啤酒是以麦芽、水为主要原料，加啤酒花，经酵母发酵酿制而成的，富含二氧化碳的、具有起泡特性的低乙醇含量发酵酒[1]。在消费升级背景下，传统工业啤酒仅以麦芽为核心原料，因其风味单一、功能局限，难以满足消费者对高品质饮品的需求[2-4]。因此，基于传统酿造工艺，通过添加药食同源原料或其提取物，开发兼具独特风味与保健功效的新型啤酒，已成为突破产业发展瓶颈的关键方向[5-7]，目前已有蒲公英、甘露子、粉葛等药食同源原料应用于啤酒酿造的研究报道[8-10]。
薏米（Coix lacryma-jobi）作为典型的药食同源原料，富含多糖、多酚、植物甾醇等多种活性成分，兼具抗癌、抗炎、抗氧化等多重功效[11-14]。其总淀粉质量分数为57.82%～71.51%[15]，仅次于大米、小麦和玉米，是啤酒酿造的优质辅料。研究表明，酵母发酵可改善薏米的营养与生物学特性，提高其总酚含量、总黄酮含量及其体外抗氧化活性，还可增强其对酪氨酸酶、黄嘌呤氧化酶的抑制活性[16-17]。此外，经酿酒酵母发酵的薏米还具有抗类风湿性关节炎的作用[18]。因此，将其用于啤酒酿造，有望赋予啤酒独特风味与保健功效。虞思倩等[19]采用薏米与麦芽混合糖化后发酵的工艺制备薏米啤酒，当料水比为1∶4.76（g/mL）、薏麦比为0.2∶1（g/g）及发酵温度为10.64 ℃时，薏米啤酒感官评分为91.8。赵亚刚等[20]以薏米等6种全谷物作为啤酒辅料酿造啤酒，不会对啤酒的发酵和理化特性产生负面影响。然而，目前关于添加薏米对啤酒理化性质、抗氧化活性及感官特性影响的研究鲜有报道。
本研究以大麦芽、小麦芽和薏米糖化液为主要原料酿造薏米啤酒，以乙醇体积分数、总酸含量及感官评分为评价指标，采用单因素试验及响应面试验优化其发酵工艺条件，并分析其理化指标及抗氧化能力，以期促进薏米的高值化利用，为新型啤酒的研发提供理论依据与数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
薏米产地为贵州兴仁；澳洲大麦芽、小麦芽 潍坊蓝桥精酿啤酒原料有限公司；卡斯卡特酒花、马格努门酒花 济南双麦啤酒原料有限公司；US-05啤酒活性干酵母粉 法国弗曼迪斯酵母有限公司；中温α-淀粉酶 （4 000 U/g）、糖化酶（10万 U/g）、乳酸 山东圆鑫科技有限公司；福林酚、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS） 上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 天津市众联化学试剂有限公司；2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 福州飞净生物科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SM-3C高速多功能粉碎机 河北本辰科技有限公司；FLexA-200酶标仪、P4紫外-可见分光光度计 上海美普达科技有限公司；ZX-S24恒温水浴锅 上海知信实验仪器技术有限公司；PAL-1便携式数显折射计 爱宕科学仪器有限公司；ZWYR-D2401培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 薏米啤酒酿造工艺流程及操作要点
工艺流程：麦芽粉碎、糖化→麦汁煮沸（添加啤酒花）→过滤→静置冷却→发酵（接种啤酒活性干酵母，加入薏米糖化液）→低温冷贮→薏米啤酒成品。
操作要点：
薏米糖化液的制备：薏米洗净，70 ℃烘干40 min，粉碎，过60目标准筛，即得薏米粉。薏米粉按照料水比1∶8（g/mL）加水混匀，以薏米粉干质量计，添加25 U/g中温α-淀粉酶和280 U/g糖化酶，于64 ℃条件下酶解148 min；酶解后升温至100 ℃灭活10 min；200目滤布过滤后取滤液煮沸20 min，调整其糖度至（12±0.5）°Brix，备用。
麦芽粉碎：将大麦芽和小麦芽按质量比8.5∶1.5混合均匀，经粉碎机粉碎后过40目标准筛，备用。
麦汁糖化：料水比为1∶4（g/mL），52 ℃投料保持30 min，逐步升温至65 ℃保持60 min，逐步升温至72 ℃维持40 min，逐步升温至78 ℃维持15 min，直至糖化醪液碘试不呈色。糖化结束后，使用200目滤布过滤，收集澄清麦汁备用。
麦汁煮沸：麦汁煮沸时间控制在60 min，期间分3次添加酒花：煮沸5 min和30 min时分别添加30%的马格努门酒花，结束前15 min加入剩余40%的卡斯卡特酒花（酒花总添加量1.0 g/L，以麦汁体积计）。煮沸结束后经2次过滤，采用无菌水调整麦汁浓度至12 °P，冷却至室温。
接种与发酵：取麦汁200 mL，添加40 mL薏米糖化液，基于发酵液总体积接种0.6 g/L活化后的啤酒活性干酵母（加入10倍体积的无菌水30 ℃活化20 min），进行主发酵（20 ℃，8 d），期间每日监测发酵液糖度变化，待麦汁浓度降幅≤0.5 °P/d时终止主发酵；密封（4 ℃）后发酵7 d，即得薏米啤酒。采用相同工艺酿造，不添加薏米糖化液的啤酒作为对照组。
