浓香型白酒为中国十二大香型白酒之一，产销量约占白酒总量的60%，以窖香浓郁、绵甜爽净、酒体柔和协调的特点广受消费者青睐[1]，其核心特征香气成分己酸乙酯，主要由窖泥中己酸菌生成的己酸与乙醇经酯化酶催化合成[2]；窖泥年龄越老，己酸菌丰度越高，所产白酒质量也更优，正所谓“千年老窖万年糟，好酒全凭窖池老”[3-5]。但传统发酵依赖窖泥，酒体会产生异味[6]，且劳动强度大、生产成本高[7]。若直接将己酸菌液应用于白酒发酵，菌体会过早死亡[8]。
为提高菌体耐受性和活性，微胶囊化技术是提高菌体生存能力的有效途径[9]。该技术将菌体等活性物质包埋成微小颗粒，不仅能有效保护活性物质，还能缓释活性物质[10]。采用锐孔法制备的微胶囊形态和粒径较为均一[11]，在形成球体期间，活性物质会快速被包埋，有利于维持活性物质的高活性[12]。海藻酸钠作为微胶囊包埋的常用壁材可以有效将活性物质包埋起来，在合适pH值下能够迅速裂解释放活性物质[13]。艾尔帕尼·阿布里米提等[14]发现利用哈茨木霉制作成的微胶囊剂可提高对樟子松枯梢病的防治效果；曹颖等[15]发现制备的具有分泌天蚕素能力的天蚕素酵母菌体微胶囊可显著改善结肠炎小鼠的肠黏膜损伤程度，维持肠道菌群稳态。微胶囊技术在益生菌保护、调味品发酵等领域应用广泛[16]，但在白酒固态发酵中的应用研究鲜有报道。
本研究以海藻酸钠为壁材，对己酸菌复合菌液进行包埋制备己酸菌微胶囊，对其理化性质及贮藏稳定性进行测定，采用傅里叶变换红外（Fourier transform infrared，FTIR）光谱、X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）、差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）分析、热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）表征己酸菌微胶囊的形貌与性能，并对己酸菌微胶囊进行应用，以期开发一种可应用于白酒酿造的己酸菌微胶囊，为浓香型白酒品质提升提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高粱 市售；浓香型大曲 湖北武汉某酒业有限公司；复合己酸菌液浓度约为1.29×108个/mL（含己酸菌、红曲霉、产酯酵母和甲烷菌等酿酒微生物） 湖北工业大学酿酒中试基地；海藻酸钠（分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；氯化钙、磷酸氢二钠、柠檬酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
DM1000-LED生物显微镜 徕卡显微系统（上海）贸易有限公司；Labconco FreeZone真空冷冻干燥机 北京中科科尔仪器有限公司；Nicolet iS10 FTIR光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；550 TGA仪、2500 DSC仪 美国TA公司；SmartLab SE XRD仪 日本理学公司；GC7980气相色谱仪 上海天美科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 己酸菌微胶囊的制备
采用锐孔-凝固浴法制备己酸菌微胶囊。称取一定量海藻酸钠溶于无菌水中（质量分数为1.71%），75 ℃下水浴加热至海藻酸钠完全溶解；将一定量氯化钙溶于蒸馏水中（质量分数为2.85%），灭菌后冷却备用。将制备好的菌悬液（浓度为2.58×108个/mL）以1∶4（V/V）的比例与海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后静置10 min，使用一次性无菌注射器吸取混合液，以距离液面15 cm左右的高度逐滴加到氯化钙固化剂中，形成微囊，在磁力搅拌器的外力作用下使其均匀固化，固化时间为37 min，蒸馏水冲洗3次，洗去固定化微胶囊表面剩余的氯化钙和菌体，即得己酸菌微胶囊，并于4 ℃冰箱中贮存备用[17]，经真空冷冻干燥后即得到冻干微胶囊，以供检测使用。
1.3.2 己酸菌微胶囊理化性质测定
水分含量的测定：参考许欣等[18]中恒温干燥法测定。
