酸度是葡萄酒关键的感官特征，对葡萄酒的品质和风味的塑造有重要影响。适宜的酸度能给葡萄酒提供平衡和清爽的口感，但酸度过低又会使葡萄酒的口感松弛且平淡，降低葡萄酒的感官品质[1]。葡萄酒的酸度主要取决于其有机酸的含量和组成，这些化合物主要包括源自葡萄浆果的酒石酸、苹果酸和柠檬酸以及在乙醇发酵与苹果酸-乳酸发酵过程中形成的琥珀酸、丙酮酸、乳酸和乙酸等[2]。这些有机酸不仅为葡萄酒提供适宜的酒体和平衡的酸度，还能通过与醇类物质的酯化反应生成各种芳香酯类化合物，从而显著提升葡萄酒香气的复杂性。需要注意的是，近年来全球气候变暖导致温暖产区葡萄成熟周期显著缩短，这直接引发葡萄果实含糖量增加、有机酸积累不足，最终造成葡萄酒产品酸度过低[3]，这种情况在我国西北部葡萄酒产区（包括新疆、宁夏和甘肃产区）尤为突出。因此，对我国西北产区的低酸度葡萄酒进行增酸已成为提升产品品质的重要手段，也是亟需解决的一个产业问题。目前，最常见的葡萄酒增酸方法是外源添加食品级酒石酸、柠檬酸或苹果酸，但物理增酸会降低葡萄酒的化学稳定性，且增加企业的成本[4-5]。
越来越多的研究表明，接种具有产酸特性的非酿酒酵母是一种经济、有效且能增加酒体稳定性的增酸方式。在众多非酿酒酵母中，耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans）凭借其独特的生物酸化能力，被誉为“生物增酸剂”，该菌株主要通过高表达的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）催化丙酮酸（由葡萄糖和果糖转化而来）向L-乳酸高效转化（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）仅生成微量的D-乳酸）。耐热克鲁维酵母的乳酸产量具有菌株依赖性，通常在0.2～12 g/L[6]，乳酸的口感柔和、性质稳定，对葡萄酒的新鲜度和生物与颜色稳定性也有着积极的贡献[7]。由于耐热克鲁维酵母只具有中等发酵能力，单独接种难以完成乙醇发酵，因此需要与酿酒酵母进行混合接种。除了影响酸度，耐热克鲁维酵母与酿酒酵母混合发酵还会影响其他主代谢产物（乙醇、甘油和乙酸）以及香气物质（高级醇和酯类）的合成，但目前所报道的结果并不一致[8-10]，这与耐热克鲁维酵母菌株以及与酿酒酵母的接种方式（顺序和同时）有关。除此之外，特定耐热克鲁维酵母与不同酿酒酵母的适配性也是一个重要影响因素，即某一非酿酒酵母菌株与不同的酿酒酵母混合接种发酵对葡萄酒相关品质的影响也是有差异的，这一结论在很多混合发酵的研究中都得到了证实[11]，其原因主要是不同酿酒酵母的基因型具有差异，导致其表型代谢特征不同，当其与非酿酒酵母混合接种这种差异就会被进一步扩大：由于互作方式的不同，如竞争营养物质能力的差异、分泌代谢产物（酶）的差异等；除了影响自身代谢，更为重要的是影响非酿酒酵母的生长与代谢，最终造成葡萄酒感官品质的差异，包括主代谢产物和香气物质等[12]。在课题组前期研究中，已成功分离到一株耐热克鲁维酵母LT1（专利号ZL201910237439.9），该菌株展现出很好的生理耐受性（包括耐受高糖、低温和乙醇胁迫），同时兼具高产乳酸、低产挥发酸、高效絮凝性和快速起酵能力，与酿酒酵母混合接种可以实现有效增酸，并产生理想的水果类香气（葡萄柚和芒果），目前该菌株已开发为商业发酵菌剂CVE-7，并在新疆、甘肃、宁夏等葡萄酒企业实现规模化应用，成功替代了传统的物理增酸工艺[7,13]。但有企业反馈CVE-7的增酸幅度有时难以控制，仅根据高幅度增酸使用顺序接种，低度增酸采用同时接种的方式难以实现精准的增酸目标。这可能与不同酒厂所使用的酿酒酵母菌株不同有关，即不同酿酒酵母与CVE-7具有增酸适配性。