和田红葡萄（Vitis vinifera L.）作为欧亚种葡萄的典型代表，是极具新疆地域特色的地方品种[1]。该品种果实表皮呈现出鲜艳的紫红色，果肉质地细嫩，出汁率较高，风味独特[2-3]。其研究多集中于葡萄酒酿造、香气成分分析和活性成分提取等方面[4-6]。和田红葡萄酒富含营养成分，可调节机体免疫能力[7]。其酿造核心在于酵母菌，可将糖分转化为乙醇，生成挥发性风味化合物，强化酒体的风味协调性与品质稳定性[8-10]。
发酵动力学模型通过定量研究微生物生长、产物生成和底物消耗规律及相互作用，为优化发酵过程提供理论依据[11-12]。张阳阳等[13]以带皮猕猴桃、红茶菌液为原料发酵制备红茶菌液猕猴桃果酒，探究其发酵过程中菌体生长、基质（还原糖）消耗、产物（乙醇）生成趋势，建立相关动力学方程，结果表明，Boltzmann模型（描述酵母生长、乙醇生成）和Logistic模型（描述还原糖消耗）拟合最优，决定系数均大于0.98且预测误差小于15%，揭示了红茶菌液猕猴桃果酒发酵过程中代谢产物的变化规律。潘立妮等[14]为明确樱桃果酒发酵过程中酵母菌生长、乙醇生成及总糖消耗的构效关系，建立发酵动力学模型。结果表明，Boltzmann模型拟合酵母菌生长及乙醇生成最优，DoseResp与Boltzmann模型拟合总糖消耗最优，决定系数均大于0.99，所选模型能准确描述樱桃果酒的发酵过程。目前，鲜见和田红葡萄酒发酵动力学模型的研究报道。
本研究以和田红葡萄为原料，采用果酒酵母MS发酵制备和田红葡萄酒，采用DoseResp模型、Logistic模型、Boltzmann模型对和田红葡萄酒发酵过程中的酵母菌数量、乙醇体积分数及总糖消耗量进行非线性拟合，构建和田红葡萄酒发酵动力学模型，测定葡萄酒发酵过程中的总酚与总黄酮含量及抗氧化活性变化，并对葡萄酒的品质指标进行相关性分析，以期优化和田红葡萄酒酿造工艺，推动和田红葡萄深加工产业的可持续发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
和田红葡萄采购于阿克苏地区葡萄园；果酒酵母MS新疆理工学院慕萨莱斯品种检测中心；无水乙醇、七水合硫酸亚铁、过硫酸钾、水杨酸 天津市众联化学试剂有限公司；2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海蓝季科技发展有限公司；羟自由基清除能力检测试剂盒 福州飞净生物科技有限公司；没食子酸 国药集团化学试剂有限公司；果胶酶（30 000 U/g） 中辰生物科技有限公司；亚硝酸钠、蒽酮、氢氧化钠 上海麦克林生化科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
FA1204B分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；HWS-24恒温水浴锅 上海精密仪器仪表有限公司；BPH-9402恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；LB32T手持糖度仪 广州市速为电子科技有限公司；GZX-903MBE恒温鼓风干燥箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；PHS-3Cb pH计 上海越平仪表有限公司；A360型紫外分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；10 WATT光学显微镜 麦克奥迪实业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 和田红葡萄酒酿造工艺流程及操作要点
工艺流程：和田红葡萄→挑选→除梗、破碎→酶解→接种→发酵→过滤、杀菌→和田红葡萄酒。
操作要点：
原料预处理：挑选成熟、品质优良的和田红葡萄，除梗后用打浆机进行破碎。
酶解：破碎后的果汁中加入40 mg/L果胶酶，50 ℃酶解4 h。
接种、发酵：将活化后的0.05%酵母菌液（按酵母与葡萄汁的料液比为1∶9（g/mL）加入葡萄汁溶解，35 ℃活化30 min）接种至酶解后的葡萄全果汁中，28 ℃发酵 144 h，并分别在0、24、48、96、120、144 h取样，当总糖含量不再变化则发酵结束，用双层纱布过滤，并于80 ℃巴氏杀菌20 min，即得和田红葡萄酒成品。
1.3.2 酵母菌数及理化指标测定
酵母菌数的测定：采用血球计数板[15]；总糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法[16]；总酚含量的测定：采用Folin-Ciocalteu比色法[17]；总黄酮含量的测定：采用NaNO2-Al(NO3)3显色法[18]；乙醇体积分数的测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]。
1.3.3 抗氧化特性测定
DPPH自由基清除能力的测定：参照田欢等[20]的方法；ABTS阳离子自由基清除能力的测定：参考秦晋颖等[21]的方法；羟自由基清除能力的测定：参照程宏桢等[22]的方法。
1.3.4 发酵动力学模型的建立
