赤霞珠红葡萄酒是以赤霞珠葡萄为原料，带皮发酵酿造而成的酒精饮料。发酵过程中，葡萄皮中的香气成分、色素、单宁等物质溶入酒液，赋予其独特色泽和风味。目前，消费者对葡萄酒果香浓郁度的需求日益增长，这对传统赤霞珠葡萄酒构成了一定挑战。此外，葡萄酒酿造与贮藏过程中的氧化褐变会严重影响其品质，因此抗氧化是保障酒质的关键环节。二氧化硫（SO2）作为传统抗氧化剂，在稳定葡萄酒色泽和防腐方面发挥重要作用。然而，随着健康意识的增强，SO2的毒副作用已引起高度关注，过量添加还会掩盖葡萄酒的香气品质，产生明显的刺激性和酸涩感，损害口感和品质[1]。因此，当前研究重点是寻找能提升葡萄酒香气与感官品质的安全物质，以替代或减少SO2的使用。
非酿酒酵母——东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis），具有高产酯类物质的特性，其与酿酒酵母混菌发酵时，可产生多种酯类、醇类、酸类等复杂风味化合物，提升香气复杂度，赋予葡萄酒丰富独特的香气层次[2]。研究发现，东方伊萨酵母应用于白酒酿造，可改变酒中香气物质的含量和比例，提升整体风味品质，为酒带来独特且更具吸引力的风味特征[3]，其可有效增强浓香型白酒的果香特征。作用机制是改变酒醅微生物群落结构，增强菌落相互作用从而增加挥发性香气物质[4]。此外，混菌发酵能利用酸类物质和高级醇合成更多的酯类化合物，提高了产品的风味特征[5]，谷胱甘肽是一种重要的天然抗氧化剂，能通过清除自由基防止酚类物质、色素等成分被氧化[6-7]，从而保持葡萄酒的色泽、风味和口感。其还具有保护微生物的作用[8]，在发酵过程中可保护酿酒酵母免受氧化损伤，抑制有害微生物的生长，提高生物稳定性。梁红敏等[9]发现谷胱甘肽对酯、萜、芳香烃类物质也具有保护作用。此外，苹果酸乳酸发酵前谷胱甘肽可以增加赤霞珠葡萄酒中原花青素的含量[10]，这一研究对提升葡萄酒色泽有重要意义。
尽管已有研究探讨了非酿酒酵母（如东方伊萨酵母）在酒类增香方面的潜力，以及谷胱甘肽在抗氧化、护色等方面的应用，但目前尚缺乏将二者协同应用于葡萄酒发酵系统中，评估其对葡萄酒果香风味稳定性的深入研究。尤其缺乏在瓶储陈酿过程中葡萄酒香气物质演变规律与感官品质关联性的系统报道。因此，本研究将东方伊萨酵母与谷胱甘肽联合应用于赤霞珠葡萄酒发酵，并系统评价其在瓶储一年过程中对葡萄酒果香风味的协同保护效应。结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术与定量感官描述分析中的适合项评级法（rate-allthat-apply，RATA），从物质基础与感官体验2个维度验证该工艺在提升葡萄酒香气品质与稳定性方面的优势，为减少或替代SO2的使用提供新的发酵工艺思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠葡萄：2023年采收自北京市密云区。葡萄原料基本理化指标：总糖220 g/L，总氮74.3 mg/L，总酸4.03 g/L，pH 3.85。
含10%谷胱甘肽的酵母抽取物FN502-GH、东方伊萨酵母QC-1 安琪酵母股份有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RC212、果胶酶（≥500 U/mg）EX-V 法国拉曼公司。
正构烷烃C7～C40 美国Sigma公司；氯化钠、无水硫酸钠、碳酸钠（均为分析纯） 福晨（天津）化学试剂有限公司；无水乙醇、二氯甲烷、3-辛醇、庚酸甲酯（内标化合物）（均为分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；2-乙基丁酸（98%） 日本东京化成工业株式会社。
1.2 仪器与设备