为了助力CVE-7产业应用，使本土酵母菌更好地服务产业，本研究以菌株CVE-7为研究对象，与目前使用广泛的4株商业酿酒酵母（包括红佳酿、AWRI 796、D254和ES488）进行混合接种发酵（同时接种和顺序接种），研究菌株CVE-7与不同酿酒酵母混合发酵时的增酸和产香特性，确定适宜的酵母组合，以期为CVE-7在我国西北产区的产业应用提供技术支持和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酿酒酵母红佳酿（编号SCH）、酿酒酵母ES488（编号SCS） 意大利Enartis公司；酿酒酵母AWRI 796（编号SCQ） 澳大利亚Maurivin公司；酿酒酵母D254（编号SCD） 法国Lallemand公司；耐热克鲁维酵母CVE-7（编号LT1） 安琪酵母股份有限公司。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：1.0%酵母浸提物，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖，115 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
合成葡萄汁培养基（MS300）：葡萄糖100 g/L，果糖100 g/L，苹果酸5 g/L，柠檬酸0.5 g/L，酒石酸3 g/L；磷酸二氢钾750 mg/L，七水硫酸镁250 mg/L，硫酸钾500 mg/L，氯化钠200 mg/L，二水氯化钙155 mg/L，一水合硫酸镁4 mg/L，硫酸锌4 mg/L，二水合钼酸钠1 mg/L，六水合氯化钴0.4 mg/L，五水硫酸铜1 mg/L，硼酸 1 mg/L，碘化钾1 mg/L；肌醇20 mg/L，烟酸2 mg/L，盐酸吡哆醇0.25 mg/L，泛酸钙1.5 mg/L，盐酸硫胺素 0.25 mg/L，生物素0.003 mg/L，氯化铵460 mg/L， L-谷氨酰胺505.3 mg/L，L-苏氨酸75.9 mg/L，L-亮氨酸48.4 mg/L，L-精氨酸374.4 mg/L，L-色氨酸179.3 mg/L， L-丙氨酸145.3 mg/L，L-谷氨酸120.4 mg/L，L-丝氨酸 78.5 mg/L，L-天冬氨酸44.5 mg/L，L-缬氨酸44.5 mg/L，L-苯丙氨酸37.9 mg/L，L-异亮氨酸32.7 mg/L，L-组氨酸32.7 mg/L，L-蛋氨酸31.4 mg/L，L-酪氨酸18.3 mg/L，L-甘氨酸18.3 mg/L，L-赖氨酸17.0 mg/L，L-半胱氨酸 13.1 mg/L，L-脯氨酸612.6 mg/L。使用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至3.5，随后使用（25 mm×0.22 μm）滤膜进行过滤除菌[14]。
葡萄糖、果糖（分析纯） 北京拜尔迪生物技术有限公司；浓硫酸、甘油、乙醇（色谱纯） 北京化学试剂研究所有限责任公司；磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵等（分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Sorvall Legend Micro 17离心机 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；THZ-D恒温摇床 太仓市实验设备厂；PB-10 pH计 德国Sartorius公司；DHP-9082恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；DL-CJ-2ND超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；SX500全自动高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；FA1104电子天平 上海雷韵试验仪器制造有限公司；6890气相色谱（gas chromatography，GC）仪、5975B质谱（mass spectrometry，MS）仪、1200 Series高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪美国安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混合发酵实验
