茶是全球重要的植物饮料，中国茶叶产销量位居首位。普洱茶作为我国地理标志黑茶[1]，因其独特风味和抗氧化[2]、调节血糖[3]、抗肥胖[4]、调节肠道[5]等保健功能，广受全球消费者青睐。茶叶生产加工及日常消费会产生大量茶渣，造成环境污染和资源浪费，是茶行业亟待解决的问题[6]。因此，对茶渣进行高值化利用具有重要的经济价值和社会意义。
茶渣中最丰富的物质是膳食纤维，但以不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）为主，存在功能单一、应用受限的问题，需要通过改性提高可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）含量及应用价值。物理法、化学法、发酵法是常用膳食纤维改性方法。Xing Yunhao等[7]采用蒸汽爆破法对绿茶渣膳食纤维改性，将SDF得率提升了86%，且其膨胀力、持水力和持油力均有改善。Huang Hairong等[8]通过高温蒸煮辅助酶法改性茶渣膳食纤维后SDF得率提升至15.1 g/100 g，且持水力、持油力和膨胀力分别提升71.17%、57.2%和80.55%。发酵法具有绿色、安全、高效、低成本的优势，是膳食纤维可溶性改造的常用方法[9]。发酵过程中产生的有机酸可降解IDF形成可溶性物质[10]，纤维素酶等还能破坏糖苷键，将纤维素等大分子分解转化为SDF，进而优化其理化与功能特性[11-12]。目前常用于膳食纤维发酵改性的菌种有霉菌（如毛霉、米曲霉、黑曲霉（Aspergillus niger）、绿色木霉、红曲霉等）、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等[12-13]。Si Jingyu等[14]利用草井弯孢菌（Curvularia kusanoi）、普乌拉曲霉（Aspergillus puulaauensis）对茶渣膳食纤维进行单菌及混菌发酵改性，结果发现SDF得率分别增加50.51%、61.41%和127.02%，且改性后SDF结构更加疏松多孔，持水力、持油力显著提升。Li Maiquan等[15]采用冠突散囊菌（Eurotium cristatum）发酵改性红茶渣，结果发现发酵后SDF得率比未发酵提高2.16倍。目前，虽然发酵法提升了茶渣膳食纤维SDF的得率，但其菌种的选择及改性效率仍需进一步探究。本课题组前期研究了黑曲霉、绿色木霉、米根霉发酵普洱茶渣过程中产纤维素酶情况，发现黑曲霉发酵茶渣产纤维素酶活力最高[16]。故选用黑曲霉作为后续茶渣发酵改性菌种。本研究通过黑曲霉发酵改性普洱茶渣膳食纤维。采用单因素和响应面试验获得最佳发酵工艺条件，以提高SDF得率。随后通过理化性质分析揭示其发酵改性后性能特性，以期改善普洱茶渣膳食纤维的功能特性，提高其综合利用价值。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
普洱茶渣 天士力帝泊洱生物茶集团有限公司；黑曲霉TFCP100008 天津科技大学系统微生物与生物制造研究室分离并保存；纤维素酶检测试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂、蛋白胨、酵母膏 北京奥博星生物科技有限公司；热稳定α-淀粉酶（4.0×104 U/g）、木瓜蛋白酶（8.0×105 U/g） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
普洱茶渣发酵培养基：普洱茶渣粉末67 g，加入1 L蒸馏水，充分混匀，在121 ℃灭菌30 min，冷却至室温备用。
1.2 仪器与设备
WGLL-125BE电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；S20K pH计、XSR105DU电子分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JIDI-21D高速离心机广州吉迪仪器有限公司；ZHJH-C1109C超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；Apreo扫描电镜 美国FEI公司；SX2-2.5-10马弗炉 天津市中环实验电炉有限公司。
