益生菌作为一类对宿主健康具有积极影响的活性微生物，其应用已广泛渗透于食品、饲料、医药及保健品等多个领域，但绝大多数益生菌产品以细菌为主，仅有布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii）作为真菌类益生菌被广泛应用[1]。如今益生性酵母菌也受到广泛研究，已证实具有益生活性的酵母菌主要有酿酒酵母属（Saccharomyces）[2]、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）[3]、毕赤酵母属（Pichia）[4]、伊萨酵母属（Issatchenkia）[5]、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）[6]等。
捷克斯洛伐克化学研究所在1980年于工业饲料酵母中分离出一株新的酵母菌，因其能够以乙醇为唯一碳源并且大量生长，该酵母菌被命名为乙醇假丝酵母（Candida ethanolica）[7]。后依据系统发育关系及相关命名法规，将其转移至毕赤酵母属，更名为乙醇毕赤酵母（Pichia ethanolica）[8]。近年来，乙醇毕赤酵母的益生特性开始受到关注。一株分离自新疆传统发酵乳品中的乙醇毕赤酵母具有较强的耐人工肠胃液能力以及良好的自聚集性和疏水性[9-10]。饲喂乙醇毕赤酵母能够增强罗非鱼的消化功能与免疫抗病能力[11]。饲喂奶牛经含有乙醇毕赤酵母的复合益生菌产品喷洒的牧草，其产奶量、乳蛋白和乳脂产量显著提高[12]。
课题组前期从鸡肠道中筛选并分离鉴定出一株乙醇毕赤酵母（Pichia ethanolica）Jm85，本研究采用平板计数法检测菌株Jm85无细胞上清液（cell-free supernatant，CFS）及菌悬液对人工模拟胃肠液的耐受性，采用微生物黏着碳氢化合物法评估其表面疏水性，使用分光光度法评价其自聚集性、与大肠杆菌共聚集性，通过比色法考察该菌株的抗氧化活性、胆固醇同化能力，通过鉴定平板考察其产胞外酶情况，通过溶血试验、凝固酶和明胶酶活性试验及抗生素敏感性试验评估其体外安全性。旨在全面了解其益生特性及安全性，为其进一步开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
乙醇毕赤酵母（P. ethanolica）Jm85 本实验室保藏；大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538 中国工业微生物菌种保藏管理中心。
胃蛋白酶（30 000 U/g）、胰酶（4 000 U/g）、牛胆盐（胆酸质量分数≥60%） 上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、邻苯三酚、邻苯二甲醛（均为分析纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆固醇、明胶（均为生化试剂） 上海麦克林生化科技股份有限公司；无菌脱纤维绵羊血 上海羽哚生物科技有限公司；冻干兔血浆青岛海博生物技术有限公司；抗生素药敏纸片 意大利Liofilchem公司；其余试剂均为国产分析纯。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose,YEPD）培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸馏水1 L，pH 5.0。
YEPD固体培养基：在YEPD液体培养基中添加琼脂20 g/L。
LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化钠10 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0。
胆固醇培养基：在YEPD液体培养基中添加过滤灭菌的胆固醇0.1 g/L，牛胆盐2 g/L。
β-葡萄糖苷酶鉴定平板：蛋白胨2.5 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，纤维二糖2.5 g/L，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，七叶苷1 g/L，琼脂15 g/L，过滤灭菌的柠檬酸铁铵3 g/L，蒸馏水1 L。
菊粉酶鉴定平板：菊粉3 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水1 L。
木聚糖酶鉴定平板：木聚糖15 g/L，硝酸铵5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水1 L。
α-淀粉酶鉴定平板：可溶性淀粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水1 L。
β-半乳糖苷酶鉴定平板：乳糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，琼脂15 g/L，过滤灭菌的β-半乳糖苷酶显色底物0.04 g/L，蒸馏水1 L。