为了消除葡萄原料、环境条件或采收时间等因素的干扰，以便更直接地比较不同酵母菌株的特性，实验采用合成葡萄汁培养基MS300进行发酵实验。首先，将5种活性干酵母粉（LT1、SCH、SCQ、SCD、SCS）分别加入10～20倍酵母质量、含糖量为50 g/L的无菌水中，于38 ℃水浴中活化。同时接种组将LT1与4种酿酒酵母以等比例同时接入培养基；顺序接种组则先接种LT1，4种酿酒酵母推迟2 d后接入。所有组别中，每种菌的接种量均控制在200 mg/L。发酵实验均在装有300 mL培养基的500 mL锥形瓶中进行，每个实验设置2个重复，发酵栓内注入10 mL无菌水密封，于25 ℃恒温培养箱内静置发酵。发酵过程中每2 d取样，直到发酵结束（质量变化连续2 d小于0.2 g/100 mL时），4 ℃、10 000 r/min离心，取上清液于-20 ℃冰箱中保存，用于测定主代谢产物及挥发性香气物质。
1.3.2 发酵速率监测
采用二氧化碳失重法[15]监测发酵进程。
1.3.3 发酵主代谢产物测定
有机酸、葡萄糖、果糖、甘油及乙醇的含量测定：参考文献[15]的方法。色谱柱为HPX-87H（300 mm× 7.8 mm）离子交换柱，流动相为5 mmol/L H2SO4溶液，以0.6 mL/min进行等度洗脱。有机酸的测定采用紫外检测器，进样量为20 μL，柱温60 ℃，测定时间为25 min。葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的测定使用示差折光检测器，进样量为20 μL，柱温45 ℃，测定时间为30 min。通过主代谢产物的出峰时间进行定性，通过不同梯度的标准品峰面积与质量浓度的线性拟合曲线进行定量。
总酸含量测定：参考GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[16]，采用酸碱指示剂滴定法测定。
pH值测定：采用pH计在25 ℃恒温条件下进行测定。
1.3.4 挥发性香气成分测定
挥发性香气成分测定：参考文献[17]的方法。将5 mL样品加入样品瓶中，同时加入1 g NaCl和10 μL 4-甲基-2-戊醇（内标，1 g/L），快速使用具有聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）隔垫的瓶盖拧紧密封，用已经热解吸活化过的50/30 μm PDMS/CAR/DVB萃取头于40 ℃、180 r/min萃取0.5 h，然后在250 ℃条件下以5∶1分离模式在GC注射器中解吸8 min。
GC条件：色谱柱为HP-INNOWAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯（99.999%）氦气，流速1 mL/min，自动进样。柱温箱升温程序为50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持 5 min，共运行62.67 min。
MS条件：电子电离源，电离能量70 eV，质量扫描范围m/z 20～350 ，全离子扫描模式。