ODP 3嗅闻仪、SPME进样器 德国Gerstel公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头 美国Supelco公司；DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890A-5975C GC-MS仪 美国Agilent公司；SX-500高压蒸汽灭菌器 上海天美科学仪器有限公司；HVS-1300-U洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；DHP-9082B电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；CR22N高速冷藏离心机 日本Hitachi公司。
1.3 方法
1.3.1 赤霞珠葡萄酒制备工艺流程及操作要点
工艺流程：葡萄原料挑选→除梗破碎→SO2添加、冷浸渍→澄清（添加果胶酶）→接种→主发酵→皮渣分离→装罐→SO2添加→瓶储→陈酿。
操作要点：
原料预处理：将葡萄原料中霉烂果、僵果、生青果剔除并迅速进行除梗破碎处理，葡萄醪液分为3组，每组3个平行，平均分装在9个容器内，每个容器内3.6 kg葡萄醪。
浸渍澄清：分别向容器中加入30 mg/L SO2，30 min后加入0.05 g/L果胶酶，置于4 ℃冷浸渍24 h。冷浸渍结束后置于室温，待醪液复温后进行酵母接种。
菌种活化：将澄清后的葡萄汁按体积比1∶2与纯水混合稀释，调温至35～40 ℃，向其中添加10%的酵母，水浴15 min后即可实现酵母活化。
接种：接种方式及使用量均按照商品说明进行，依据接种处理将其分为3组。组1：先接种QC-1，发酵48 h后接种酿酒酵母；组2：先接种QC-1，同时加入400 mg/L的FN502-GH，发酵48 h后接种酿酒酵母；组3：只接种酿酒酵母，作为对照组。所有酵母接种量均为200 mg/L。
主发酵：发酵旺盛期每6 h进行压帽、搅拌处理并测量发酵醪液比质量及温度，发酵末期该处理转为每12 h一次。当醪液比质量降至0.995以下[11]并稳定2 d、发酵温度恢复至室温时，判定发酵结束。
装罐：将皮渣压榨与酒液分离，将酒液转入干净储酒罐，向各罐中添加60 mg/L SO2，以抑制杂菌生长，防止过度氧化。置于16 ℃恒温、恒湿的黑暗环境静置2个月，进行酒脚分离，随后转罐至新的储酒容器进行长期贮藏。将组1～3分别编号为BA1、BA2、BA3。
瓶储陈酿：通过12个月的瓶储陈酿实验得到3组陈酿后葡萄酒样（编号为AA1、AA2、AA3）。
1.3.2 香气物质分析
采用HS-SPME-GC-MS测定陈酿前后葡萄酒中香气物质，分析参考Yuan Mengmeng等[12]的方法。
样品前处理：采用顶空自动进样系统，在20 mL顶空瓶中加入2 g NaCl和8 mL样品，设置样品孵育温度为40 ℃，孵育时间15 min，孵育完成后将萃取头在40 ℃条件下萃取30 min，然后插入进样口解吸8 min。
GC-MS条件：进样口温度为250 ℃，载气为氦气（He）（纯度≥99.999%），流速为1.0 mL/min，不分流进样。DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），升温程序为：初始温度为40 ℃，然后以3 ℃/min升温至130 ℃，再以4 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。MSD传输线和离子源温度均为250 ℃。电子电离源，电子能量70 eV，全扫描模式工作，扫描范围为m/z 25～350 ，扫描间隔为0.2 s。
定性定量方法：采用美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）20谱库检索比对保留指数对香气物质进行定性分析。采用内标法进行定量分析，陈酿前样品的内标为3-辛醇，陈酿后样品的内标为3-辛醇和庚酸甲酯。
1.3.3 感官品评
