是堆积发酵后的主要的产有机酸菌属。
3 结 论
本研究通过高通量测序技术与HPLC对机械和手工酿造3轮次堆积发酵的酱香型酒醅微生物群落结构和有机酸进行对比，并对其主要微生物属和有机酸进行了相关性分析。结果显示，机械酿造酒醅水分散失更快，产酸能力更强，而淀粉含量无明显差异；手工酿造酒醅在堆积发酵前的细菌丰富度更高，而机械酿造酒醅真菌丰富度更高，但细菌、真菌多样性无明显差异，手工酿造酒醅在堆积发酵后细菌和真菌的丰富度更高，表明其在堆积发酵过程更有利于微生物的富集；堆积发酵前、后主要优势细菌属均为克罗彭斯特氏菌属和枝芽孢杆菌属，堆积发酵前主要优势真菌属均为嗜热真菌属，堆积发酵后手工、机械酿造酒醅的主要优势真菌属分别为毕赤酵母属和接合酵母属；机械酿造酒醅中醋杆菌属等产酸菌显著富集，而酿酒酵母属等菌群在手工酿造酒醅富集；酒醅样品共定性出9种有机酸，其中乳酸、乙酸、丙酸、丁二酸和甲酸为第3轮次酒醅的主体有机酸，除丙酸、丁二酸，其他7种有机酸在机械酿造酒醅堆积发酵前后均比手工酿造酒醅更高。相关性分析表明，堆积发酵前乳杆菌属、嗜热子囊菌属和嗜热真菌属是主要的产酸菌；堆积发酵后，克罗彭斯特氏菌属等菌属是堆积发酵后的主要的产酸菌属。本研究结果为酱香型白酒机械化酿造工艺的优化提供了理论依据。
[1] ZUO Q, HUANG Y, GUO M. Evaluation of bacterial diversity during fermentation process: a comparison between handmade and machine-made high-temperature Daqu of Maotai-flavor liquor[J]. Ann Microbiol, 2020, 70(1): 14-23.
[2] XI C, WANG Y X, HUA Z, et al.Turning over fermented grains elevating heap temperature and driving microbial community succession during the heap fermentation of sauce-flavor Baijiu[J].LWT-Food Sci Technol, 2022, 172: 114173.
[3] 孙优兰, 骆红波, 王金龙, 等. 酱香型白酒不同轮次基酒风味特征分析[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(17): 343-355.
[4] 谭军辉, 左垚. 简述酱香型白酒新型生产工艺[J]. 酿酒, 2020, 47(4): 32-35.
[5] 曾凡君, 罗胜, 杨刚仁, 等. 高温仿生机制曲在酱香习酒生产中的应用[J]. 酿酒科技, 2016(5): 80-82; 85.
[6] 李琳, 李毅, 詹必胜, 等. 酒醅上甑机器人在酱香型白酒酿造生产中的应用研究[J]. 现代食品, 2023, 29(2): 127-129.
[7] CAI W, XUE Y, WANG Y, et al. The fungal communities and flavor profiles in different types of high-temperature Daqu as revealed by high-throughput sequencing and electronic senses[J]. Front Microbiol,2021, 12: 784651.
[8] 席德州. 酱香型白酒机械化酿造过程中的微生物群落结构研究[D].贵阳: 贵州大学, 2018.
[9] 王欢, 席德州, 黄永光, 等. 酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵细菌菌群结构多样性分析[J]. 食品科学, 2020, 41(2): 188-195.
[10] WEI Y, ZOU W, SHEN C H, et al. Basic flavor types and component characteristics of Chinese traditional liquors: a review[J]. J Food Sci,2020, 85(12): 4096-4107.
[11] 黄俊秋, 王松涛, 张宿义, 等. 酱香白酒第5轮次堆积发酵过程菌群演替与有机酸关联分析[J]. 食品科学, 2025, 46(18): 102-114.
[12] 中国酒业协会. 固态发酵酒醅通用分析方法: T/CBJ 004—2018[S].北京: 中国标准出版社, 2018.
[13] 赵兴蓉, 余松柏, 马龙, 等. 不同产地酱香型白酒有机酸差异分析[J].食品安全质量检测学报, 2024, 15(21): 134-146.
[14] 张霞, 王中凯, 郑佳, 等. 浓香型白酒发酵过程中酒醅理化指标变化规律研究[J]. 酿酒科技, 2021(10): 53-56.
[15] 付庆凯, 陈帆, 孟廷淋, 等. 酱香型白酒不同轮次发酵酒醅差异性研究[J]. 食品与发酵工业, 2025, 51(18): 322-329.
[16] 卫春会, 甄攀, 张兰兰, 等. 汾酒酒醅发酵过程中真菌群落的变化规律[J]. 食品科学, 2021, 42(14): 121-128.
[17] 陈玮玮, 何宗甫, 金娜, 等. 乳扇中真菌菌群多样性分析及酵母菌的分离鉴定[J]. 中国酿造, 2026, 45(1): 72-78.
[18] PAN X, YU J H, ZHANG B, et al. Effects of organic fertilizer replacement on the microbial community structure in the rhizosphere soil of soybeans in albic soil[J]. Sci Rep, 2025, 15(1): 12271.
[19] LI S, HAN Y R, YAN M, et al. Machine learning and multi-omics integration to reveal biomarkers and microbial community assembly differences in abnormal sauce-flavor fermentation of sauce-flavor Baijiu[J]. Foods, 2025, 14(2): 245.
[20] ZHANG H X, TAN Y W, WEI J L, et al. Fungal interactions strengthen the diversity-functioning relationship of solid-state fermentation systems[J]. mSystems, 2022, 7(4): e00401-22.
[21] DELPHINE S, JEANLUC L. Bread, beer and wine: yeast domestication in the Saccharomyces sensu stricto complex[J].Comptes Rendus Biologies, 2011, 334(3): 229-236.
[22] TIAN S F, ZENG W Z, FANG F, et al. The microbiome of Chinese rice wine (Huangjiu)[J]. Curr Res Food Sci, 2022, 5: 325-335.
[23] LIU C J, GONG X W, GUAN Z, et al. liquor flavour is associated with the physicochemical property and microbial diversity of fermented grains in waxy and non-waxy sorghum (sorghum bicolor) during fermentation[J]. Front Microbial, 2021,126: 18458.
[24] YI W, JUN H, DAIXUN W, et al. Research update on the impact of lactic acid bacteria on the substance metabolism, flavor, and quality characteristics of fermented meat products[J]. Foods, 2022, 11(14): 2090.
[25] PEIJIE H, LUJUN L, YING H, et al. Microbial community affects Daqu quality and the production of ethanol and flavor compounds in Baijiu fermentation[J]. Foods, 2023, 12(15): 2936.
[26] ANCUTALILIANA K, RODICA C P, ELENA M, et al. Strategies to improve the potential functionality of fruit-based fermented beverages[J]. Plants, 2021, 10(11): 2263.
[27] KANG J M, HU Y N, DING Z Y, et al. Deciphering the shifts in microbial community diversity from material pretreatment to saccharification process of Fuyu-flavor Baijiu[J]. Front Microbial, 2021, 12: 705967.
[28] SONG Z, DU H, ZHANG M, et al. Schizosaccharomyces pombe can reduce acetic acid produced by Baijiu spontaneous fermentation microbiota[J]. Microorganisms, 2019, 7(12): 606.
[29] RUI L, GONG C, XIANG T, et al. Acetyl-CoA synthetase 2 (ACSS2):a review with a focus on metabolism and tumor development[J]. Dis Oncol, 2022, 13(1): 58.