1.3.2 发酵条件优化
单因素试验：在上述工艺条件基础上，分别考察薏米糖化液添加时间（煮沸阶段、主发酵前、主发酵4 d、后发酵阶段）、薏米糖化液添加量（20、40、60、80、100 mL）、酵母接种量（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L）、原麦汁浓度（8、10、12、14、16 °P）对薏米啤酒感官评分（主要评价指标）、乙醇体积分数、总酸含量（参考指标）的影响。
响应面试验设计：在单因素试验结果的基础上，以薏米糖化液添加量（A）、酵母接种量（B）、原麦汁浓度（C）为自变量，感官评分（Y）为评价指标，进行 3因素3水平Box-Behnken响应面试验，优化其发酵条件，Box-Behnken响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1Factors and levels of Box-Behnken experimental design for fermentation condition optimization
水平A薏米糖化液B酵母接种量/添加量/mL（g/L）C原麦汁浓度/°P-1200.480400.6101600.812
1.3.3 指标检测
1.3.3.1 理化指标的检测
乙醇体积分数、真正发酵度、总酸体积分数、色度、泡持性的测定：参照GB/T 4927—2008《啤酒》的方法；pH值的测定：采用pH计；残糖的测定：采用 DNS法[21]。
1.3.3.2 活性成分的检测
总多酚含量的测定：采用福林酚法[22]；总黄酮含量的测定：采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[23]。
1.3.3.3 自由基清除率的检测
DPPH自由基清除能力的测定：参照赵亚刚[24]的方法；ABTS阳离子自由基清除能力的测定：参照Neto等[25]的方法。
1.3.4 感官评价标准
薏米啤酒的感官评分标准参照GB/T 4927—2008中的感官要求制定，由10名经感官培训的评价人员从外观、泡沫、香气、口感4个方面对薏米啤酒进行感官评价，满分为100分，其标准见表2。
表2 薏米啤酒的感官评价标准
Table 2Sensory evaluation criteria of coix seed beer
项目感官特性评分外（20观）色泽色色较泽泽明明暗亮亮淡，，，酒酒酒体体体较清浑清澈浊澈，，无，悬有明浮少显物量悬明浮悬显物浮物186～＜～18250泡（20沫）泡泡沫沫泡较沫粗细糙细腻腻，，色，较泽洁洁偏白白黄，，泡，泡泡持持性持性好性较差好186～＜～18250香（30气）有明显的啤麦啤酒芽酒整整香体体、香香调酒气花气，不较香无协协异、调调香薏，米，存无香在异，异且香味各香味协1265＜～～152350（口30感）味口口纯味味纯正不正，纯酒，正体酒，体协酒协调体稍调不差，协，口调感口，清感口较爽感清，寡爽后淡味，，后不后苦味味较，苦苦口1265＜～～132550
1.4 数据处理与统计分析
采用Excel 2019软件整理数据，用SPSS 25.0分析数据，Origin 2021软件绘图。
2 结果与分析
2.1 发酵条件优化单因素试验结果
2.1.1 薏米糖化液添加时间对薏米啤酒品质的影响
由图1可知，薏米糖化液的添加时间对薏米啤酒乙醇体积分数和总酸含量的影响较小，但对感官评分影响较大。于主发酵4 d添加薏米糖化液时，薏米啤酒感官评分最高（85.0），其乙醇体积分数为4.59%，总酸体积分数为2.50%，此阶段添加能高效利用薏米糖化液中的营养物质、促进薏米特征风味物质的保留与融合。煮沸阶段、后发酵阶段添加薏米糖化液感官评分较低，其原因可能是由于煮沸过程中的高温作用会破坏薏米中的热敏性呈香物质与功能性成分，后发酵阶段酵母代谢已趋于平缓、风味物质难以与酒体充分融合，导致薏米啤酒风味层次不足、整体风味不协调。综上，确定薏米糖化液的最佳添加时间为主发酵4 d。
图1 薏米糖化液添加时间对薏米啤酒品质的影响
Fig. 1 Effect of coix seed saccharified liquid addition time on the quality of coix seed beer
2.1.2 薏米糖化液添加量对薏米啤酒品质的影响
薏米糖化液可为体系提供可发酵性糖、有机酸及矿物质等营养成分，其添加量直接影响啤酒的发酵进程与风味特征。由图2可知，薏米糖化液添加量在20～100 mL范围内增加时，啤酒的乙醇体积分数和感官评分均先增高后降低，总酸含量仅缓慢增加；其中，薏米糖化液添加量为40 mL时，感官评分最高（82.0），其乙醇体积分数为4.33%、总酸体积分数为2.27%。其原因可能是，适量的可发酵性糖为酵母生长代谢提供充足碳源，促进乙醇生成；但过量添加形成的高糖环境会升高发酵体系渗透压、增大黏度，抑制酵母活性，且浓重的乙醇味与薏米甜香掩盖麦芽香、酒花香，导致风味不协调、感官品质降低[26-27]。综上，确定最适薏米糖化液添加量为40 mL。