1.3 方法
1.3.1 普洱茶渣预处理
将普洱茶渣粉碎至80目，烘干备用。
1.3.2 发酵法制备普洱茶渣膳食纤维
参考Jia Mengyun等[17]的方法稍作修改。将黑曲霉TFCP100008按照9%接种量接种于普洱茶渣发酵培养基，在pH值为5的发酵条件下发酵3 d，将发酵悬浮液121 ℃灭活，冷却至室温。调pH值为6.5，加入热稳定α-淀粉酶（0.01 g/g），于95 ℃水浴中孵育30 min。冷却至室温后将混合物pH值调节至6，加入木瓜蛋白酶（0.005 g/g），60 ℃水浴1 h。随后在沸水中加热10 min灭酶，冷却至室温后4 000 r/min离心10 min，抽滤，将上清液和沉淀分离。抽滤所得沉淀在4 000 r/min条件下离心10 min，离心所得沉淀在-80 ℃真空冷冻干燥即得IDF，称质量（m1）；将抽滤所得富含SDF的上清液旋蒸浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，放置于4 ℃沉淀。醇沉12 h后，4 000 r/min离心10 min，将离心所得絮凝物在-80 ℃真空冷冻干燥，将冷冻干燥后的产物研磨成粉末，即得SDF，称质量（m2）。根据下式计算SDF得率：
1.3.3 发酵制备普洱茶渣膳食纤维工艺优化
1.3.3.1 单因素试验
设置初始条件为发酵培养基pH 5，接种量9%，茶渣与蒸馏水料液比1∶15（g/mL），121 ℃条件下灭菌20 min，发酵时间3 d。通过改变单一变量，考察发酵时间（1、2、3、4、5 d）、培养基pH值（3、4、5、6、7）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g/mL）、接种量（3%、6%、9%、12%、15%）对SDF得率的影响。
1.3.3.2 响应面试验
在单因素试验结果基础上，基于Box-Behnken中心组合，设计4因素3水平的试验方案。以发酵时间（A）、培养基pH值（B）、料液比（C）以及接种量（D）为考察因素，以SDF得率为评价指标进行响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素及水平
Table 1Factors and levels of Box Behnken tests design for fermentation conditions optimization
因素-1水0平1A发酵时间/d234 B pH456 C料液比（g/mL）1∶51∶101∶15 D接种量/%6912
1.3.4 扫描电镜观察普洱茶渣膳食纤维微观结构
在样品盘上涂抹导电胶，用镊子放置少量样品，吹去残渣。喷金处理后，将样品盘安装于扫描电镜样品室并抽真空。在5.0 kV加速电压下扫描、观察样品。
1.3.5 普洱茶渣膳食纤维理化性质分析
持水力的测定：取0.50 g发酵改性前后的样品于15 mL离心管中，记质量。加10 mL蒸馏水，静置24 h。4 000 r/min离心25 min，去上清液，测质量。根据下式计算持水力：
式中：m0表示干燥样品质量/g；m1表示样品与离心管质量/g；m2表示充分吸水除去上清的样品和离心管质量/g。
膨胀力的测定：在10 mL量筒中加入0.25 g样品，记录初始体积V1，随后加入5 mL去离子水并混匀，静置12 h后测定膨胀体积V2，根据下式计算膨胀力：
式中：V2表示样品吸水膨胀体积/mL；V1表示样品未吸水体积/mL；m0表示样品质量/mg。
持油力的测定：在50 mL离心管中加0.50 g样品，测总质量m1。加4.00 g植物油，37 ℃水浴4 h。4 000 r/min离心15 min，倒掉上层油，测定总质量m2。根据下式计算持油力：
式中：m0表示干燥样品质量/g；m1表示样品与离心管质量/g；m2表示充分吸油后除去上层油的样品和离心管质量/g。
1.4 数据分析处理
采用GraphPad Prism 8、Design-Expert 13.0、Origin 2021和SPSS 25软件对实验数据进行处理、方差分析和绘图，实验数据采用