定性定量方法：通过比较保留指数（retention index，RI）及经AMDIS解析的NIST 11 MS数据库中的挥发性物质定性标准谱图，对香气物质进行定性分析；定量分析则基于各香气化合物的标准曲线。将香气标准品溶解于模拟酒溶液（4 g/L葡萄糖、4 g/L酒石酸、15%乙醇，使用NaOH调节pH值至3.4）中制备母液，经逐级稀释获得15个质量浓度梯度。计算不同质量浓度下个香气标准品的相应峰面积与内标响应峰面积的比值，再与香气标准品的实际质量浓度进行拟合，所得回归方程作为该化合物的标准曲线。将实际样品中待测香气物质与内标的峰面积比值代入标准曲线，即可计算得到样品中各香气组分的质量浓度。为评估各成分的香气贡献，根据其质量浓度与嗅觉阈值的比值计算香气活性值 （odor activity value，OAV）。
1.4 数据处理与统计分析
采用SPSS 23.0进行方差分析，选用Duncan多重比较确定数据间统计差异，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 2021绘图和主成分分析（principal component analysis，PCA）。
2 结果与分析
2.1 不同菌株组合和接种方式条件下的发酵速率
发酵速率除了能够反映菌株的发酵活力外，也可以在一定程度上表征混菌发酵时不同菌种的适配性高低。由图1A可知，不同酿酒酵母菌株单独发酵速率存在显著差异，SCD的发酵速率最快，其次是SCS和SCQ，SCH发酵速率较慢，LT1单一发酵速率最慢，约14 d完成发酵。在同时接种方式时，发酵速率与SC单独发酵相差不大，仍然是SCD和SCS的发酵速率较高，这与Porter等[18]的研究结果一致。由图1B可知，与同时接种方式不同，4种酿酒酵母在顺序接种时，其速率明显慢于酿酒酵母单独发酵和同时接种，所有组在11～16 d完成发酵，发酵结束时间比SC单独发酵晚2～3 d。与同时接种方式相同，顺序接种混合发酵速率仍然是SCD最高，SCS次之。顺序接种降低发酵速率主要与LT1先消耗营养物质和合成代谢产物（如乳酸）不利于酿酒酵母生长有关[19]。以上结果说明，SCD和SCS与LT1混合发酵的发酵速率较快、适配性较高。
图1 LT1与不同酿酒酵母同时（A）和顺序（B）接种发酵的发酵速率
Fig. 1 Fermentation rate of co-fermentation of LT1 with different S. cerevisiae strains under simultaneous (A) and sequential (B) inoculation
2.2 不同菌株组合和接种方式条件下的产酸情况
由图2A可知，LT1单独发酵时具有较强的产酸能力，总酸质量浓度为（14.37±0.24）g/L，高于各酿酒酵母单独发酵组（（8.10±0.00）～（9.12±0.08）g/L）。在同时接种体系中，LT1＋SCS-co组表现出最佳的协同增酸效果，其总酸质量浓度达到了（10.95±0.97）g/L，较SCS组单独发酵的（8.48±0.03）g/L提高29%；顺序接种策略进一步强化了增酸效果：顺序接种组总酸质量浓度达到了（11.33±0.13）～（17.90±1.02）g/L，与各SC对照组相比，增幅达35%～111.04%。pH值变化趋势进一步印证了LT1的产酸作用，LT1单独发酵pH值最低（3.22），而SC单独发酵的pH值范围为3.46～3.50。同时接种使SC的pH值显著下降，特别是LT1＋SCS-co降至3.3；顺序接种使pH值进一步降低，其中LT1＋SCS-seq pH值最低（3.15），其次是LT1＋SCH-seq降至3.17，这与总酸产量结果相一致（图2B）。研究表明，耐热克鲁维酵母在葡萄酒酿造中的酸化作用是由于其高乳酸生产能力。与大多数酵母菌株通过乙醇脱氢酶催化将丙酮酸主要代谢为乙醇不同，该酵母菌株因其LDH（由LDH1、LDH2、LDH3基因编码）的高活性，能够优先将丙酮酸转化为乳酸，从而在与乙醇代谢途径的竞争中占据优势，实现乳酸的高效合成。然而，不同菌株之间乳酸的合成能力存在显著差异，其产量在0.2～12 g/L之间[3,20]。本研究中，LT1单独发酵的乳酸质量浓度达到（6.27±0.33）g/L，而SC单独发酵乳酸质量浓度仅为（0.15±0.01）～（0.22±0.01）g/L （图2C）。