浓香型白酒是我国传统白酒中的典型代表之一，以其独特的典型风味特征而被消费者广泛喜爱[1]。一般来说，浓香型白酒是以一种或多种粮食（如高粱、大米、玉米、糯米和小麦等）为原料，在封闭泥窖池中经多种微生物混合协同发酵酿造而成[23]，研究表明，浓香型白酒的典型代表五粮液酒体中含有3 000多种风味化合物[4]，高级醇是其中重要的风味化合物之一，对酒体气味和口感有显著影响。适当含量的高级醇可赋予酒体特殊的香味[5]，如异戊醇能赋予酒体一定的甜味、苦味和涩味，β-苯乙醇可以赋予酒体一定的玫瑰香味和蜂蜜风味。而且随着贮藏时间的延长，酒体中的一些高级醇也会与酸发生酯化反应生成酯类，使酒体芳香更浓郁，酒香更舒适[6-7]。但由于高级醇在人体内的氧化速度比乙醇慢，停留时间长，过高的含量会造成一定的副作用[8-9]，如异戊醇含量过高时，饮酒后会使神经系统充血，产生头痛、恶心、呕吐等不适反应，是引起白酒饮后“上头”的主要原因之一[10-11]；异丁醇过多时会加重苦味，对人体的眼、鼻产生刺激作用[12-13]。因此，高级醇的含量需要控制在合理的范围内。
在浓香型白酒的发酵过程中，高级醇的合成途径主要有2条，分别为糖代谢合成途径（Harris途径）和氨基酸代谢途径（Ehrlich途径）[14-17]。氨基酸对白酒高级醇的合成有重要的影响。首先，胞外游离氨基酸通过氨基酸转运酶运输到酵母细胞内。然后，在氨基转移酶和脱羧酶的催化下，氨基酸进一步转化为相应的醛类物质。最后，醛类物质在多种醇脱氢酶的催化下转化为相应的高级醇，并通过简单渗透作用释放到细胞外[18]。当游离氨基酸含量较高时，酵母菌主要利用Ehrlich途径合成高级醇，而游离氨基酸含量较低时，主要利用Harris途径合成高级醇[19]。侯阳阳等[20]在葡萄酒发酵过程中发现添加丙氨酸（Ala）和缬氨酸（Val）能显著增加异丁醇的含量。李智慧等[21]发现在黄酒酿造中添加缬氨酸（Val）能促进异丁醇和异戊醇的合成。此外，窖池内微生物还可以利用氨基酸为氮源合成风味物质，发酵培养基中氨基酸的缺乏将影响微生物糖酵解的代谢流，并进一步影响乙醇、酯类和其他风味化合物的生物合成[21]。虽然许多研究报道了中国白酒发酵中高级醇产生的影响因素，但关于白酒发酵过程中高级醇与氨基酸的互作关系的相关研究仍较少[22-24]。
本研究旨在研究2种不同窖龄的窖泥窖池发酵过程中氨基酸和高级醇合成之间的关系。首先测定2口不同窖龄窖池的上、中、下3个层次糟醅中不同发酵时间的氨基酸含量和高级醇含量变化情况，并进一步分析其相关性，为揭示浓香型白酒发酵过程中高级醇与氨基酸的互作关系提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糟醅样品取自宜宾当地某公司以5种粮食为原料进行酿造20年（JC20）、40年（JC40）窖池的上层（U）、中层（M）和下层（D）样品。
4-辛醇、甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Merck公司；氢氧化钠、磷酸氢二钠、无水乙醇（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；氨基酸分析试剂盒 美国安捷伦公司。
1.2 仪器与设备
7890A气相色谱仪联用5977B惰性气体离子化质谱仪、1100系列高效液相色谱系统（配备荧光检测器（fluorescence detector，FLD））、HP-INNOWAX色谱柱（60 m×0.32 mm，0.5 μm） 美国安捷伦公司；5804R离心机 德国Eppendorf公司；DVB/CAR/PDMS纤维萃取头（2 cm，50/30 μm） 美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 样品收集
使用中空圆柱形专业采样器从窖池的上层、中层和下层3个位置采集样本，取样时间点为发酵第0、5、10、15、20、27、34、41、48、55、69天，每个位置采集5个点，采样后立即装入无菌采样袋并充分混合，随后迅速保存在-80 ℃冰箱待用。
1.3.2 高级醇含量分析