感官品评实验采取适合项评级法[13-14]进行量化评价分析。感官分析研究以经过北京工商大学科学研究伦理委员会审批报备（伦审2023第39号），实验前均已向所有品评人员获取知情许可。正式实验在标准葡萄酒品评实验室中进行，酒样以3位数字随机编号。首先经由专家品评人员进行初步品评（n＝3），讨论产生香气特征词。再由12名具备专业品酒经验的品评人员通过进一步培训组成感官小组进行正式品评，对可感知到的酒样香气特征依据浓郁度进行打分。使用9分结构数尺量化，1～9表示香气浓郁程度逐渐增大。
1.4 数据分析
每个样品重复3次，利用Excel 2010处理数据、绘制香气雷达图并进行方差分析；香气物质种类含量分析、Venn图分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）均使用数据分析工具（https://www.bioinformatics.com.cn）进行；通过XLSTAT 2019进行偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析。
2 结果与分析
2.1 不同处理组赤霞珠葡萄酒香气物质种类对比分析
如图1所示，陈酿前QC-1组、QC-1＋FN502-GH组、对照组分别检测出香气物质分别为82、82、83种，陈酿后分别检测出香气物质47、47、45种，陈酿前后酒样中主要香气物质均为醇类和酯类。经1年瓶储陈酿后，各组香气物质种类均呈下降趋势。
图1 不同处理组陈酿前后赤霞珠葡萄酒样中香气物质种类对比
Fig. 1 Comparison of number of aroma substances in Cabernet Sauvignon wine samples from different treatment groups before and after aging
醇类物质方面，陈酿前，QC-1组与QC-1＋FN502-GH组的醇类物质种类均低于对照组，QC-1组最少。陈酿后，所有组别的醇类物质种类均减少。对照组陈酿后的种类减少最多（较陈酿前少15种），QC-1＋FN502-GH 组次之（少9种），QC-1组差异最小（少4种）。酯类物质方面，陈酿前，QC-1组酯类物质种类最多，而QC-1＋ FN502-GH组与对照组无明显差异。陈酿后，所有组别的酯类物质种类均显著下降，其中，QC-1组减少最多，对照组次之，QC-1＋FN502-GH组差异最小。针对酸、 酮、醚、酚、烯烃类物质，陈酿后，QC-1组与QC-1＋FN502-GH组的5类物质总数无明显差异且高于对照组，其中酸类物质对比陈酿前后QC-1＋FN502-GH组变化较明显，陈酿后减少5种。萜类物质方面，陈酿前QC-1组与QC-1＋FN502-GH组香气物质种类均低于对照组，其中QC-1组最少。而陈酿后，3组酒样均未检测到萜类物质。
综上，对比陈酿前后，QC-1处理组和对照组的葡萄酒样酯类、醇类、萜类物质种类均减少。经QC-1＋FN502-GH联合处理的葡萄酒样，醇类、萜类物质种类也呈减少趋势，其余无明显变化。说明瓶储陈酿过程显著减少了酒体中主要醇类、酯类的种类。然而，与对照组相比，经过QC-1处理、QC-1＋FN502-GH处理后的酒样，其醇类和酯类物质在陈酿过程中的减少幅度更小，更有利于香气物质的保留。原因可能在于：首先，本研究所用东方伊萨酵母具有高产酯类特性，相较于酿酒酵母单独发酵，混菌发酵能生成更多酯类、醇类和酸类等复杂的风味化合物。其次，谷胱甘肽的添加通过清除自由基[15]有效减少部分物质的氧化降解，且能抑制某些关键芳香酯的减少[16]，对葡萄酒中香气物质起到一定的保护作用[6]。