和田红葡萄酒发酵动力学模型方程见表1，测定和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌数、乙醇生成量及总糖含量，采用Logistic、DoseResp及Boltzmann模型进行非线性拟合，反映微生物生长、底物消耗与产物生成的规律[23-24]，进而预测发酵进程的动态变化。在此基础上，筛选出拟合效果最优的动力学模型，对发酵过程中微生物代谢活动进行定量分析描述，通过测定和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌数、总糖含量及乙醇生成量，将模型预测值及实际值进行比较。
表1 和田红葡萄酒发酵动力学模型方程
Table 1Fermentation kinetic model equations for Hetianhong wine
模型模型方程Logisticy =1＋A1（－xA/x20）p ＋A2 DoseRespy =1＋A120－（lgA x10-x）p ＋A1 Boltzmanny =1＋A1e（－x－Ax02）/dx ＋A2
1.4 数据处理
所有实验均重复3次，应用Origin 2021软件拟合实验数据，建立发酵动力学模型。
2 结果与分析
2.1 发酵动力学模型的建立与验证
2.1.1 和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌数、乙醇生成量及总糖含量的变化
由图1可知，随着发酵时间在0～120 h的延长，酵母菌数、乙醇生成量变化趋势一致，均呈上升趋势；发酵时间＞120 h，酵母菌数、乙醇生成量变化趋于平稳，发酵144 h时，酵母菌数、乙醇生成量均达到最高值，分别为8.98×107 CFU/mL、12.05%。在发酵时间为0～48 h的期间内，总糖含量下降较为缓慢，在发酵时间为48～96 h的期间内，总糖含量快速下降，其原因可能是，酵母菌进入对数增殖期，大量消耗葡萄汁中的可发酵糖，这一阶段是糖代谢的核心时期[25-26]；发酵时间＞96 h，总糖含量下降趋于平稳；发酵144 h时，总糖质量浓度最低，为18 g/L。
图1 和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌数、乙醇生成量及总糖含量的变化
Fig. 1Changes of viable yeast counts, ethanol production and total sugar contents during Hetianhong wine fermentation
发酵0～120 h时，和田红葡萄汁中富含葡萄糖、果糖等碳源及氨基酸等氮源，且体系pH值、温度等环境条件适宜，酵母菌处于对数增殖期，数量持续增加。随着发酵继续进行，葡萄汁中可利用的营养物质逐渐减少，同时代谢产物乙醇持续积累，对酵母菌生长有一定抑制作用，其增殖速率与死亡速率趋于平衡，酵母数量进入稳定期；发酵时间＞120 h，酵母菌可代谢的糖类物质减少，乙醇体积分数变化趋于平稳[27-28]。
2.1.2 酵母菌生长动力学模型的建立
果酒酵母MS在和田红葡萄酒中的酵母数变化趋势为“S”形，故采用Logistic模型、DoesResp模型、Boltzmann模型进行非线性拟合。由表2可知，上述3个模型的决定系数均大于0.976 3，其中，DoesResp模型对酵母菌生长繁殖拟合度最好，决定系数为0.999 6，选用该模型进行非线性拟合。由图2可知，果酒酵母MS在发酵0～100 h酵母菌数量快速增加；发酵时间＞100 h，酵母菌数量趋于平稳；发酵144 h时，酵母菌数量达到最高值，为8.27×107 CFU/mL。该变化规律与刘艳[29]构建的椰枣果酒菌体生长动力学模型中酵母菌生长变化相类似。实测值与拟合曲线吻合度较好，说明此模型能够有效预测发酵过程中果酒酵母MS数量的变化趋势。
图2 和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌生长DoesResp模型拟合曲线
Fig. 2 Fitting curve of DoseResp model of yeast growth during Hetianhong wine fermentation
表2 和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌生长量动力学模型方程及决定系数
Table 2 Kinetic model equation and determination coefficient of yeast growth during Hetianhong wine fermentation
模型拟合方程决定系数Logisticy =1＋（x-/5140..100622 6496）2.280 39＋10.133 1 0.997 8 DoseRespy =1＋10（4160. 3.2493 747－ 2x1）×0.019 76 －1.112 810.999 6 Boltzmanny =1＋e-（x－1046..23439 477 ）2/121.972 5－1.112 810.976 3
注：x为发酵时间/h；y为酵母菌数/（CFU/mL）。
2.1.3 总糖消耗动力学模型
