现代药理研究发现黄芪有效成分主要有皂苷、黄酮、多糖和氨基酸4种，其中黄酮类化合物多达30余种，包括黄酮、异黄酮、异黄烷和紫檀烷4大类[1]。黄酮在增强免疫[2]、保护血管细胞[3]、抗氧化[4]、抗炎[5-6]、降糖[7]、抗肿瘤[8]等方面发挥药理作用。然而，在黄酮的研究和应用中，因其溶解度低、毒性较大、吸收差等缺点导致制剂困难，阻碍了其进一步的开发利用[9-11]。为解决这些问题，国内外采用化学合成和微生物发酵2种方法对黄酮类化合物进行结构修饰[12-13]。其中，利用微生物发酵中药具有诸多优势，包括提高药效、提高活性成分含量、产生新化合物、降低毒副作用、浓缩活性成分等[13-14]。众多微生物中，利用光合细菌的代谢作用对中药进行加工和转化具有广阔的发展前景，且在发酵单味中药和复方制剂的研究方面均已取得显著进展[15-16]。例如，斑蝥临床上常用于治疗肿瘤，但斑蝥素对肾功能有较大损伤，限制了其临床应用，经球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）发酵后，斑蝥的毒性明显降低，且斑蝥发酵液的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位均对人肝癌细胞株HepG2有抑制作用[16]。研究表明，槲寄生正丁醇部位经球形红细菌发酵后抗氧化活性和细胞毒活性均升高[17]，并且获得了2种新的具有抗氧化活性的物质[18]。
目前，针对黄芪的生物转化研究，主要集中于利用益生菌（如乳杆菌、肠道菌）进行发酵。益生菌发酵能有效转化黄芪中的异黄酮苷为相应的苷元，显著提高转化率[19]。研究表明利用沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）发酵黄芪，可以促进黄芪甲苷的释放[20]。然而，现有研究普遍存在以下局限：主要关注发酵后药物总有效成分（如总黄酮、总多糖）含量的增减[19]，或不同提取部位整体药理活性（如抗氧化、抗肿瘤）的变化[16,18]，对发酵过程中产生的具体活性分子的结构变化及其介导药理活性的分子机制尚缺乏系统深入的阐明。肠道菌群对总黄酮的发酵（如去糖基化、去甲基化等）可产生具有活性的新代谢物[21]，但针对光合细菌发酵黄芪黄酮后具体分子层面的变化及其与活性关联的研究仍较少。另外，尽管益生菌发酵黄芪的研究取得进展，但利用光合细菌发酵黄芪，特别是其核心活性成分黄酮类物质亟待深入研究。
因此，深入解析光合细菌对黄芪总黄酮的发酵过程及其产物活性变化的影响，是突破当前研究瓶颈的关键。本研究采用沼泽红假单胞菌对黄芪总黄酮进行发酵。采用超高效液相色谱-四极杆线性离子阱质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole linear ion trap mass spectrometry，UPLC-QTRAP-MS）技术系统比较发酵前后黄芪中总黄酮组成与含量差异，评价其抗氧化活性并分析发酵产物与活性变化的关联，为深入理解光合细菌发酵总黄酮的机制及开发新型黄芪黄酮制品提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沼泽红假单胞菌 中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为1.2181；黄芪饮片（批号221101） 山西维康堂中药饮片有限公司。
甲醇、甲酸、乙腈、异丙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨 北京索莱宝科技有限公司；牛肉膏（生化试剂） 上海博威生物医药有限公司；氯化钠（分析纯） 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；黄豆苷（纯度≥98%）、黄豆素苷（纯度≥98%）、芒柄花素（纯度≥98%）、金雀异黄苷（纯度≥98%）、阿魏酸标准品（纯度≥98%）、同位素标准品（纯度≥98%） Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
1290 Infinity UPLC仪 美国Waters公司；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美国Waters公司；6500＋QTRAP型质谱仪 上海SCIEX公司；Ostro 25 mg 96孔板 Waters科技（北京）有限公司；LRH-250型人工气候培养箱、BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Hi-mac CR22G型低速大容量离心机 日本Hitachi公司；JY96-IIN型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-6100型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；RE-1020型旋转蒸发仪 郑州海奇仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黄芪总黄酮的制备