前处理条件：准确称取1 g糟醅样品置于顶空瓶中，加入内标4-辛醇（质量浓度约为100 mg/L），立即拧紧瓶盖，混匀待测。采用7890A气相色谱仪联用5977B惰性气体离子化质谱仪进行高级醇含量检测分析。使用DVB/CAR/PDMS纤维萃取头进行萃取。萃取前将样品在50 ℃下加热平衡5 min，随后在同一温度下进行45 min萃取。随后将萃取头置于气相色谱进样口进行热脱附（250 ℃，不分流，持续5 min）。
色谱条件：采用HP-INNOWAX色谱柱 （60 m×0.32 mm，0.5 μm）。检测过程使用氦气作为载气（恒定流量1 mL/min），升温程序为：初始阶段 40 ℃保持3 min，随后以8 ℃/min速率升至250 ℃，最后恒温保持5 min。
质谱条件：采用电子电离模式，电离能量70 eV，离子源温度250 ℃。化合物表征采用全扫描分析，扫描检测范围m/z 35～350。
定性定量方法：使用美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）数据库进行比对（匹配度≥85）。根据保留时间定性，根据内标法定量。
1.3.3 氨基酸含量分析
准确称取5 g糟醅样品，加入15 mL 30%乙醇溶液，室温涡流5 min，12 000 r/min离心10 min。取上清液经0.2 μm孔径膜过滤后，采用高效液相色谱系统进行分析。
色谱条件：Eclipse AAA色谱柱（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流动相A：甲醇∶乙腈∶水（45∶45∶10，V/V），流动相B：40 mmol/L Na2HPO4，用10 mol/L的NaOH调pH值至7.8。梯度洗脱条件：0～2 min，100% B；2～18.1 min：100%～43% B；18.1～18.6 min，43%～0% B；18.6～22.3 min，0% B；22.3～26 min，0%～100% B。
FLD条件：0 min，激发波长/发射波长为340 nm/450 nm，增益10 nm；15 min，激发波长/发射波长为266 nm/305 nm，增益9 nm。
进样程序：吸取2.5 μL 0.4 mol/L硼酸钠缓冲液，吸取0.5 μL待测样品，在清洗口将3.0 μL混合液按最大速度混合2次；等待0.5 min，针头空洗；吸取0.5 μL的10 mg/mL邻苯二甲醛衍生试剂，在清洗口将3.5 μL混合液按最大速度混合6次；针头空洗；吸取0.5 μL 2.5 mg/mL 9-芴甲氧羰基衍生试剂，在清洗口将4.0 μL混合液按最大速度混合6次；针头空洗；吸取32 μL缓冲液，在清洗口将36 μL混合液按最大速度混合2次；进样；柱温为30 ℃，流速为2 mL/min。
定性定量方法：根据保留时间定性；根据游离氨基酸标准曲线进行定量。
1.4 数据处理与统计分析
使用Graphpad Prism 9对高级醇和游离氨基酸含量进行单因素方差分析和聚类分析并绘图，使用R语言计算Pearson相关系数。
2 结果与分析
2.1 浓香型白酒糟醅发酵过程高级醇含量变化
本研究检测了2口不同窖龄的浓香型白酒窖池发酵过程糟醅中高级醇含量变化，结果表明高级醇以异丁醇和异戊醇为主，其他如正丙醇、正丁醇等含量极低，因此本研究主要分析异丁醇和异戊醇含量的变化。由图1可知，在整个发酵过程中，相同发酵时间下，窖龄较长的40年窖池糟醅（JC40）的高级醇含量明显低于窖龄较短的20年窖池（JC20）（P≤0.05），这表明较长窖龄窖池酿造过程能产更少的高级醇，其生产的基酒口感更为净爽，符合“窖池越老酒越好”的酿造工艺典型特征[1,25]。同时，2个窖池的下层糟醅的高级醇含量均低于上层和中层糟醅，因为高级醇前期主要是由微生物经Harris途径合成，因此可以推测，发酵过程中下层糟醅在重力的作用下逐渐压紧压实，其中氧气迅速被微生物耗尽，厌氧微生物增殖较快，能抑制高级醇的合成。
图1 浓香型白酒发酵过程中糟醅异丁醇（A）及异戊醇（B）含量变化
Fig. 1 Changes of isobutanol (A) and isopentanol (B) contents in Zaopei of strong-flavor Baijiu during the fermentation process