由图2可得，瓶储陈酿后QC-1组酒样中独有香气物质由4种增至5种（新增醇类），这可能源于QC-1独有的代谢途径；QC-1＋FN502-GH组独有香气物质由0增至 3种（均为酯类），可能源于QC-1的代谢物质与谷胱甘肽在陈酿阶段相互作用生成新的代谢产物；对照组独有香气物质由0增至8种（其中5个为酯类，3个为酸类），可能与酿酒酵母独特的代谢路径和陈酿阶段发生的化学反应有关。同时，陈酿后QC-1组和QC-1＋FN502-GH组、QC-1＋FN502-GH组和对照组共有的香气物质种类较陈酿前大幅减少，说明2个对比组的酒样在陈酿时消耗共有的前体物质。综上，陈酿过程可以使各组酒样特有的香气物质种类增加，且酿酒过程中添加谷胱甘肽在维持香气物质稳定性方面具有积极作用。
图2 不同处理组陈酿前（A）、后（B）赤霞珠葡萄酒样香气物质种类Venn图
Fig. 2 Venn diagrams of aroma substances types in Cabernet Sauvignon wine samples from different treatment groups before (A) and after (B) aging
2.2 不同处理组赤霞珠葡萄酒陈酿前后香气物质含量对比分析
2.2.1 陈酿前各处理组酒样香气物质含量对比分析
由图3可知，各酒样中主要香气物质为醇、酯类。陈酿前，QC-1组、QC-1＋FN502-GH组和对照组香气物质总质量浓度分别为8 283.58、6 689.75、6 655.22 μg/L。其中，QC-1组与QC-1＋FN502-GH组酒样的醇类物质质量浓度均高于对照组，分别为3 191.28 μg/L和2 843.47 μg/L，这可能源于在发酵前期非酿酒酵母能够产生大量的糖苷酶类，促进某些醇、酯等香气物质的生成[17]。葡萄酒中高级醇的产量还与葡萄酒中可同化氮源的主要来源——氨基酸密切相关，高级醇可通过酵母的Ehrlich途径代谢氨基酸而产生，而谷胱甘肽有利于维持游离态氮的稳定性[18]，从而促进高级醇的形成[19-20]。QC-1组的酯类物质质量浓度显著高于其他2组（P＜0.05），为4 869.98 μg/L，这得益于东方伊萨酵母具有高产酯类特性[21-22]；QC-1＋FN502-GH组酯类物质质量浓度最低（3 639.20 μg/L），说明谷胱甘肽的添加会导致部分酯类物质含量下降[23]。果酒中的挥发性酸类化合物主要来源于酵母的次级代谢。QC-1组、 QC-1＋FN502-GH组和对照组酸类物质质量浓度分别为136.26、145.13、161.37 μg/L，3组酸类物质含量差异不大，这与Xu Junnan等[24]的研究结果一致，该研究在苹果酒中添加了谷胱甘肽，发现其含量对挥发性酸类物质没有显著影响，不会对果酒香气产生消极作用。此外，QC-1组与QC-1＋FN502-GH组酒样中新增醚类和酚类物质，而对照组未检测到；其他物质含量无明显差异。这表明酒样经QC-1、QC-1＋FN502-GH分别处理后，两者主要影响葡萄酒中醇、酯类物质的含量。
图3 不同处理组陈酿前后赤霞珠葡萄酒样中香气物质含量对比
Fig. 3 Comparison of aroma substance contents in Cabernet Sauvignon wine samples from different treatment groups before and after aging
2.2.2 陈酿后各处理组酒样香气物质含量对比分析
由图3可知，和陈酿前结果类似，各酒样中主要香气物质为醇、酯、酸类。陈酿后，QC-1组、QC-1＋FN502-GH组和对照组香气物质总质量浓度分别为7 006.79、6 637.16、5 951.08 μg/L。其中，陈酿后醇类物质在QC-1＋FN502-GH组中质量浓度最高、QC-1组次之、对照组最低，分别为4 199.38、4 086.43、3 997.65 μg/L；酯类物质在QC-1组中质量浓度最高、QC-1＋FN502-GH组次之、对照组最低，分别为2 836.04、2 323.69、1 392.33 μg/L。