粒径的测定：使用游标卡尺随机选取己酸菌微胶囊测量其直径，记录30次，计算其平均值。
堆积密度和紧实密度的测定：堆积密度、紧实密度反映了微胶囊整体的密度和颗粒之间的空隙度[19]。参考刘恩慧等[20]的方法，称取冻干后微胶囊装入100 mL量筒，记录其质量，匀速水平地晃动量筒使微胶囊自然下沉，记录微胶囊体积，轻轻敲击量筒至微胶囊体积恒定，记录此时的微胶囊体积，微胶囊堆积密度（ρ1）和紧实密度（ρ2）计算公式如下：
式中：m为微胶囊质量/g；V1为自然下沉微胶囊体积/mL；V2为紧实堆积后微胶囊体积/mL。
流动性测定：通过测定休止角（θ）、豪斯纳比率（Hausner ratio，HR）、卡尔指数（Carr’s index，CI）评估微胶囊的流动性，θ、HR、CI值越低，微胶囊的流动性越好；反之则越差。将冷冻干燥后的微胶囊样品缓慢加入漏斗中，置于距圆盘高5 cm、口径50 mm的漏斗中使其自由下落于圆盘上，测量在圆盘中粉末锥体的高度和半径[21]，θ、HR、CI按下式计算：
式中：H为堆积的微胶囊高度/mm；r为堆积的微胶囊半径/mm。
包埋率的测定：参考魏小晶等[22]的方法并稍作修改，配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 7.4），115 ℃灭菌20 min后作为解囊液；准确称取微胶囊1 g，加入9 mL解囊液中，37 ℃、230 r/min的条件下振荡1 h，完全解囊后取样，采用血球计数结合美蓝染色进行活菌计数。微胶囊的包埋率计算公式如下：
式中：N为微胶囊中释放出的活菌数/（个/mL）；N0为包埋前游离活菌数/（个/mL）。
1.3.3 己酸菌微胶囊的贮藏稳定性测定
参考李思媛等[23]的方法稍作修改，将制备好的己酸菌微胶囊于4 ℃条件下保存28 d，每隔7 d取样测定活菌数，以游离的己酸菌复合菌液为对照。
1.3.4 己酸菌微胶囊的结构表征
1.3.4.1 FTIR光谱分析
参照王婷等[24]的方法，使用配备衰减全反射的FTIR光谱仪，分别将微胶囊样品、海藻酸钠与溴化钾混合，研磨均匀后压片，在扫描范围为4 000～400 cm-1内得到海藻酸钠和微胶囊的FTIR光谱图，分辨率为4 cm-1，扫描次数为 64次。
1.3.4.2 XRD分析
参照Ledri等[25]的方法，对冻干后的微胶囊样品研磨制成粉末（200目），将研磨后的微胶囊及海藻酸钠粉末平铺于样品盘中，置于XRD仪中分析，参数设置为：Cu-Kα射线作为激发源，扫描速率为2（°）/min，扫描角度范围为2θ 5°～80°，进行连续扫描。
1.3.5 己酸菌微胶囊的热稳定性
1.3.5.1 DSC分析
参照崔方超等[26]的方法，分别称取20 mg冻干微胶囊粉末、20 mg海藻酸钠密封于铝盒中，在氮气的保护下进行测定，起始平衡温度为30 ℃，以10 ℃/min的速率升温至200 ℃。
1.3.5.2 TGA
参照Wang Yansong等[27]的方法，使用TGA仪评估微胶囊及海藻酸钠的热稳定性，分别称取5 mg冻干微胶囊粉末、海藻酸钠粉末至铝盒中，以氮气为加热介质，流速为20 mL/min，以10 ℃/min的速率从30 ℃加热至600 ℃。
1.3.6 己酸菌微胶囊应用
高粱经过高温润粮、初蒸、复水、复蒸后，得到内无生心、外无粘连、开口率为80%的熟粮，将熟粮摊凉至室温备用，称取质量为高粱干质量20%的浓香型大曲，与摊凉后的高粱充分混匀。将制备好的己酸菌微胶囊（添加量为高粱干质量的12%）与大曲高粱混合物料拌匀，室温入坛发酵30 d[28]。发酵结束后与清蒸过的稻壳进行混合，经蒸馏得到酒样为实验组，以未添加己酸菌微胶囊发酵、蒸馏酒样为空白组，以接种复合己酸菌液（添加量为高粱干质量的12%）蒸馏酒样为对照组，将乙醇体积分数均折合为60%，测定总酸、总酯含量及己酸乙酯含量。
1.3.7 理化指标的测定
酒样的总酸、总酯、酸酯总量的测定参考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》；己酸乙酯的测定采用气相色谱法[29]。
1.4 数据处理
利用Excel 2016、Origin 2021b和SPSS 27.0进行数据处理、绘图。所有实验重复3次，结果以表示。
2 结果与分析
2.1 己酸菌微胶囊的理化性质