植酸酶鉴定平板：植酸钙10 g/L，葡萄糖30 g/L，硝酸铵5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，七水合硫酸锰0.03 g/L，七水合硫酸亚铁0.03 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水1 L，pH 5.5。
血琼脂培养基：在YEPD固体培养基中添加5%（V/V）无菌脱纤维绵羊血。
明胶培养基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，明胶120 g/L，蒸馏水1 L，pH 6.0。
以上培养基均于121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SQ510C立式压力蒸汽灭菌锅 重庆雅马拓科技有限公司；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-5500可见分光光度计 海元析仪器有限公司；ZQPL-200立式振荡培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；OptiMair超净工作台 新加坡艺思高科技有限公司；ME204T/02电子天平、FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株Jm85种子液、菌悬液、CFS制备
种子液制备：无菌环境下挑取一环乙醇毕赤酵母Jm85，接种于YEPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下振荡培养24 h，即得种子液。
菌悬液制备：将Jm85种子液按2%（V/V）接入YEPD液体培养基中，在30 ℃、200 r/min条件下振荡培养至对数生长期，用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）（pH 7.2）洗涤菌体2次后重悬，即得菌悬液。
CFS制备：取2%（V/V）菌株Jm85种子液接种于YEPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min条件下振荡培养24 h，发酵液于5 000 r/min条件下离心10 min，去除菌体，上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤，即得CFS。
1.3.2 人工模拟胃肠液的耐受性实验
菌株Jm85存活率越高，表明其对人工模拟胃肠液的耐受性越强。参照INFOGEST静态体外消化模型[13]要求制备人工模拟胃液和人工模拟肠液，经0.22 μm无菌滤膜过滤除菌。参照Shen Yong等[14]的方法，取1 mL对数生长期的菌悬液加入9 mL人工模拟胃液中，37 ℃水浴振荡孵育2 h，胃液孵育后另取10 mL人工模拟肠液加入其中，继续37 ℃水浴振荡孵育，在加入菌悬液后的0、2、4 、8、12、24 h进行菌落计数，其存活率计算公式如下：
式中：N0表示0 h的活菌数/（CFU/mL）；Nt表示不同时间段的活菌数/（CFU/mL）；V0表示0 h的溶液总体积/mL；Vt表示不同时间段的溶液总体积/mL。
1.3.3 体外黏附性测定
菌株Jm85疏水率越高，表明其表面疏水性越强，与肠道上皮细胞的非特异性黏附潜力越大。疏水性测定参照Kim等[15]的方法，在600 nm波长处测定菌株在石油醚、正己烷、乙酸乙酯、正十六烷中的吸光度，其疏水率计算公式如下：
式中：Ai表示酵母菌悬液的吸光度；Af表示水相吸光度。
菌株Jm85自聚集率越高，说明其自身聚集能力越强，有利于肠道定植。菌株自聚集性测定参照Mo Xueyan等[16]的方法，在600 nm波长处测定菌株Jm85菌悬液静置不同时间后的吸光度，其自聚集率计算公式如下：
式中：At表示静置不同时间的吸光度；A0表示0 h时的吸光度。
菌株Jm85共聚集率越高，表明菌株粘附致病菌的能力越强，有助于维护肠道微生态平衡。菌株共聚集性测定参照Menezes等[17]的方法，于600 nm波长处分别测定菌株Jm85菌悬液、大肠杆菌菌悬液、菌株Jm85与大肠杆菌等体积混合菌悬液的吸光度，其共聚集率计算公式如下：
式中：Ax表示菌株Jm85菌悬液的吸光度；Ay表示大肠杆菌菌悬液的吸光度；Ax＋y表示菌株Jm85与大肠杆菌等体积混合菌悬液的吸光度。
1.3.4 抗氧化能力测定
DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除率越高，表明抗氧化能力越强。参照林瑛兰等[18]的方法，分别考察菌株Jm85培养24 h的菌悬液和CFS对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除率，其计算公式如下：
式中：A1表示样品＋DPPH-无水乙醇溶液的吸光度；A2表示样品＋无水乙醇的吸光度；A0表示蒸馏水＋DPPH-无水乙醇的吸光度。