采用乙醇加热浸提，辅助超声波法提取黄芪总黄酮[22]。准确称取黄芪根部饮片100 g，粉碎，过60目筛。按液料比30∶1（mL/g）加入乙醇，65 ℃加热浸提2 h后，350 W超声12次（超声9 s，停3 s），过滤，重复3次，合并滤液。70 ℃旋转蒸发进行浓缩处理，60 ℃下将浓缩液烘干，得到黄芪总黄酮粉末10 g，得率10%，保存备用。
1.3.2 菌株的活化与扩大培养
将冷冻保藏的沼泽红假单胞菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基（pH 7.0）中，培养基充满瓶体以满足厌氧状态，37 ℃静置恒温培养6 d，按照1%接种量将活化菌液接入新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行扩大培养（37 ℃培养6 d），使最终沼泽红假单胞菌浓度为1×106 CFU/mL，即得发酵种子液。取种子液样品，每24 h取样一次，测量其在波长660 nm处的光密度值（OD660 nm值），获得菌体生物量并绘制该菌株的生长曲线。
1.3.3 沼泽红假单胞菌发酵黄芪总黄酮
参照文献[23]，取1.3.1节中获得的黄芪总黄酮干粉添加到灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，使其终质量浓度为1 g/L，按10%接种量接种沼泽红假单胞菌种子液，于30 ℃光照厌氧静置发酵，以发酵液中沼泽红假单胞菌生物量为依据，当该菌株处于生长稳定期时（8 d）结束发酵，得到发酵后的黄芪总黄酮样品。
1.3.4 黄芪总黄酮组成成分分析
样品前处理：取适量发酵种子液8 000×g离心10 min，取上清液用乙酸乙酯等体积萃取，辅助超声 30 min（350 W超声9 s，停3 s），重复3次，合并萃取液，萃取液旋转蒸发进行浓缩，即得发酵后黄芪总黄酮乙酸乙酯相。萃取后的水相部分浓缩，即得发酵后黄芪总黄酮水相。分别取适量两相待测样加入混合同位素内标和预冷甲醇/水溶液（7∶3，V/V），涡旋混合，水浴超声0.5 h，14 000×g 、4 ℃离心20 min，吸取上清液至96孔板中，使用正压装置进行过滤，将孔内滤液吸出转移至2 mL离心管中，-80 ℃冻存。
UPLC条件：样品经ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分离，柱温40 ℃，流速400 μL/min，进样量2 μL。流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：0～3 min，5%～20% B； 3～9 min，20%～45% B；9～11 min，45%～95% B；11～13 min，95% B；13～13.1 min，95%～10% B；13.1～15 min，10% B。
MS条件：电喷雾电离，正/负离子切换扫描模式，离子源温度550 ℃；喷雾电压：正离子模式下为5 500 V、负离子模式下为-4 500 V，雾化气压力55 psi，辅助气压力50 psi，气帘气压力30 psi；采用多反应监测模式扫描。
定性定量分析：采用Multiquant 3.0.2软件提取目标物色谱峰并计算其峰面积及保留时间，利用目标物的标准品校正保留时间进行定性。采用同位素内标法对类黄酮各组分进行相对定量分析。
1.3.5 总黄酮含量测定
总黄酮含量测定：采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[24]。绘制芦丁标准工作曲线，得到回归方程y＝6.946 4x-0.009 9，R2＝0.999 5，根据标准曲线回归方程计算黄芪总黄酮含量。
1.3.6 抗氧化活性测定
羟自由基清除率的测定：参照侯学敏等[25]的方法。取6支10 mL比色管，加入9 mmol/L的FeSO4溶液和水杨酸溶液各1 mL，不同质量浓度（50、100、150、200、250 μg/mL）的待测总黄酮样品1 mL，空白对照以蒸馏水代替，最后加入8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL，35 ℃水浴30 min，于510 nm波长处测吸光度。由于液体样品本身具有吸光度，测其本底值时用蒸馏水代替H2O2。根据式（1）计算羟自由基清除率：