图2 薏米糖化液添加量对薏米啤酒品质的影响
Fig. 2Effect of coix seed saccharified liquid addition on the quality of coix seed beer
2.1.3 酵母接种量对薏米啤酒品质的影响
酵母是啤酒生产的关键原料，其接种量直接影响发酵的启动速度、周期长短及啤酒的风味与特征[28]。由图3可知，随着接种量在0.4～1.2 g/L范围内的增加，薏米啤酒的乙醇体积分数和感官评分均先升高后降低，总酸含量逐渐增加。当接种量为0.6 g/L时，乙醇体积分数和感官评分均达最高值（分别为4.86%、80.3），此时，总酸体积分数为2.40%。这与高洋[29]的研究结论相似，酵母数量过多导致部分酵母无法与底物接触，会抑制发酵速度。此外，过量酵母易导致酒体浑浊，酵母自溶会产生不良风味，降低啤酒的品质。综上，确定最适酵母添加量为0.6 g/L。
图3 酵母接种量对薏米啤酒品质的影响
Fig. 3Effect of yeast inoculum on the quality of coix seed beer
2.1.4 原麦汁浓度对薏米啤酒品质的影响
原麦汁浓度直接影响酵母代谢强度与絮凝性，进而调控啤酒的乙醇含量及风味物质生成能力[30]。由图4可知，当原麦汁浓度在8～16 °P 范围内增加时，薏米啤酒的感官评分先升高后降低，而乙醇体积分数及总酸含量逐渐增加，当原麦汁浓度为10 °P时，薏米啤酒感官评分最高（84.3），此时，乙醇、总酸体积分数分别为3.46%、2.23%。其原因可能是，低浓度麦汁中可发酵糖和氨基酸等营养物质不足，致使酵母发酵力减弱[31]，发酵风味缺失；酵母在高浓度麦汁中受乙醇毒性与高渗透压双重胁迫，不仅发酵速率减缓、活性下降，未完全代谢的糖分还会抑制酵母絮凝[32]，易引发酒体风味失衡及品质劣变。综上，确定最适原麦汁浓度为10 °P。
图4 原麦汁浓度对薏米啤酒品质的影响
Fig. 4Effect of original wort concentration on the quality of coix seed beer
2.2 发酵条件优化响应面试验结果
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
基于单因素试验结果，选取薏米糖化液添加量（A）、酵母接种量（B）、原麦汁浓度（C）为自变量，感官评分（Y）为响应值，利用Design-Expert 13.0软件进行Box-Behnken响应面试验，响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵条件优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation condition optimization
试验号ABCY感官评分3-11069.7400086.1700082.58-1-1075.91010181.1120-1186.713-10-175.71710-177.51-10180.4211084.8500073.761-1075.6901-181.01100076.51401176.3150-1-184.51600085.4
表4 回归模型方差分析
Table 4Variance analysis of regression model
变异来源平方和自由度均方和F值P值显著性模型388.08943.1258.52＜0.000 1**A27.75127.7537.670.000 5**B8.6118.6111.690.011 2*C31.2131.242.350.000 3**AB11.9111.916.150.005 1**AC6.7616.769.170.019 1*BC4145.430.052 6 A293.51193.51126.91＜0.000 1**B2173.141173.14234.99＜0.0001**C28.1118.11110.012 8*残差5.1670.736 8失拟项1.8630.619 20.750 50.576 4误差项3.340.825总和393.2416
注：*.显著（P＜0.05）；**.极显著（P＜0.01）。
运用Design-Expert 13.0软件对表3的数据进行多元二次回归拟合，得到感官评分（Y）对薏米糖化液添加量（A）、酵母接种量（B）、原麦汁浓度（C）的多元二次回归方程为：Y＝85.5＋1.862 5A＋1.037 5B＋1.975C-1.725AB-1.3AC＋1.0BC-4.712 5A2-6.412 5B2-1.387 5C2。
由表4可知，所构建的回归模型极显著（P＜0.000 1），且失拟项不显著（P＝0.576 4＞0.05）；模型决定系数R2＝0.986 9，校正决定系数
，说明模型可解释97%的结果变异，表明试验模型拟合度良好，误差较小。由P值可知，一次项A、C，交互项AB及二次项A2、B2对感官评分影响均极显著（P＜0.01）；一次项B、交互项AC及二次项C2对感官评分影响均显著（P＜0.05）；交互项BC影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对薏米啤酒感官评分影响程度排序为C＞A＞B。