式中：A1表示样品的吸光度；A2表示蒸馏水代替过氧化氢的吸光度；A0表示蒸馏水代替样品的吸光度。
式中：A1表示样品的吸光度；A2表示蒸馏水代替邻苯三酚的吸光度；A0表示蒸馏水代替样品的吸光度。
1.3.5 同化胆固醇能力测定
胆固醇同化率越高，表明体外降解胆固醇的潜力越大。参照Mo Xueyan等[16]的方法对菌株Jm85同化胆固醇能力进行测定，其计算公式如下：
式中：A0为空白对照的初始吸光度；A1为实验组培养后的吸光度。
1.3.6 产胞外酶活性试验
取5 μL对数生长期的菌株 Jm85菌悬液，点接于β-葡萄糖苷酶、菊粉酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶、植酸酶等胞外酶鉴定琼脂平板的表面，将平板置于37 ℃条件下恒温培养24～72 h。通过观察菌落周围是否出现透明圈（如植酸酶、淀粉酶）或颜色变化（如β-葡萄糖苷酶黑色沉淀），判定是否产胞外酶，从而反映菌株的潜在功能，如促进营养物质释放、改善消化吸收等。
1.3.7 安全性评价
参照Li Yanmei等[4]的方法检测菌株Jm85的溶血活性、血浆凝固酶活性和明胶酶活性，实验结果呈阴性，表明其安全性较好。参照刘洋[19]的方法检测菌株Jm85对4种抗真菌药物氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和两性霉素B的敏感性，菌株对抗生素越敏感，说明其潜在安全性较好。
1.4 数据处理
每份样品设置3次平行，数据均以
表示，使用Excel 2021和SPSS 26.0整理并分析数据，使用Origin 2021软件绘图。
2 结果与分析
2.1 菌株Jm85人工模拟胃肠液耐受性
酵母菌在人工模拟胃肠液连续处理下的耐受能力是决定其作为潜在益生菌的关键指标，直接关乎菌株能否以足够的活菌数进入肠道定植并发挥益生作用。由图1可知，菌株Jm85经人工胃液处理2 h后，存活率为89.47%；菌株Jm85继续经人工模拟肠液处理2 h后，存活率为80.55%。菌株Jm85经人工模拟胃肠液连续处理8、12、24 h后，存活率分别为70.16%、63.83%、47.91%。菌株Jm85存活率随处理时间呈缓慢下降趋势，但始终保持在较高水平，24 h后仍有近半数菌株存活。郑辰等[20]从水果中分离出一株具有益生潜力的仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora sp.） BL，该菌株在人工模拟胃液和肠液中处理3 h后的存活率分别为88.66%和45.19%。有研究[21]表明，布拉氏酵母菌CNCM I-745经人工模拟胃肠液连续处理24 h后，存活率不足10%。结果表明，菌株Jm85具有较强的人工模拟胃肠液耐受能力。
图1 菌株Jm85在人工模拟胃肠液体外消化过程中的存活率
Fig. 1 Survival rates of strain Jm85 in artificial simulated gastrointestinal fluid in vitro digestion
2.2 菌株Jm85黏附性
2.2.1 菌株疏水性
哺乳动物的肠道上皮细胞因覆盖一层具有强疏水性的活性磷脂层，所以疏水性强的菌株更易与宿主肠道上皮细胞发生非特异性黏附[22]。菌株的疏水性越强，越易悬浮于非极性溶剂中。疏水率≥70%被认为具有高疏水性，40%～70%为较高疏水性，而＜40%则被认为疏水性低[23]。测定菌株Jm85在非极性溶剂石油醚、正己烷、乙酸乙酯、正十六烷中的疏水性，结果见图2。
图2 菌株Jm85在不同非极性有机溶剂中的疏水率
Fig. 2 Hydrophobicity rates of strain Jm85 in different nonpolar organic solvent
由图2可知，菌株Jm85在石油醚和正己烷中的疏水率相似，没有显著性差异（P＞0.05），分别为51.32%、53.75%。菌株Jm85对乙酸乙酯的疏水性显著最低（P＜0.05），为38.64%，对正十六烷的疏水性显著最高（P＜0.05），为61.19%。附俊杰[24]研究发现，一株具有益生潜力的布拉氏酵母菌在正十六烷中的疏水性为34.62%。Li Yanmei等[4]研究发现，一株分离自海洋红树林的益生性库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）在乙酸乙酯中的疏水性为19.83%，在正己烷中的疏水性为4.78%。结果表明，乙醇毕赤酵母Jm85疏水性能优良。
2.2.2 菌株Jm85自聚集性
良好的自聚集能力有助于菌株在肠道内自聚集成簇并产生聚集体，不仅有利于黏附，还能增加其对肠道复杂环境的耐受性，提高其竞争优势和生存能力[25]。自聚集率≥60%可以认为具有强自聚能力，自聚集率在30%～60%被认为自聚集能力一般，低于30%则自聚集能力较弱[26]。菌株Jm85自聚集率测定结果见图3。
图3 菌株Jm85的自聚集率测定结果