由表1可知，微胶囊的粒径为3.00 mm；冻干后的己酸菌微胶囊样品的堆积密度为0.18 g/mL、紧实密度为0.19 g/mL，堆积密度越高说明颗粒间孔隙率越低，紧实密度越大微胶囊与空气接触越少，微胶囊的保质期越长；己酸菌微胶囊的水分质量分数为96.47%，可能是因为海藻酸钠具有亲水性，能保留住大部分水分[18]。
表1 己酸菌微胶囊的理化指标检测结果
Table 1Physicochemical index detection results of caproic acid bacteria microcapsules
理化指标测定结果粒径/mm3.00±0.03堆积密度/（g/mL）0.18±0.02紧实密度/（g/mL）0.19±0.02θ/（°）18.75±2.90 HR1.08±0.04 CI/%7.08±0.03水分质量分数/%96.47±0.12包埋率/%86.02±0.35
微胶囊的θ、HR、CI可以表征微胶囊的流动性，微胶囊的流动性强弱会直接影响应用过程的流通以及分布状况[30]。经过冷冻干燥后的己酸菌微胶囊的平均θ为18.75°（＜30°），表明己酸菌微胶囊的流动性良好[31]；己酸菌微胶囊的HR为1.08，在1.00～1.11之间、CI为7.08%（＜10%），表明微胶囊的流动性极好。己酸菌微胶囊的包埋率为86.02%，说明微胶囊能够很好地将己酸菌包埋[32]。
2.2 己酸菌微胶囊的贮藏稳定性
由图1可知，当贮藏时间为0～7 d时，己酸菌复合菌液的活菌数由2.10×108个/mL快速下降至1.11×108个/mL，而己酸菌微胶囊的活菌数由2.17×108个/mL缓慢下降至1.80×108个/mL；在贮藏时间为7～28 d时，己酸菌复合菌液的活菌数由1.11×108个/mL继续缓慢下降至 0.92×108个/mL，而己酸菌微胶囊内的己酸菌活菌数趋于稳定；当贮藏28 d时，2组活菌数分别为0.92×108、1.76×108个/mL，存活率分别为43.81%、81.11%。综上，微胶囊技术可以保留己酸菌活性，提高对外界环境的适应能力。
图1 贮藏时间对己酸菌复合菌液和己酸菌微胶囊活菌数的影响
Fig. 1Effect of storage time on viable counts of compound caproic acid bacteria liquid and caproic acid bacteria microcapsules
2.3 己酸菌微胶囊的FTIR光谱分析
由图2可知，海藻酸钠在3 290 cm-1处存在分子间氢键的O—H基团伸缩振动引起的宽的吸收峰，在1 590 cm-1 处和1 400 cm-1处分别是羧酸根负离子中的羰基C＝O的伸缩振动峰和C—O键的伸缩振动峰，1 020 cm-1处的峰是C—O—C的吸收峰。己酸菌微胶囊在3 290 cm-1处具有较宽的O—H基团伸缩振动峰，在1 590 cm-1处和1 400 cm-1处具有羰基C＝O、C—O键伸缩振动峰和1 020 cm-1处的C—O—C伸缩振动吸收峰，此外，在2 920 cm-1处出现了新的伸缩振动峰，该吸收峰被认为与C—H的伸缩振动有关[33]，表明经过海藻酸钠的包埋之后，己酸菌微胶囊中可能出现了氢键的相互作用，具有较好的相容性，说明制备的微胶囊能够较好地包埋己酸菌，从而保持其良好的活性。
图2 己酸菌微胶囊及海藻酸钠的FTIR光谱图
Fig. 2 FTIR spectra of caproic acid bacteria microcapsules and sodium alginate
2.4 己酸菌微胶囊的DSC分析
DSC通过控制温度观察物质在加热过程中释放或吸收的热量变化。通过测定熔化温度可评估样品热稳定性，熔化温度越高，热稳定性越好[34]。由图3可知，己酸菌微胶囊及海藻酸钠的DSC曲线均只存在1个吸热峰，该吸收峰对应的温度为熔化温度（Tm），海藻酸钠、己酸菌微胶囊的Tm分别为90.1、100.1 ℃，己酸菌微胶囊的Tm比海藻酸钠高10 ℃，可能是由于海藻酸钠和己酸菌之间的氢键作用增强了聚合物组分之间的相互作用，使海藻酸钠主链的迁移转化过程受到抑制，提高了分解聚合物内部结构所需的温度[35]。因此，己酸菌微胶囊热稳定性更高，在常温下贮藏稳定性良好，能够较好地保持己酸菌的活性。
图3 己酸菌微胶囊及海藻酸钠的DSC曲线
Fig. 3DSC curves of caproic acid bacteria microcapsules and sodium alginate