的形式表示，显著性差异以P＜0.05为标准。
2 结果与分析
2.1 发酵制备普洱茶渣膳食纤维工艺优化单因素试验结果
2.1.1 发酵时间对茶渣SDF得率的影响
由图1可知，随着发酵时间延长，SDF得率呈先升后降趋势，第3天时达峰值10.16%。发酵时间小于3 d时，可能是由于发酵时间不足，菌种数量少导致发酵过程不彻底，发酵时间的不足亦可能不利于纤维素酶的生成[18]；发酵4 d时，SDF得率下降，可能是生长到一定阶段后，营养基质被消耗，当缺乏必需营养物质时，微生物转而消耗小分子糖，茶渣膳食纤维分解成更小分子质量的成分，难以提取，也可能由于产生了某些不利于微生物生长的物质，导致菌种活性下降，进而使得酶的产生减少，使得SDF得率下降[19]。因此最佳发酵时间为3 d。
图1 发酵时间对SDF得率的影响
Fig. 1Effect of fermentation time on yield of SDF
2.1.2 pH值对茶渣SDF得率的影响
由图2可知，随着pH值的增大，SDF得率呈现先增大后减小的趋势，pH值为5时达到最大值（10.77%）。SDF得率变化与菌种最适pH值有关。多数菌种生长的最适pH值范围为6.3～7.5，而黑曲霉最适生长pH值为5[20]。若环境的pH值偏离此范围，将导致菌体的生长速率减缓，进而对酶的产生效果产生不利影响。这是茶渣中SDF得率在pH＞5后下降的原因。因此最适pH值为5。
图2 pH值对SDF得率的影响
Fig. 2Effect of pH on yield of SDF
2.1.3 料液比对茶渣SDF得率的影响
由图3可知，随着料液比降低，SDF得率呈现先上升后下降的趋势，并逐渐趋于平缓，该趋势与王晓颖等[21]通过黑曲霉发酵制备柚子皮SDF结果一致。当料液比高于1∶10（g/mL）时，水分过少会导致原料与发酵剂接触不充分，同时还会影响菌体生长及产酶速度[22]；在水分缺乏的情况下，黑曲霉生长受限，生物量降低，减少了其与底物的有效接触，从而削弱了酶与膳食纤维的相互作用，最终导致SDF的产率降低[23]。当料液比为1∶10（g/mL） 时，SDF得率达到最大，为10.31%。当料液比低于 1∶10（g/mL）时，培养基水分含量过高，通气性下降，阻碍氧气向黑曲霉（好氧菌）的传递，从而抑制其生长[24]。因此最佳料液比为1∶10（g/mL）。
图3 料液比对SDF得率的影响
Fig. 3Effect of liquid-to-material ratio on yield of SDF
2.1.4 接种量对茶渣SDF得率的影响
由图4可知，随着接种量增加，SDF得率呈现先上升后下降的趋势，该趋势与符慧珍等[23]对黑曲霉改性葛渣膳食纤维的研究结论一致。当接种的微生物菌体量低于9%时，可能由于菌种数量不足，导致发酵过程无法充分进行，从而使得SDF的累积量减少[25]。接种量为9%时，茶渣SDF得率达到最大值，为10.36%。当接种量高于9%时，可能会因黑曲霉数量过多而引起氧气和营养物质供应不足，进而影响黑曲霉正常发酵过程，最终导致产酶量减少，使得SDF得率下降[26]。因此最适接种量为9%。
图4 接种量对SDF得率的影响
Fig. 4Effect of inoculum on yield of SDF
2.2 发酵制备普洱茶渣膳食纤维工艺优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验设计方案及结果
以发酵时间（A）、pH值（B）、料液比（C）、接种量（D）为自变量，SDF得率（Y）为因变量，设计响应面试验，并用Design-Expert 13.0建立数学模型，试验设计及结果见表2。方差分析结果见表3。
表2 发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 2Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization
试验号A发间酵/d时B pHC（料g/m液L比）D接种量/%SDF得率/%1441∶1098.852361∶1067.913241∶1097.714361∶10127.475351∶569.386351∶10911.777451∶10127.888351∶10911.639251∶599.4710351∶10911.6311341∶5910.3712341∶1067.4413351∶10911.9514351∶15129.4715251∶10128.1516341∶1597.6217361∶598.4918451∶1068.7619351∶1568.6320451∶15910.0221461∶1097.6122251∶15911.2423251∶1068.4424351∶10912.1125361∶15910.7126341∶10126.5127451∶5910.5728351∶5128.3729261∶10910.48
表3 回归模型方差分析
Table 3Variance analysis of regression model
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性总模型72.34145.1757.24＜0.000 1**A0.270 010.270 02.990.105 7 B1.4511.4516.050.001 3**C0.090 110.090 10.998 5 0.334 6 D0.612 010.612 06.780.020 8*AB4.0214.0244.53＜0.000 1**AC1.3511.3514.910.001 7**AD0.087 010.087 00.964 00.342 8 BC6.1816.1868.41＜0.000 1**BD0.060 010.060 00.664 90.428 5 CD0.855 610.855 69.480.008 2**A27.5117.5183.20＜0.000 1**B227.99127.99310.07＜0.000 1**C21.2111.2113.350.002 6**D 238.06138.06421.62＜0.000 1**残差1.26140.090 3失拟项1.09100.108 82.480.198 0误差项0.175 740.043 9总和73.6128
注：*.显著（P＜0.05）；**.极显著（P＜0.01）。
由表3可知，失拟项P值为0.198 0，大于预设的显著性水平0.05，这表明模型具有良好的拟合效果。调整后决定系数
达到0.965 7，这表明模型具有高度的解释能力，能够解释96.57%的实测数据变异性。F值分析揭示了影响SDF得率的主要因素排序为：pH值（B）＞接种量（D）＞发酵时间（A）＞料液比（C）。具体而言，一次项B对结果影响极显著（P＜0.01），D对结果影响显著（P＜0.05），而A、C对结果影响不显著（P＞0.05）。进一步分析交互作用显示，AB、AC、BC和CD的交互作用极显著（P＜0.01），其余因素间的交互作用（AD、BD）不显著（P＞0.05）。二次项A2、B2、C2、D2极显著（P＜0.001）。
2.2.2 响应面图分析
两因素之间的等高线呈椭圆形且越密集，坡度越陡，表明交互作用越显著[27]；由图5可知，AD和BD等高线近似圆形，响应曲面坡度不大，说明pH值和接种量、发酵时间和接种量之间交互作用对SDF得率的影响不大；BC、AB、AC和CD的等高线近似椭圆形，其中BC曲面拱形更陡峭，等高线更密集；且沿pH值轴等高线密集，沿料液比轴稀疏，表明pH值对SDF得率的影响大于料液比。该结果与方差分析结果一致。
图5 各因素交互作用对茶渣膳食纤维得率影响的响应面和等高线图
Fig. 5Response surface line and contour plots of effect of interaction among various factors on the yield of dietary fiber from tea residue
2.3 最佳提取条件的预测和验证
经Design-Expert 13.0软件分析得到最佳发酵工艺为：发酵时间2.43 d，pH 5.52，料液比为1∶14.86（g/mL），接种量9.22%。根据实际操作条件，发酵工艺条件修正为：发酵时间2.5 d、pH值为5.5、料液比1∶15（g/mL）、接种量9%，在此工艺参数条件下进行验证，重复操作3次，得到的SDF得率为12.07%，与理论预测值12.11%相差不大，证实该回归模型能真实反映各因素对响应值的影响，具有良好预测性。