与LT1混合接种显著提高了葡萄酒的乳酸质量浓度，并且提升幅度取决于接种方式和菌株：顺序接种的增酸效果最好，尤其是LT1＋SCS-seq乳酸质量浓度最高，达到了（9.81±0.68）g/L，较SCS单独发酵提升了43.59倍，其次是LT1＋SCH-seq，乳酸质量浓度为（9.10±0.36）g/L，较SCH单独发酵增加55.88倍。这与Hranilovic等[21]的研究结果一致，LT和SC顺序接种可有效提高乳酸浓度，达到理想的葡萄酒酸化效果。这是因为顺序接种可以使LT在酿酒酵母接种前实现生物量快速积累并增强代谢优势，从而最大限度地发挥产酸特性[22]。乙酸也是一种重要的有机酸，当其质量浓度超过0.8g/L时就会对葡萄酒品质带来负面影响，LT和SC的菌株接种比例、发酵培养基和溶氧量均会影响乙酸的产生[23-24]。本实验中LT1的乙酸产量最低（（0.26±0.02）g/L），该值远低于SC菌株单独发酵的产量范围（（0.53±0.02）～（1.08±0.01）g/L）， 降幅达50.94%～75.93%（图2C），这表明LT1具有低产挥发性酸的特性，与Comitini等[25]的研究结果一致，其低产乙酸的原因可能在于部分葡萄糖被分流至乳酸合成路径。因此，LT1与SC混合接种（同时和顺序）发酵后乙酸含量较SC单独发酵有显著下降，其中，同时接种组乙酸质量浓度为（0.42±0.01）～（0.75±0.02）g/L。顺序接种策略则使乙酸产量进一步降低，达到（0.32±0.01）～ （0.41±0.04）g/L，降幅36.67%～62.04%。此外，不同菌株和接种方式对其他几种有机酸含量（柠檬酸、琥珀酸、酒石酸和苹果酸）影响较小，这与Sainz等[3]的研究结果一致，LT的增酸作用主要依赖于乳酸合成途径。以上结果表明，LT1与不同SC复配时的增酸幅度具有显著的菌株特异性，其中SCS和SCH与LT1复配的增酸效果要强于其他两种酵母，表明这2株酵母与LT1的增酸适配性较高，SCD和SCQ次之；此外，接种策略对酸化效果具有决定性影响：与同时接种相比，顺序接种能更有效地发挥LT1的产酸优势。
图2 LT1与不同酿酒酵母同时和顺序接种发酵的产酸情况
Fig. 2 Acid production of co-fermentation of LT1 with different S. cerevisiae strains under simultaneous and sequential inoculation
2.3 不同菌株组合和接种方式下的发酵主代谢产物
由图3A可知，LT1单独发酵后的残糖质量浓度高达（68.06±3.54） g/L，还原糖利用率仅为68.47%，而4种SC单独发酵的残糖质量浓度均低于4 g/L，糖消耗率均达到98%以上，许多研究已经证实与酿酒酵母相比，耐热克鲁维酵母的糖消耗效率要低得多，这表明LT1无法独立完成乙醇发酵，必须与酿酒酵母协作才能完成乙醇发酵[26]。混合接种时均能成功完成发酵（还原糖利用在98%左右）。葡萄酒中过量的乙醇会影响人们对葡萄酒芳香复杂性的感知，对葡萄酒感官特性产生负面影响，同时不利于人体健康，因此，低乙醇含量的葡萄酒受到消费者的广泛关注[27]。本研究中LT1单独发酵时乙醇体积分数为（6.98±0.43）%，而SC单独发酵时乙醇含量具有菌株特异性，其中SCD组最高，其体积分数达到了（11.21±0.13）%。除糖利用率较低外，LT菌株直接通过葡萄糖代谢途径合成乳酸，是其乙醇产量偏低的关键原因之一[10]。相应地，与SC单独发酵相比，LT1与SC混合发酵可显著降低最终乙醇产量。在同时接种体系中，乙醇体积分数降至（10.38±0.08）%～（10.91±0.12）%，顺序接种策略进一步降低了乙醇产量，降至（10.07±0.19）～（10.28±0.03）%，降幅为4.08%～9.20%（图3B），这一结果证实了LT1在乙醇调控方面的潜力。