2.5 己酸菌微胶囊的TGA
TGA是通过程序控制温度，实时测量样品质量随温度变化的热分析技术，通过样品的质量变化，揭示样品的组成和热稳定性[36]。由图4可知，温度为0～100 ℃时，海藻酸钠、己酸菌微胶囊的质量损失均小于10%，这可能是由于表面水分蒸发；当温度为100～200 ℃时，海藻酸钠、己酸菌微胶囊的质量损失缓慢；温度为200 ℃时，其质量损失分别为15.14%、15.59%。其原因可能是，海藻酸钠、己酸菌微胶囊由于结合水和挥发性组分物质流失，造成质量缓慢损失；温度为200～400 ℃时，海藻酸钠及己酸菌微胶囊质量损失加快；当温度为400 ℃时，其质量损失分别为56.80%、51.53%。这是由于囊壁发生热降解，芯材中的己酸菌菌液亦分解[37]。当温度大于400 ℃时，海藻酸钠及己酸菌微胶囊质量损失缓慢下降。己酸菌微胶囊的整体质量损失下降明显低于海藻酸钠，表明微胶囊结构更稳定。
图4 己酸菌微胶囊及海藻酸钠的TGA曲线
Fig. 4TGA curves of caproic acid bacteria microcapsules and sodium alginate
微商热重曲线的峰值为样品最大降解速率对应的温度，能够有效反映不同组别样品的热稳定性差异[38]。由图5可知，海藻酸钠在247 ℃处存在1个峰，在该温度下海藻酸钠降解最快；己酸菌微胶囊存在2个不同的峰，第1个峰出现在230 ℃，第2个峰出现在297 ℃。第1个峰可能由于海藻酸钠降解，第2个峰可能由于己酸菌降解，表明海藻酸钠可保留己酸菌菌液活性[39]。综上，己酸菌微胶囊具有较好的耐热性和稳定性。
图5 己酸菌微胶囊及海藻酸钠的微商热重曲线
Fig. 5Derivative thermogravimetric curves of caproic acid bacteria microcapsules and sodium alginate
2.6 己酸菌微胶囊的XRD分析
为研究微胶囊的晶体结构和包埋效果，采用XRD分析研究海藻酸钠及己酸菌微胶囊的晶体结构，由图6可知，海藻酸钠分别在2θ 21.84°、13.67°附近呈现出结晶衍射峰，表明海藻酸钠在这2个位置形成了局部结晶区。将其制备成己酸菌微胶囊之后，2θ 13.67°处的结晶峰消失，表明己酸菌和海藻酸钠壁材之间发生了分子间的物理作用力，破坏了海藻酸钠的晶型结构[40]；在2θ 21.84°附近出现了一个弥散峰，但是峰的强度变弱，说明海藻酸钠包埋己酸菌后，使其分子链的规整性下降；己酸菌微胶囊在2θ 10.15°处出现结晶峰，表明微胶囊与菌体作用形成新晶区[41]。
图6 己酸菌微胶囊及海藻酸钠的XRD图谱
Fig. 6XRD patterns of caproic acid bacteria microcapsules and sodium alginate
2.7 己酸菌微胶囊的应用
应用结果表明，空白组、实验组、对照组中总酸质量浓度分别为0.15、0.44、0.53 g/L，而实验组总酯质量浓度、酸酯总浓度及己酸乙酯质量浓度（分别为1.59 g/L、25.41 mmol/L、13.59 mg/100 mL）均高于空白组（分别为0.69 g/L、11.07 mmol/L、0.21 mg/100 mL）及对照组（0.86 g/L、18.52 mmol/L、12.71 mg/100 mL）。因此，己酸菌微胶囊可以提高总酯、酸酯总量及己酸乙酯含量。
3 结 论
本研究采用锐孔-凝固浴法制备的己酸菌微胶囊包埋率为86.02%，平均粒径为3.00 mm，水分质量分数为96.47%，θ、HR、CI分别为18.75°、1.08、7.08%，微胶囊具有良好的流动性；贮藏时间为28 d时，微胶囊中己酸菌的存活率（81.11%）高于己酸菌复合菌液（43.81%），可有效维持菌体活性；微胶囊能有效包埋己酸菌，其在200 ℃以下具有良好的稳定性，且结构稳定性增加。应用结果表明，添加己酸菌微胶囊的实验组总酸、总酯质量浓度、酸酯总浓度及己酸乙酯质量浓度分别为0.44 g/L、1.59 g/L、25.41 mmol/L、13.59 mg/100 mL，均优于空白组。综上所述，本研究可为浓香型白酒品质提升提供参考。
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