2.4 茶渣膳食纤维基本结构分析
2.4.1 扫描电镜分析
由图6可知，在200倍放大倍数下观察到未发酵茶渣膳食纤维（unfermented tea residue dietary fiber，UDF）以杆状和大颗粒状形态存在。而发酵茶渣可溶性膳食纤维（fermented tea residue soluble dietary fiber，FSDF）以小碎片状和小颗粒状形态存在。说明经过发酵改性后，茶渣膳食纤维大颗粒状和棒状结构发生破碎与断裂。1 000倍 放大倍数下观察到UDF表面结构致密光滑，无孔状结构。FSDF表面结构疏松多孔，且进一步断裂成小碎片状结构。Luo Xianliang等[28]通过改性竹笋膳食纤维，发现经过纤维素酶改性的竹笋膳食纤维变得疏松多孔，内部结构暴露，疏松结构利于膳食纤维水化与吸附，与本研究结果一致。Yang Chenxi等[29]利用绿木霉和黑曲霉对脐橙皮进行发酵，结果发现黑曲霉可以促进纤维素酶的生成从而将纤维素降解为单糖。研究结果表明，茶渣膳食纤维发酵改性后微观结构发生改变，可能是由于其中不溶性的纤维素等大分子被降解所致。
图6 茶渣膳食纤维发酵改性前后扫描电镜图
Fig. 6Scanning electron microscopy images of dietary fiber of tea residue before and after fermentation modification
2.4.2 普洱茶渣发酵前后膳食纤维理化性质分析
由图7可知，发酵后普洱茶渣的膳食纤维持水力、持油力及膨胀力相较于未经发酵的对照组呈现显著提升（P＜0.05），表明发酵后普洱茶渣膳食纤维的理化性质发生了改变，在持水、持油及膨胀性方面都有所提升。发酵改性后茶渣膳食纤维的持水力、持油力、膨胀力分别为（5.70±0.25）g/g、（4.26±0.20）g/g、（5.20±0.25）mL/g，与未发酵改性茶渣膳食纤维相比分别提高了19.28%、35.14%、53.85%。Li Yinxia等[30]通过乳酸菌发酵改性麦麸膳食纤维，改性后麦麸SDF的持水力、持油力、膨胀力分别显著增加了22.38%，8.89%，137.60%。同时，发酵可以将不可溶的大分子膳食纤维降解成小分子物质，也可使表面结构被破坏，更加疏松多孔，从而暴露更多的极性基团，并与水分子形成更多的氢键或偶极子，这有助于提高持水力和膨胀力。另外，更多的非极性基团暴露，导致持油力的增加[31]。由此可见，茶渣膳食纤维发酵改性后结构的改变，会进一步改善其理化特性，使其具有更好的生理功能。
图7 发酵改性茶渣膳食纤维基本理化性质
Fig. 7Basic physicochemical properties of tea residue dietary fiber by fermentation modification
3 结 论
本研究以普洱茶渣为原料，以黑曲霉为发酵菌种，通过微生物发酵法制备SDF，设计单因素试验和响应面试验对普洱茶渣的发酵改性工艺进行优化，得出最佳发酵工艺为发酵时间2.5 d、pH值为5.5、料液比 1∶15（g/mL）、接种量9%。此条件下SDF得率为12.07%，是发酵改性前（3.22%）的3.75倍。对发酵改性前后膳食纤维进行扫描电镜分析，经发酵改性处理的茶渣中的膳食纤维表面结构疏松多孔，并且进一步碎裂成细小的碎片状结构，表明茶渣中膳食纤维糖苷键断裂，分子质量减小，交联度下降；通过分析发酵前后膳食纤维理化性质的变化，发现发酵改性后其持水力、持油力、膨胀力均有显著增强。本研究利用黑曲霉发酵改性普洱茶渣膳食纤维，发酵处理使普洱茶渣膳食纤维结构疏松，持水力、持油力、膨胀力增强，提高了茶渣SDF含量和生理活性，使其成为优质膳食纤维的制备原料。本研究通过优化得到了茶渣膳食纤维发酵改性工艺，减少了茶渣资源浪费，为茶渣膳食纤维高值化利用和功能食品开发提供新的研究方法与策略，具有广泛的应用前景。
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