己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在QC-1组中的保留率分别为87.3%、82.7%、34.3%，QC-1＋FN502-GH组中分别为52.5%、76.5%、69.0%，对照组中分别为82.5%、55.5%、29.9%，QC-1组在3种酯类上的保留率均高于对照组， QC-1＋FN502-GH组在辛酸乙酯和癸酸乙酯上的保留率高于对照组；3组酒样酸类物质质量浓度分别为76.82、102.09、539.14 μg/L，其中对照组含量明显高于2个处理组，表明其在陈酿过程中受到的氧化作用最明显，其他2组变化不大说明加入东方伊萨酵母和谷胱甘肽提高了酒样整体的抗氧化活性，抑制过度氧化。与陈酿前相比，陈酿后各组酒样香气物质总含量均降低，但QC-1＋FN502-GH组下降幅度最小。说明谷胱甘肽有效缓解了香气物质进行氧化水解等反应，使其在长期保存中趋于稳定。
上述结果均表明东方伊萨酵母高产酯类的特征与谷胱甘肽的抗氧化保护作用[6,17]，且QC-1＋FN502-GH处理组在维持醇、酯类物质含量稳定性和抑制过度氧化方面表现出最佳效果，证实了协同发酵在提升葡萄酒香气物质稳定性方面的优势。
2.3 发酵工艺与瓶储陈酿对赤霞珠葡萄酒香气物质的影响
对陈酿前后不同处理组葡萄酒香气物质含量进行PCA。由图4可知，PC1和PC2的方差贡献率分别为86.4%和7.5%，累计方差贡献率为93.9%，表示该模型可以反映样品中大部分信息。陈酿前的酒样主要分布于PC1的负半轴，3组样本组内及组间分布较分散，且QC-1组与QC-1＋FN502-GH组分布较远，说明3组香气物质含量差异较 大；陈酿后的酒样主要分布于PC1的正半轴，3组样本组内聚集，但各组间距离较远，说明3组样品组内物质含量分布均匀且组间存在较大差异。综上，不同发酵工艺和瓶储陈酿过程均对葡萄酒样的香气物质造成了不同程度的影响，且陈酿这一因素对其影响强度更高。
图4 不同处理组赤霞珠葡萄酒样陈酿前后香气物质含量PCA得分图
Fig. 4 Principal component analysis score plot of aroma substance content in Cabernet Sauvignon wine samples from different treatment groups before and after aging
2.4 赤霞珠葡萄酒香气物质与感官特性相关性分析
2.4.1 感官评价
由图5可知，陈酿前，QC-1组、QC-1＋FN502-GH组和对照组酒样香气总体浓郁度评分分别为6、6.3、6.7分。QC-1组草莓、蜜瓜香气的浓郁度、QC-1＋FN502-GH组蓝莓、水果糖香气浓郁度均显著高于对照组（P＜0.05），表明单独使用东方伊萨酵母或其与谷胱甘肽协同处理，均能有效提升陈酿前葡萄酒的果香风味强度。陈酿后各组酒样的香气总体浓郁度均高于陈酿前。3组香气总体浓郁度评分分别为7.4、7.8、8.1分。其中，QC-1组玫瑰、红醋栗、树莓、蓝莓香气的浓郁度、QC-1＋FN502-GH组玫瑰、樱桃香气浓郁度均显著高于对照组（P＜0.05），特别是蓝莓香气，陈酿前其浓郁度在QC-1＋FN502-GH组中显著高于对照组，而陈酿后则在QC-1组中显著高于对照组（P＜0.05）。这一现象表明，QC-1组与QC-1＋FN502-GH组在陈酿过程中能更好地维持果香风味的稳定性。QC-1＋FN502-GH组在发酵阶段对蓝莓香气的提升作用更为突出，而单一酵母处理QC-1组则在陈酿阶段对蓝莓香气的保持表现出更显著的效果。
图5 不同处理组陈酿前后赤霞珠葡萄酒样香气感官雷达图
Fig. 5 Aroma sensory radar diagram of Cabernet Sauvignon wine samples from different treatment groups before and after aging