式中：A0为空白对照吸光度；Ax为加入待测样液的吸光度；Ax0为本底吸光度。
超氧阴离子自由基清除率的测定：参照张春梅等[26]的方法。分别取pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于干燥的比色管中，20 ℃水浴25 min，每管中分别加入不同质量浓度（50、100、150、200、250 μg/mL）的待测总黄酮样品0.1 mL及30 ℃预热的3 mmol/L邻苯三酚0.3 mL，混匀后20 ℃水浴6 min，随即加入1 mL 0.1 mol/L的HCl终止反应，于320 nm处测吸光度。以蒸馏水作为空白对照。根据式（2）计算超氧阴离子自由基清除率：
式中：A0为空白对照吸光度；Ax为加入待测样液吸光度。
1.4 数据处理
采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，组间数据比较采用单因素方差分析（P＜0.05表示差异显著）。
2 结果与分析
2.1 沼泽红假单胞菌的生长曲线
如图1所示，菌株具有良好的生长性能，在0～2 d生长缓慢，处于生长延滞期；2～5 d生长迅速，为对数生长期，此时菌体细胞生长速率达到最大；5～8 d生长趋于稳定，细胞生长速度几乎为0，此时菌体数量达到最大值，OD660 nm值在0.9左右浮动，处于生长稳定期，重要发酵产物在此期间大量积累并达到最高峰[27]。参照沼泽红假单胞菌生长曲线及细菌生长各时期的特点，选取对数生长期的菌液作为发酵种子液。当发酵时间为8 d，菌种处于稳定期，此时结束发酵。
图1 沼泽红假单胞菌的生长曲线
Fig. 1Growth curve of R. palustris
2.2 沼泽红假单胞菌对黄芪发酵液中黄芪总黄酮含量的影响
发酵前培养液中黄芪总黄酮质量浓度为11.20 mg/L，经沼泽红假单胞菌发酵后，乙酸乙酯萃取液中总黄酮质量浓度为（25.74±2.75）mg/L，水相中总黄酮质量浓度为（12.08±2.69）mg/L，表明发酵后黄芪总黄酮主要成分位于乙酸乙酯相。较发酵前，总黄酮质量浓度 （37.82 mg/L）提高237.68%。
2.3 沼泽红假单胞菌发酵对黄芪总黄酮组成成分的影响
如图2所示，发酵前黄芪总黄酮主要包括15个洗脱峰，按照洗脱时间先后分别编号1～15。经沼泽红假单胞菌发酵后，乙酸乙酯相检测到9个洗脱峰，而水相中仅检测2个洗脱峰。对比发酵前可以发现，发酵后总黄酮中主要成分的极性发生了变化，一些强极性物质的含量明显下降，极性中等或者偏弱的物质为主要成分。
图2 发酵前后黄芪总黄酮总离子流色谱图
Fig. 2Total ions chromatograms of the total flavonoids of A. membranaceus before and after the fermentation
由表1可知，发酵前，共检测到15种类黄酮组分，包括8种异黄酮、2种酚酸、2种黄酮、1种查耳酮和2种特殊结构的类黄酮，其中异黄酮苷（黄豆苷、黄豆素苷、金雀异黄苷）和异黄酮苷元（黄豆苷元、黄豆素、金雀异黄素、芒柄花素、樱黄素）的相对含量分别为36.20%和28.22%。与发酵前相比，发酵后乙酸乙酯相中检测到的异黄酮苷元（黄豆苷元、黄豆素、金雀异黄素、芒柄花素）相对含量显著提升至79.07%，水相中异黄酮苷元（芒柄花素）相对含量显著提升至99.32%。这一现象与微生物介导的去糖基化反应密切相关。研究已证实，微生物分泌的β-葡萄糖苷酶、α-鼠李糖苷酶等水解酶可以特异性断裂黄酮糖苷的糖苷键，释放苷元[19,28-29]。本研究中异黄酮苷含量下降，相对应异黄酮苷元含量上升，意味着沼泽红假单胞菌具有类似的去糖基化能力。结合图2可以看出发酵后黄芪中部分类黄酮组分的极性发生了变化，极性变化的主要原因表现在2个方面，其一是异黄酮苷经发酵水解脱去一个富含羟基的葡萄糖基团，导致极性减弱[19]；其二是酚酸类分子的相对含量减少，如阿魏酸含有强极性的羧基（—COOH），而芒柄花素含有弱极性的甲氧基（—OCH3）[12]。另外，发酵后检测到紫铆素（黄酮醇）和甘草素（二氢黄酮）相对含量上升，这可能是光合细菌的还原酶系催化了黄酮母核的加氢或环化反应[30]。类似地，黑曲霉可催化二氢黄酮碳环裂解生成苯丙酸类产物[28]，在本研究中检出强极性苯丙氨酸（图2，保留时间1.75 min），暗示光合细菌也可能存在相似的代谢途径。
表1 发酵前后黄芪中黄酮类化合物的UPLC-QTRAP-MS检测结果
Table 1Detection results of flavonoids from A. membranaceus before and after the fermentation analyzed by UPLC-QTRAP-MS