高级醇主要合成期是在发酵前期，但在发酵过程中异戊醇和异丁醇表现出不同的增长规律。由图1A可知，异丁醇含量在发酵5～20 d迅速升高，此后随发酵进行呈现先降低再增加后降低的规律。其中，JC20窖池异丁醇最高含量是发酵第20天上层糟醅测得，为（14.98±1.84）mg/kg，JC40窖池异丁醇最高含量是发酵第41天中层糟醅测得，为（6.96±0.15）mg/kg。 在发酵后期（55～69 d），2个窖池的异丁醇含量均迅速下降，发酵结束时，JC20窖池上中下层糟醅中异丁醇含量分别为（7.11±1.32）、（4.91±0.18）、 （4.48±0.32）mg/kg，JC40窖池中含量分别为（3.55±0.33）、（2.33±0.28）、（2.29±0.27）mg/kg。由图1B可知，在2个窖池发酵中，异戊醇含量均在发酵第5～10天迅速升高，且都在第10天达到最高值，JC20和JC40窖池中含量分别为（46.42±3.13）、（11.93±0.04）mg/kg。此后随发酵进行呈现先降低再增加后降低的规律。发酵结束时，JC20窖池上中下层糟醅中异戊醇含量分别为（40.38±1.49）、（37.81±0.59）、（22.92±1.63）mg/kg，JC40窖池分别为（8.02±0.18）、（5.04±0.63）、（3.06±0.02）mg/kg。高级醇在酶的作用下可转化为醛或酸[26]或与酸类物质形成酯类[27]，且乳酸菌能够降低高级醇的含量[23]。因此，微生物和酶的作用可能使得高级醇含量下降。整体来看，在发酵结束时，2个 窖池的异戊醇含量均高于异丁醇含量，且下层糟醅的异戊醇含量和异丁醇含量均低于中层和上层糟醅。
2.2 浓香型白酒糟醅发酵过程中游离氨基酸含量变化
由图2可知，上层、中层、下层糟醅中的17种游离氨基酸含量在发酵第0～10天均迅速升高，之后大部分氨基酸含量出现短暂降低后再次升高，推测其原因是因为此阶段糟醅中的微生物大量增殖，蛋白质在芽孢杆菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物和酶的作用下，水解产生大量的游离氨基酸[22]。在JC20和JC40窖池发酵过程中，赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）的最高含量出现在发酵中期，然后再缓慢减少，其发酵后期的合成作用不明显。脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）的含量随发酵的进行整体升高，发酵结束时，大部分氨基酸在各层次糟醅中的含量均显著高于 第0天，这说明在整个发酵过程，这些氨基酸的合成作用大于降解作用。天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、丝氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、蛋氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、组氨酸（His）的含量在两个窖池发酵第55～69天时显著升高，这可能是因为在发酵后期，与氨基酸合成相关的厌氧微生物代谢加强。在JC40窖池的发酵过程中，其中、下层糟醅的精氨酸（Arg）、 天冬氨酸（Asp）、赖氨酸（Lys）、苏氨酸（Thr）在中后期含量下降迅速，其含量低于入窖时的含量，推测窖龄较长窖池的窖泥中可能存在着更多能降解这些氨基酸的微生物，其在发酵的中后期能够降解和利用这些氨基酸。
图2 白酒发酵过程中糟醅的17种游离氨基酸含量变化
Fig. 2 Changes of 17 free amino acids contents in Zaopei during Baijiu fermentation process
由图2可知，有11种氨基酸含量的最高点都出现在同一天，说明不同窖龄窖池的发酵趋势基本一致，其中共有8种氨基酸的最高含量都出现在第69天（即发酵终点），表明这些氨基酸含量在发酵后期仍处于增长趋势。在2个窖池的发酵中，精氨酸（Arg）含量最高点均出现在下层糟醅，含量分别为（0.43±0.04）mg/kg（JC20，第10天）、（1.01±0.03）mg/kg糟醅（JC40，第5天）。