Vicente等[9]利用2株野生和3株商业耐热克鲁维酵母（Lachancea thermotolerans）与酿酒酵母顺序接种发酵发现：与酿酒酵母单独发酵相比（14.74%），混合发酵的乙醇产量显著降低，特别是接种野生耐热克鲁维酵母 L3乙醇体积分数下降3.87%，这与本实验的结果一致。甘油是葡萄酒中仅次于乙醇的第二大关键代谢产物，其生物合成水平直接受甘油-丙酮酸代谢途径通量调控，该化合物不仅能够显著提升酒体黏稠度，更能通过赋予柔滑质感优化葡萄酒的口感特征[28]。由图3C可知，LT1单独发酵甘油质量浓度为（4.97±0.21）g/L，SC不同菌株的甘油产量存在差异，其中SCH产量最高，达到（6.06±0.11）g/L，SCQ次之（（5.97±0.19）g/L）。LT1与SC混合发酵对甘油合成表现出协同促进效应。在同时接种组中，LT1+SCH-co的甘油产量最高，达到了（6.28±0.04）g/L，顺序接种策略进一步增强了该效应，LT1+SCH-seq的甘油质量浓度显著提升至（6.75±0.28）g/L，较SCH单独发酵增幅达11.39%。Su Ying等[20]也得到了类似的结果，本土耐热克鲁维酵母与酿酒酵母顺序接种能显著促进甘油合成，特别是LT菌株A38和SC组合顺序接种48 h效果最佳。以上结果表明，由于LT菌株代谢丙酮酸高产乳酸的特点，与SC混合接种能够显著降低其他丙酮酸支路产物的浓度（如乙醇），但在一定程度上增加了甘油含量。这种改变除了与接种方式有关，与复配的SC菌株也密切相关。
图3 LT1与不同酿酒酵母同时和顺序接种发酵的主代谢产物
Fig. 3 Major metabolites of co-fermentation with LT1 and different S. cerevisiae strains under simultaneous and sequential inoculation
2.4 不同菌株组合和接种方式下的香气物质分析
香气是葡萄酒重要的感官特征，决定着消费者的喜好度[29]。由图4、5可知，本研究共检测到24种香气产物，包括8种高级醇、3种脂肪酸、13种酯（包括脂肪酸乙酸酯和高级醇乙酯）。高级醇主要是由氨基酸分解代谢和葡萄糖代谢产生，是葡萄酒一类重要的香气物质，可以增加葡萄酒的香气复杂性[29]。据报道LT的高级醇产量通常低于酿酒酵母[30]，这与本研究的结果一致，LT1单独发酵高级醇总量为（27.34±1.07）mg/L，显著低于各酿酒酵母菌株（（37.92±1.32）～（57.16±3.15）mg/L）。在同时接种条件下，高级醇质量浓度均较相应SC单独发酵显著升高，尤以LT1＋SCQ-co 最为明显（（44.59±4.42）mg/L），较SCQ单独发酵（（37.92±1.32）mg/L）提升17.58%。相比之下，顺序接种策略普遍降低了高级醇总量（除LT+SCQ-seq），其质量浓度范围为（41.11±1.15）～（43.11±2.03）mg/L。这表明高级醇产量同时受接种时序和酿酒酵母菌株特性的共同调控。具体来说，具有溶剂气味的异丁醇和异戊醇是SC单独发酵中含量最丰富的两类高级醇，在SCS中分别高达（18.54±1.71）mg/L和（32.44±1.29） mg/L。LT1的引入有效抑制了这两种物质的积累，同时接种后，其质量浓度分别下降至（8.71±0.30） mg/L （降幅53.02%）和（23.68±0.64）mg/L（降幅27.00%）；顺序接种进一步将其降低至（4.10±0.59）mg/L和（26.35±0.62）mg/L，降幅达77.89%和18.77%，这为葡萄酒风味带来积极影响。苯乙醇是由苯丙氨酸衍生而来的一种具有理想气味的高级醇，可为葡萄酒提供甜味、植物和玫瑰味[31]，LT1发酵后苯乙醇质量浓度为（8.01±0.64）mg/L，显著高于SC单独发酵（除了SCD），这与Benito[32]的研究结果一致，该研究发现与酿酒酵母相比，LT中与苯丙氨酸代谢和苯乙醇合成相关的基因表达均上调，表明LT具有高产苯乙醇的能力。