和田红葡萄酒发酵过程中，底物作为菌体生长和代谢的基础物质，其消耗主要用于合成新细胞及代谢产物、提供代谢所需能量[30]、作为风味物质的前体[31]。由表3可知，Logistic模型、DoseResp模型及Boltzmann模型的决定系数均大于0.997 9，其中Boltzmann模型和DoseResp模型的决定系数相同，均为0.998 5，表明二者均能较好地拟合总糖含量的消耗变化趋势。鉴于DoseResp模型在总糖消耗量计算较Boltzmann模型更为简便，故选用DoseResp模型对和田红葡萄酒发酵过程中的总糖消耗量进行拟合。由 图3可知，总糖含量在发酵0～48 h期间内缓慢下降；在发酵48～96 h期间呈快速降低趋势；当发酵时间＞96 h之后，总糖含量逐渐趋于稳定，实测值与拟合曲线吻合度较好，说明DoseResp模型能很好地描述总糖消耗变化过程，这与张阳阳等[32]研究的红茶菌液水蜜桃果酒发酵中总糖含量在发酵前期因酵母代谢快速下降，发酵后期趋于稳定相一致，说明该模型精准契合总糖消耗的代谢规律，能准确描述总糖消耗变化过程，基于该模型可以预测发酵过程中不同发酵时间点的总糖含量。
图3 和田红葡萄酒发酵过程中总糖消耗DoseResp模型拟合曲线
Fig. 3 Fitting curve of DoseResp model of total sugar consumption during Hetianhong wine fermentation
表3 和田红葡萄酒发酵过程中总糖消耗动力学模型方程及决定系数
Table 3 Kinetic model equation and determination coefficient of total sugar consumption during Hetianhong wine fermentation
模型拟合方程决定系数Logisticy = ＋11.978 641＋（x/68.405 51）6.900 10.997 9215.104 16 DoseRespy = ＋15.4911＋10（68.394 41-x）×（-0.044 89）0.998 5214.038 98 Boltzmanny =＋15.491 21＋e（x-68.394 41）/9.674 180.998 5214.038 93
注：x为发酵时间/h；y为总糖消耗量/（g/L）。
2.1.4 乙醇生成动力学模型
由表4可知，Logistic模型、DoseResp模型及Boltzmann模型的决定系数分别为0.996 19、0.999 14和0.999 14。由于DoesResp模型与Boltzmann模型的决定系数相同，考虑到实际生产需求，选用Boltzmann模型拟合乙醇生成的异常值稳定。基于此，选用Boltzmann模型拟合乙醇生成曲线，这与李敏杰等[33]建立的嘉宝果果酒拟合产物生成模型相类似。由图4可知，在发酵0～96 h时，乙醇生成量的增幅较大；发酵时间为96～120 h，乙醇的生成速率开始下降；发酵时间＞120 h，乙醇生成量变化趋于平稳，这可能是因为可利用总糖不断被消耗，酵母菌生长进入稳定期；当发酵至144 h，乙醇生成量达到最高值（12.05%）。因此，该模型可以很好地描述乙醇生成的变化过程。
图4 和田红葡萄酒发酵过程中乙醇生成Boltzmann模型拟合曲线
Fig. 4Fitting curve of Boltzmann model of ethanol production during Hetianhong wine fermentation
表4 和田红葡萄酒发酵过程中乙醇生成动力学模型方程及决定系数
Table 4Kinetic model equation and determination coefficient of ethanol production during Hetianhong wine fermentation
y = ＋15.751 411＋（x/84.711 13）2.389 210.996 19-15.501 651＋10（69.998 87-x）×0.016 870.999 1413.679 61＋e（x-69.998 87）/25.750 070.999 14-13.679 6模型拟合方程决定系数Logistic DoseRespy =-0.746 81 Boltzmanny = ＋12.932 79
注：x为发酵时间/h；y为乙醇体积分数/%。
2.2 发酵动力学模型验证
酵母菌生长量与总糖消耗量采用DoseResp模型进行描述，乙醇体积分数采用Boltzmann模型进行描述。为确定模型的可靠性，对模型实测值及实测值进行比较[34]，结果见表5。酵母菌数、总糖含量和乙醇生成量的预测值与实测值之间的相对误差均小于15%，说明预测值及实测值相近，模型可靠，能较好地描述和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌生长、乙醇生成及还原糖消耗的动态过程。
表5 和田红葡萄酒发酵动力学模型预测值及实验值比较结果
Table 5Comparison results of the predicted values and experimental values of the fermentation kinetics model for Hetianhong wine
发酵（1酵07 母CF菌U/数m/L ）乙醇生成量/%总糖质量浓度/（g/L）时间/h实测值预测值误相差对/%实测值预测值误相差对/%实测值预测值误相差对/% 241.581.611.861.351.2210.66220.07227.373.21484.264.201.433.373.340.90208.25206.350.92726.586.691.646.246.361.89102.09102.800.69968.278.151.479.259.280.3228.2427.163.981208.758.770.2311.4511.231.9616.2716.521.511448.989.000.2212.0512.201.2315.0815.583.21