上述发现表明，在浓香型白酒发酵过程糟醅中有 16种游离氨基酸含量在发酵结束时实现了积累，表明其合成作用大于分解代谢作用，而精氨酸（Arg）含量在不同窖池不同层次糟醅呈现出不同规律：在JC20中层和JC40中、下层表现为降低，其他层次糟醅表现为增加，该变化的内在原因需进一步研究。
2.3 糟醅发酵过程中游离氨基酸与异丁醇、异戊醇的相关性分析
为进一步解析浓香型白酒糟醅在发酵过程中异丁醇、异戊醇与游离氨基酸之间的关系，利用Pearson相关系数计算发酵过程中异丁醇、异戊醇与游离氨基酸之间的相关性并绘制热图，结果见图3。
图3 异丁醇、异戊醇与游离氨基酸相关性分析热图
Fig. 3 Heatmap of the correlation analysis between isobutanol isopentanol and free amino acids
在JC20窖池发酵过程中（图3A、C、E），上中下 3个层次糟醅中与异丁醇合成呈显著相关及极显著相关的氨基酸数量分别为11、15、15种，说明不同层次糟醅的氨基酸对异丁醇合成的影响存在着一定的差异。JC20窖池各层次糟醅中的脯氨酸（Pro）和赖氨酸（Lys）与异丁醇都存在极显著正相关（P≤0.01），且中层糟醅有7种氨基酸与异丁醇存在极显著正相关（P≤0.01），其数量远大于上层和下层（均为3个），推测是因为这些氨基酸在窖池中层糟醅合成较为旺盛。与异丁醇不同的是，JC20窖池3个层次糟醅中与异戊醇合成呈显著相关及极显著相关的氨基酸数量分别为16、16、17种，且显著相关（P≤0.05）和极显著相关（P≤0.01）的数量基本持平，说明异戊醇的合成与多种氨基酸密切相关。在3个层次糟醅中，有5种氨基酸（丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro））都与异戊醇合成呈极显著相关（P≤0.01）。
在JC40窖池发酵过程中，下层糟醅中与异丁醇合成呈显著相关及极显著相关的氨基酸数量最多，为15种（图3F），上层和中层分别为12种（图3B）和10种（图3D），且仅有脯氨酸（Pro）呈极显著负相关（P≤0.01）。与JC20不同的是，JC40窖池各层次糟醅中与异戊醇呈极显著相关（P≤0.01）的氨基酸数量分别为1、0、1种，远低于JC20的8、8、8种。此外，冬氨酸（Asp）与JC40窖池中层糟醅异丁醇和中、下层糟醅异戊醇呈显著负相关（P≤0.05），与下层糟醅异丁醇呈极显著负相关（P≤0.01），精氨酸（Arg）与JC40窖池中、下层糟醅异丁醇和中层糟醅异戊醇呈显著负相关（P≤0.05），进一步说明不同窖龄窖池发酵过程中糟醅氨基酸对异戊醇的影响存在差异。
酵母代谢中特定的氨基酸可以通过氨基酸降解代谢途径形成特定的高级醇，如亮氨酸（Leu）生成异戊醇、缬氨酸（Val）生成异丁醇[28]。本研究结果显示，2个窖池上层糟醅缬氨酸（Val）与异丁醇并不相关，JC40窖池中层糟醅亮氨酸（Leu）与异戊醇并不相关，推测是氨基酸间存在相互转化，导致高级醇与相应氨基酸相关性不强。这进一步说明白酒发酵过程中高级醇的合成是一个多菌协同的复杂的生物转化过程，解析混合微生物发酵过程中高级醇合成规律有待进一步深入研究。
3 结 论
本研究测定了2口不同窖龄窖池的3个层次糟醅中不同发酵时间的异丁醇、异戊醇含量和游离氨基酸含量，结果表明，两口窖池中的异丁醇、异戊醇主合成期是在发酵前期，且下层糟醅含量最低。发酵结束时各层次糟醅中异戊醇含量均显著高于异丁醇含量，且窖龄较长的窖池（JC40）合成的异丁醇、异戊醇含量均低于窖龄较短窖池（JC20）。16种氨基酸含量在发酵前期普遍较低，随发酵进行含量逐渐增加，精氨酸含量在JC20中层和JC40中、下层表现为降低。相关性分析结果显示，不同窖龄窖池糟醅氨基酸与异丁醇、异戊醇的相关性存在明显差异，窖龄较短窖池与异戊醇合成呈正显著相关的氨基酸数量要远多于窖龄较长窖池。本研究对优化浓香型白酒发酵过程中高级醇的生成具有重要的参考意义。
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