间/min化合物相对含量/%14.05黄豆苷4.3524.26黄豆素苷8.5377.45黄豆苷元5.0530.8177.45黄豆苷元5.0530.8197.69黄豆素4.0120.35118.73柚皮素0.63.09编号保留时发酵前发酵后乙酸乙酯相发酵后水相34.50对香豆酸11.7645.02阿魏酸17.0866.54紫铆素0.823.2887.61甘草素2.147.9366.54紫铆素0.823.2887.61甘草素2.147.93107.84木樨草素0.780.960.68128.79金雀异黄素2.29.33139.61异甘草素2.41.57149.84芒柄花素15.2518.5899.321510.66樱黄素1.714.10
2.4 发酵前后黄芪总黄酮抗氧化活性比较
2.4.1 发酵前后黄芪总黄酮对羟自由基清除作用
由图3可知，以VC为对照，3种总黄酮提取液随着质量浓度的增加，对羟自由基清除率均逐渐升高，这与侯宝龙[31]、侯敏娜[32]等的研究结论一致。发酵后水相中总黄酮对羟自由基的清除率始终极显著高于发酵前（P＜0.01），可能源于微生物发酵对黄酮苷类的水解作用，释放出更多活性苷元（芒柄花素），而苷元因分子质量小、酚羟基暴露更充分，更易提供氢原子终止自由基链式反应[33]。发酵后乙酸乙酯相总黄酮在低质量浓度（＜150 μg/mL）时对羟自由基的清除率最低，但高质量浓度（＞150 μg/mL）时清除率急剧上升，高于发酵前，当质量浓度为250 μg/mL时，对羟自由基清除率达到最高，为81.1%。这一现象可能与乙酸乙酯富集的脂溶性黄酮（如黄豆素、金雀异黄素、芒柄花素等）在高浓度下协同增效有关，不同天然分子之间的协同作用增强其抗氧化能力[34]。综上，沼泽红假单胞菌发酵后黄芪总黄酮对羟自由基的清除率显著提高。
图3 发酵前后黄芪总黄酮羟自由基清除率
Fig. 3Scavenging rates of hydroxyl radicals by total flavonoids of A. membranaceus before and after the fermentation
2.4.2 发酵前后黄芪总黄酮对超氧阴离子自由基清除作用
由图4可知，随着3种总黄酮提取液含量的增加，对超氧阴离子自由基清除率逐渐升高。3组总黄酮提取液对超氧阴离子自由基的清除率均低于VC，但在高质量浓度（250 μg/mL）时差距显著缩小，VC对超氧阴离子自由基的清除率仅高于乙酸乙酯相1.07倍。这表明尽管总黄酮的初始活性较弱，但其浓度依赖性优于VC，通过提高剂量可提升其抗氧化效能。黄芪总黄酮中不同成分对羟自由基和超氧阴离子自由基的亲和力和反应机制不同，导致清除效果存在差异。当样品质量浓度为250 μg/mL，发酵后乙酸乙酯相的总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率最高，为53.6%，显著高于发酵前及发酵后水相。这一结果与陈星宇[33]、张鑫[35]等的构效分析相符，即乙酸乙酯相黄酮苷元分子中的—OH未被糖基化，其供电子能力更强，而超氧阴离子自由基属于阴离子自由基，其清除能力与抗氧化成分的电子转移能力相关。综上，沼泽红假单胞菌发酵后黄芪总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率显著提高。
图4 发酵前后黄芪总黄酮超氧阴离子自由基清除率
Fig. 4Scavenging rates of superoxide anion radicals by total flavonoids of A. membranaceus before and after the fermentation
3 结 论
本研究对比了经沼泽红假单胞菌发酵前后黄芪总黄酮组成成分及抗氧化活性变化。结果表明，发酵后乙酸乙酯相中总黄酮质量浓度为（25.74±2.75）mg/L，水相中总黄酮质量浓度为（12.08±2.69）mg/L。较发酵前，总黄酮含量提高237.68%。对比发酵前，发酵后异黄酮苷含量显著减少，而对应活性苷元含量显著增加，表明发酵过程中发生了以水解脱糖基为主的反应，所产生的活性苷元分子更易被肠道吸收，显著增强黄芪总黄酮的体内活性。发酵后黄芪总黄酮抗氧化能力显著提升，当样品质量浓度为250 μg/mL时，乙酸乙酯相总黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率达到最高，分别为81.1%和53.6%。发酵后水相中芒柄花素相对含量高达99.32%，揭示微生物发酵可定向富集高活性黄酮单体，可为后续针对性制备芒柄花素的分离工艺提供参考。
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