混合接种可进一步促进苯乙醇的合成，特别是这些酿酒酵母与LT1顺序接种后，苯乙醇质量浓度达到了（8.21±0.01）～（10.24±1.78）mg/L，较SC单独发酵增幅达到59.01%～75.05%，Sun Ying等[20]也证实了LT与SC顺序发酵获得了最高的高级醇产量。但需要指出的是SCD单独发酵的苯乙醇质量浓度显著高于LT1，达到了（19.13±1.09）mg/L，这可能是菌株特异性的原因，而在混合发酵体系（尤其顺序接种）显著抑制苯乙醇合成，具体的代谢机制有待进一步探究。
图4 LT1与不同酿酒酵母同时接种发酵的香气成分
Fig. 4 Aroma profiles of co-fermentation of LT1 with different S. cerevisiae strains under simultaneous inoculation
图5 LT1与不同酿酒酵母顺序接种发酵的香气成分
Fig. 5 Aroma profiles of co-fermentation of LT1 with and different S. cerevisiae strains under sequential inoculation
酯类物质是葡萄酒中产生花香与果香的主要来源，对葡萄酒整体风味的形成起着至关重要的作用[28]。LT1单独发酵的酯类质量浓度为（84.65±1.11）mg/L，显著高于SC单独发酵（（17.36±0.72）～（34.49±2.18） mg/L）。然而，LT1的高酯含量主要源于其高产乳酸乙酯；其余关键呈香酯类的合成能力则显著低于SC菌株。这一差异具体体现在多种重要乙酸酯和乙酯的含量上，如乙酸异戊酯（香蕉香）、丁酸乙酯（香蕉、草莓香）、己酸乙酯（香蕉、青苹果香）、辛酸乙酯（花香、香蕉香）及癸酸乙酯（果香、脂香），其在LT1中的水平均普遍低于相应SC菌株。因此，在混合发酵体系中，乙酸酯和乙酯的含量也显著低于SC单独发酵。特别是在顺序接种条件下，降幅达到17.97%～62.42%。然而，蔡飞等[33]发现耐热克鲁维酵母与商业酵母EC1118共发酵促进酯类物质合成（以EC1118单独发酵为对照组），特别是具有水果香气的丁酸乙酯和乙酸异戊酯，从而显著提升了葡萄酒香气复杂性，这与本研究结果相反，这可能与菌株特异性有关。乳酸乙酯是LT发酵产生的特征性酯类物质，能够赋予葡萄酒水果香气以及奶油香气[34]。本研究中LT1单独发酵时乳酸乙酯产量达到（62.38±0.77）mg/L，显著高于SC单独发酵组（（1.96±0.56）～（4.59±0.07）mg/L）。由于乳酸乙酯的合成受到底物驱动，因此可以肯定LT1高产乳酸乙酯特性与其高产前体乳酸有关[7]。因此，混合发酵时乳酸乙酯含量也相应升高：在同时接种体系中，乳酸乙酯产量小幅上升，仅达到了（4.73±1.62）～（59.51±2.57）mg/L，而顺序接种策略则显著提升了乳酸乙酯产量，达到了（42.39±10.51）～（194.50±5.81）mg/L，其中LT1＋SCS-seq较SCS增幅达到86.98倍，这与前人的研究结果[33]一致。挥发性脂肪酸在葡萄酒发酵过程中起着极其重要的作用，它不仅决定着发酵饮料的风味特征，而且还影响着乙酯的生物合成[11]。在本研究中检测到3种脂肪酸：己酸、辛酸和癸酸。结果表明LT1与SC混合发酵对脂肪酸的影响与接种方式和SC菌株密切相关：同时接种组中LT1＋SCD-co（（5.44±0.58）mg/L）比SCD单独发酵（（7.55±0.49）mg/L）时脂肪酸含量降低了27.95%，但其他组脂肪酸总量比各自SC单独发酵有不同程度的升高；顺序接种策略进一步强化了对脂肪酸合成的抑制效果。其中，LT1＋SCD-seq的脂肪酸质量浓度降至（4.17±0.04） mg/L，较SCD单独发酵降低了44.77%；LT1＋SCS-seq则降至（3.09±0.09）mg/L，较SCS单独发酵（（4.77±0.18）mg/L）降低了35.22%。