综上可知，感官结果与香气物质的分析结果相一致。从风味组学的角度来说，感官浓郁并非与香气物质的总含量直接相关，而是取决于关键香气物质含量与阈值的相对作用[25-26]。对照组较高的总体浓郁度可能源于某种含量较高但感官贡献单一的物质，而处理组则是通过非酿酒酵母特殊代谢路径与谷胱甘肽抗氧化作用单独或协同的保留并强化了多种关键性果香物质，这些物质通常具有较低的阈值，并且对葡萄酒的复杂性与典型性做出很大贡献。因此，尽管陈酿导致所有组别的香气物质总含量下降，但处理组成功的将酒中香气推向更复杂、稳定、愉悦的风格，这再次印证了其在葡萄酒果香风味稳定方面的潜在价值。
2.4.2 PLSR分析
PLSR分析是一种采用偏最小二乘法进行多因变量对多自变量的回归建模。利用PLSR方法分析本研究中陈酿前后不同处理组的香气物质与感官特性之间的相关性，结果见图6。
图6 不同处理组赤霞珠葡萄酒样陈酿前（A）、后（B）PLSR载荷图
Fig. 6 PLSR loadings of Cabernet Sauvignon wine samples from different treatment groups before (A) and after (B) aging
由图6A可知，陈酿前QC-1组与对照组香气物质均呈现明显的聚集模式，QC-1组酒样中苯甲醇、月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、正己醇等香气物质与蜜瓜、草莓、青草、青椒等香气特征呈正相关；对照组酒样乙酸异丁酯、正丁醇、3-羟基丁酸乙酯、橙花醇等香气物质与玫瑰、香蕉、树莓、黑醋栗、奶油等香气特征呈正相关。QC-1＋FN502-GH组香气物质分布较分散，2,3-丁二醇、琥珀酸二乙酯、大马士酮、3-辛酮与红醋栗、香草、蓝莓、水果糖、樱桃等香气特征呈正相关。
由图6B可知，对照组酒样香气物质呈现聚集模式，其含有的正丁醇、3-辛酮、乙酸异戊酯、苯甲醇、正辛酸甲酯等物质与水果糖、奶油、蜜瓜等香气特征呈正相关；QC-1组酒样的乙酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯、正壬醇等香气物质与树莓、青椒、蓝莓、红醋栗等香气特征呈正相关，QC-1＋FN502-GH组酒样的己酸丁酯、2-苯乙醇、正己醇等香气物质与玫瑰、樱桃、香蕉、黑醋栗、香草、草莓等香气特征呈正相关。
3 结 论
本研究以赤霞珠葡萄为原料，设置东方伊萨酵母单独发酵（QC-1组）、东方伊萨酵母+谷胱甘肽协同发酵（QC-1＋FN502-GH组）及酿酒酵母为对照3组发酵工艺制备葡萄酒。通过瓶储陈酿1年前后的对比，结合HS-SPME-GC-MS分析与感官定量描述法，探究不同发酵工艺下葡萄酒香气物质的变化规律。结果表明，陈酿后QC-1组、QC-1＋FN502-GH组和对照组分别检测到香气物质47、47、45种，以醇类和酯类为主。经QC-1处理、QC-1＋FN502-GH处理的酒样，其醇类和酯类物质在陈酿过程中减少幅度更小，更有利于香气物质的保留，说明谷胱甘肽的抗氧化保护作用显著延缓酯类物质如乙酸乙酯、丁酸乙酯的氧化降解。陈酿过程可以使各组酒样特有的香气物质种类增加。PCA结果显示陈酿后3组酒样的香气物质存在差异，香气总体浓郁度均高于陈酿前。陈酿后，QC-1组酒样聚集的树莓、青椒、蓝莓、红醋栗等香气特征与乙酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯、正壬醇等香气物质呈正相关，QC-1＋FN502-GH组酒样聚集了玫瑰、樱桃、香蕉、黑醋栗、香草、草莓等香气特征与己酸丁酯、2-苯乙醇、正己醇等香气物质呈正相关。该研究从非酿酒酵母与抗氧化物质协同发酵层面揭示了协同发酵对赤霞珠果香风味的稳定与增强，为赤霞珠葡萄酒果香风味稳定性的研究提供了创新思路。
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