2.2.2 响应曲面分析
响应曲面图和等高线图可直观反映两因素之间交互作用对响应值的影响程度，曲面坡度越陡峭且等高线呈椭圆形，表明交互作用越显著[33]。由图5可知，薏米糖化液添加量（A）与酵母接种量（B）的响应面曲面最为陡峭，等高线呈明显椭圆形；薏米糖化液添加量（A）与原麦汁浓度（C）的响应面曲面较为陡峭，等高线呈椭圆形；而酵母接种量（B）与原麦汁浓度（C）的响应面曲面较为平缓，等高线呈圆形。这与方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对薏米啤酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig. 5Response surface and contour lines of the effects of interaction among various factors on sensory scores of coix seed beer
2.2.3 验证试验
运用 Design-Expert13.0 软件进行响应面分析，得出薏米啤酒最佳发酵条件为：薏米糖化液添加量58.38 mL、酵母接种量0.595 7 g/L、原麦汁浓度10.544 9 °P。在此优化条件下，薏米啤酒感官评分预测值为83.3。考虑到实际生产应用，将其发酵条件修正为：薏米糖化液添加量58.0 mL、酵母接种量0.6 g/L、原麦汁浓度10.5 °P，在此条件下，薏米啤酒感官评分实际值为86.1，与预测值相差不大，表明模型可靠，具有一定可行性。
2.3 薏米啤酒品质分析
由表5可知，薏米啤酒的理化指标均符合GB/T 4927—2008要求，薏米啤酒与全麦啤酒的理化指标差异明显。其中，薏米啤酒的乙醇体积分数（4.39%）、真正发酵度（79.66%）显著高于全麦啤酒（P＜0.05），总酸体积分数（2.33%）与残糖质量浓度（3.83 g/L）、色度（8.34 EBC）及pH值（4.15）均显著（P＜0.05）、极显著（P＜0.01）低于全麦啤酒。薏米糖化液的添加可以有效提升啤酒的抗氧化性能，相较于全麦啤酒，薏米啤酒的总多酚含量、总黄酮含量均极显著提高（P＜0.01），其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除率分别达83.36%、74.67%，抗氧化活性得到明显增强。
表5 薏米啤酒理化指标及抗氧化活性测定结果
Table 5Determination results of physicochemical indicators and antioxidant activity of coix seed beer
项目全麦啤酒薏米啤酒GB（/淡T 4色92啤7—酒20）08乙醇体积分数/%4.14±0.104.39±0.12*≥3.7真正发酵度/%77.31±0.7579.66±1.12*总酸体积分数/%2.57±0.122.33±0.06*≤2.60残糖质量浓度/（g/L）5.15±0.123.83±0.02**色度/EBC13.57±0.068.34±0.22**2.0～14.0泡持性/s131±3149±3**≥130（瓶装）pH4.38±0.134.15±0.01*总多酚（m质g/量L）浓度/234.51±3.50314.81±4.04**总黄酮（m质g/量L）浓度/67.54±1.5180.19±1.67**DPPH自由基清除率/%66.94±1.3983.36±1.03**ABTS清阳除离率子/%自由基68.08±0.2874.67±0.86**
注：与全麦啤酒相比，*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。
3 结 论
本研究采用单因素试验和响应面试验优化薏米啤酒发酵工艺条件，得到最优工艺条件为：薏米糖化液添加量58.0 mL（主发酵4 d添加）、酵母接种量为0.6 g/L、原麦汁浓度为10.5 °P。在此工艺条件下酿造的薏米啤酒感官评分为86.1，酒体色泽金黄澄澈，泡沫细腻，口感醇正，兼具麦芽、酒花与薏米的浓郁香气；各项理化指标均符合GB/T 4927—2008《啤酒》标准要求，乙醇体积分数4.39%，真正发酵度79.66%，总酸体积分数2.33%，残糖质量浓度3.83 g/L，色度8.34 EBC，泡持性149 s，pH 4.15；其总多酚质量浓度为314.81 mg/L， 总黄酮质量浓度为80.19 mg/L，对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除率分别为83.36%、74.67%，具有良好的抗氧化性能。本研究为薏米啤酒的生产可行性提供了理论和实践参考，可为相关产品的研究提供借鉴。
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