2.5 香气成分和主代谢产物PCA结果
为了进一步解析LT1与不同SC菌株复配对乳酸和香气合成的影响，采用PCA分别对同时接种和顺序接种香气成分和主代谢产物进行了分析。由图6可知，在单独发酵体系中，LT1位于第2象限，与乳酸、正丁醇和乳酸乙酯含量显著相关。4株SC单独发酵与LT1单独发酵显著分离，并且SC菌株间也具有差异：酿酒酵母D254（SCD）单独发酵组位于第1象限，和苯乙醇呈显著正相关；酿酒酵母ES488（SCS）单独发酵组位于PC1正半轴，和多种理想气味酯类关联密切；酿酒酵母红佳酿（SCH）单独发酵组和AWRI 796（SCQ）单独发酵组主要和甘油和乙酸合成相关。即使在相同接种模式下，LT1与不同SC混合发酵对代谢产物的影响也有显著的差异。同时接种发酵后，LT1＋SCS-co与ES488（SCS）单独发酵组显著分离，向乳酸及乳酸乙酯区域迁移，表明混合发酵具有协同代谢效应；而其他3组与其SC对照组位置接近。顺序接种策略进一步显著改变了SC菌株的代谢特征。4株SC在与LT1顺序接种发酵后，均与其相应的SC单独发酵组明显分离：其中LT1＋SCS-seq和LT1＋SCH-seq组的代谢变化与乳酸和乳酸乙酯积累相关，而LT1＋SCQ-seq则更倾向于甘油合成。这一差异可能与接种时序有关：在顺序接种条件下（SC延迟2 d接入），LT1享有更长的单独繁殖与代谢时间，从而在混合体系中贡献更为显著。以上结果表明，由于SC本身的表型差异，当LT1与不同SC混合发酵时，菌株接种方式与菌株特异性共同影响代谢产物谱的形成。
图6 LT1与不同酿酒酵母同时（A）和顺序（B）接种发酵代谢产物PCA载荷图
Fig. 6 Principal component analysis biplots of metabolites by co-fermentation of LT1 with and different S. cerevisiae strains under simultaneous (A) and sequential (B) inoculation
3 结 论
本研究结果表明，CVE-7与不同酿酒酵母菌株混合发酵时，在增酸幅度与香气轮廓上存在显著差异。其中，ES488与CVE-7顺序接种的增酸效果最好，乳酸质量浓度达到了（9.81±0.68）g/L，相较于ES488单独接种增幅为43.59倍，乳酸乙酯质量浓度增加至 （194.50±5.81） mg/L，增幅达86.98倍。红佳酿与CVE-7顺序接种的增酸效果次之，乳酸质量浓度为（9.10±0.36）g/L，较红佳酿单一接种提升55.88倍。相比之下，D254和AWRI 796与CVE-7混合接种的增酸效果较弱。因此，当需要高度增酸时推荐采用ES488或红佳酿与CVE-7混合接种；当增酸幅度不大时，可选择D254或AWRI 796与CVE-7复配。为了避免出现增酸过度的现象，企业需要根据实际情况进行菌株适配性评价，并结合接种方式进行不同程度的增酸，如对于初始酸度很低的葡萄醪（汁）可以采用顺序接种酿酒酵母的方式。需要指出的是，本研究是在合成葡萄汁中进行的发酵实验，未来会采用真实葡萄汁对CVE-7与更多不同的商业酿酒酵母复配时的产酸和产香特性进行更加深入的研究。此外，虽然CVE-7展现出优异的增酸特性，但与其他非酿酒酵母相比产香能力相对薄弱，未来可以引入一种产香能力突出的非酿酒酵母（如德尔布有孢圆酵母）进行三菌协同发酵，通过菌株代谢互补提升葡萄酒的酸度和香气。更为重要的是今后还需在分子水平上深入解析CVE-7在混菌发酵中的产酸与产香机制，尤其应关注菌种互作对其代谢途径的影响，以期为该菌株的产业应用提供更精准的调控策略。
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