2.3 和田红葡萄酒发酵过程中活性成分及抗氧化能力
2.3.1 和田红葡萄酒中总酚和总黄酮含量
和田红葡萄富含多种酚类物质，如没食子酸、儿茶素、表儿茶素、咖啡酸、芦丁、白藜芦醇等[35]，这些成分不仅决定了葡萄酒的品质与理化特性，还是其发挥抗氧化活性的物质基础。由图5可知，随着发酵时间在24～120 h范围内的增加，总酚与总黄酮含量均上升，此阶段由于酵母代谢作用产生的乙醇等物质，会破坏葡萄果皮、果肉的细胞壁结构，促进结合态酚类物质向游离态转化并溶出至酒体中；发酵120 h时，总酚与总黄酮质量浓度均达到最高值，分别为0.68、0.97 g/L；发酵时间超过120 h时，总酚与总黄酮质量浓度下降，这一变化与多数果酒发酵的酚类物质动态特征相契合。其原因可能为：一方面，由于酵母进入稳定期后，其代谢产生的多酚氧化酶、酯酶等会促使多酚大分子水解为小分子片段，导致总酚、总黄酮的含量降低；另一方面，部分酚类物质可能与酒体中的多糖等物质结合形成沉淀，或在有氧条件下发生氧化聚合，进一步减少可溶性酚类的含量[36]。
图5 和田红葡萄酒发酵过程中总酚和总黄酮含量的变化
Fig. 5 Changes in total phenols and total flavonoids contents during Hetianhong wine fermentation
2.3.2 和田红葡萄酒发酵过程中抗氧化能力的变化
由图6可知，随着发酵时间在24～96 h范围内的增加，和田红葡萄酒对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基的清除率均增加；当发酵96 h时，对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基的清除率达到最高值，分别为80.4%、84.2%和69.8%；发酵时间＞96 h，DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基的清除率均下降。其原因可能是，由于发酵过程中乙醇含量升高，导致原料中抗氧化物质的合成以及葡萄原料中多酚类物质的持续溶出，使抗氧化活性提高，但伴随发酵时间的延长、活性成分的氧化与降解、微生物代谢能力下降、酶活性丧失以及底糖浓度降低等因素的共同作用，酵母代谢产物与酚类、黄酮类物质之间发生反应，致使具有抗氧化活性的成分含量减少，进而引起葡萄酒的整体抗氧化活性逐渐下降[37]。
图6 和田红葡萄酒发酵过程中DPPH、ABTS阳离子及羟自由基清除率的变化
Fig. 6Changes in the scavenging rates of DPPH radical, ABTS cation radical and hydroxyl radical during Hetianhong wine fermentation
2.4 和田红葡萄酒品质指标相关性分析
由图7可知，酵母菌数与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基清除率，总酚、总黄酮含量，乙醇生成量呈正相关关系，与总糖含量呈负相关关系，且相关性均极显著（P＜0.01）；总糖含量与酵母菌数，DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基清除率，总酚、总黄酮含量及乙醇生成量呈负相关关系，且相关性均极显著（P＜0.01）；乙醇生成量与总糖含量呈极显著负相关（P＜0.01），与DPPH自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05），与酵母菌数、ABTS阳离子自由基及羟自由基清除率、总酚及总黄酮含量呈极显著正相关（P＜0.01）；DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基相互之间呈正相关关系，由上说明微生物活动促进了糖的消耗与乙醇生成，同时可能通过代谢释放或合成抗氧化物质（如多酚类化合物），从而增强自由基清除能力，这与上述结果一致。总糖含量与其他指标呈负相关，进一步说明残糖量是发酵程度的反向指标：发酵越彻底，糖含量越低，乙醇体积分数和抗氧化活性越高。
图7 和田红葡萄酒品质指标相关性分析
Fig. 7Correlation analysis between quality indicators
3 结 论
本研究以和田红葡萄为原料，采用MS型酵母发酵制备和田红葡萄酒，采用Logistic、DoseResp及Boltzmann模型对和田红葡萄酒发酵过程中酵母菌生长、总糖消耗及乙醇生成进行非线性拟合。结果表明，酵母菌生长及总糖消耗动力学模型均可用DoseResp模型进行拟合，乙醇生成动力学模型可用Boltzmann模型进行拟合，且拟合决定系数R2均大于0.99，能较好地描述和田红葡萄酒的发酵过程。和田红葡萄酒发酵过程中，总酚、总黄酮含量及DPPH自由基、羟自由基和ABTS阳离子自由基清除率均呈先上升后下降的趋势。相关性分析表明，总糖含量与酵母菌数，DPPH自由基、羟自由基和ABTS阳离子自由基清除率，总酚、总黄酮含量及乙醇生成量均呈极显著负相关 （P＜0.01）。本研究对和田红葡萄酒发酵动力学及抗氧化能力进行分析，为和田红葡萄酒的规模化生产提供了理论依据。
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