Fig. 3 Determination results of auto-aggregation rates of strain Jm85
由图3可知，菌株Jm85的自聚集率随时间增加而增加，在静置时间1.0 h时，菌株Jm85的自聚集率为36.18%；在静置时间2.5 h时，菌株Jm85自聚集率为81.18%；在静置时间超过2.5 h之后，菌株Jm85自聚集率趋于平稳。Mo Xueyan等[16]研究表明，季也蒙迈耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）静置150 min的自聚集率达到71%，这与本研究的结果类似。结果表明，菌株Jm85具有强自聚集能力。
2.2.3 菌株Jm85与大肠杆菌的共聚集能力
共聚集能力也是评价益生菌株粘附特性的一项重要指标，是益生菌株黏附致病菌、维护肠道微生态平衡的关键作用机制之一。菌株Jm85与大肠杆菌的共聚集率测定结果见图4。
图4 菌株Jm85与大肠杆菌的共聚集率
Fig. 4 Co-aggregation rates of strain Jm85 with E. coli
由图4可知，在共孵育1～3 h时，菌株Jm85与大肠杆菌的共聚集率随着时间增加而迅速增加；在共孵育3 h时，菌株Jm85与大肠杆菌的共聚集率达到最高，为48.75%；在共孵育时间为3～6 h时，菌株Jm85与大肠杆菌的共聚集率稳定在45%～48%。Menezes等[17]从发酵食品中分离出15株具有益生潜力的酵母菌株，这些酵母菌与大肠杆菌CDC 055的共聚集率范围为0.9%～76.2%。结果表明，菌株Jm85具有较好的共聚集能力。
2.3 菌株Jm85抗氧化活性
人体新陈代谢产生的过多的自由基会造成人体衰老和引发关节炎、心血管疾病等疾病[27]。乙醇毕赤酵母Jm85 CFS以及菌悬液抗氧化能力测定结果见图5。
图5 菌株Jm85 CFS及菌悬液对DPPH自由基、羟自由基及 超氧阴离子自由基清除率
Fig. 5 Scavenging rates of DPPH radicals, hydroxyl radicals and superoxide anion radicals by the CFS and bacterial suspension of strain Jm85
由图5可知，菌株Jm85的CFS和菌悬液均有一定抗氧化活性，且CFS的抗氧化活性显著高于菌悬液（P＜0.05）。其中CFS对DPPH自由基清除率最高，为62.10%，其次是超氧阴离子自由基清除率，为50.21%，对羟自由基清除率最低，为35.31%，而菌悬液的抗氧化能力也呈现相同趋势，对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除率分别为24.07%、12.07%、14.72%。菌悬液的抗氧化活性可能来自酵母细胞壁中含有的β-葡聚糖和甘露聚糖，而CFS的抗氧化活性可能源于菌株Jm85的胞外代谢产物中具有抗氧化活性的物质。结果表明，菌株Jm85 CFS具有一定的抗氧化活性。
2.4 菌株Jm85同化胆固醇能力
胆固醇同化能力是评估益生菌辅助调节血脂潜力的关键指标，体外实验显示能高效同化胆固醇的菌株，更有可能在复杂的肠道环境中发挥相似的作用[28]。菌株Jm85胆固醇同化能力测定结果见图6。
图6 菌株Jm85的胆固醇同化率测定结果
Fig. 6 Determination results of cholesterol assimilation rates of strain Jm85
由图6可知，在培养时间为0～12 h时，菌株Jm85胆固醇的同化率极低，只有2.65%；在培养时间为12～60 h时，菌株Jm85胆固醇同化率随之显著提升；在培养时间为60 h时，菌株Jm85胆固醇同化率达到峰值，为58.79%；在培养时间超过60 h之后，菌株Jm85胆固醇同化率小幅下降至54.51%，这可能是部分酵母细胞发生裂解，导致少量已同化的胆固醇重新释放到培养基中。Erdem等[29]研究表明，分离自土耳其塔哈纳发酵剂中的酿酒酵母 PCF122菌株在体外实验中展现出卓越的胆固醇清除能力，培养时间为48 h的胆固醇同化率最高可达91%。结果表明，菌株Jm85胆固醇同化能力良好。
2.5 菌株Jm85产胞外酶活性
胞外酶是益生菌发挥生理功能的重要代谢产物。乙醇毕赤酵母Jm85产β-葡萄糖苷酶、菊粉酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶、植酸酶等胞外酶测定结果见表1。
表1 菌株Jm85产胞外酶测定结果
Table 1 Determination results of extracellular enzyme production of strain Jm85
胞外酶类型阳性结果特征结果β-葡萄糖苷酶菌落周围出现黑色沉淀＋菊粉酶菌落周围出现明显透明圈-木聚糖酶菌落周围出现明显透明圈-α-淀粉酶鲁周哥围氏碘出液现无染色色透后，明菌圈落-β-半乳糖苷酶菌落中出现蓝色-植酸酶菌落周围出现明显透明圈＋
注：＋.阳性；-.阴性。
由表1可知，菌株Jm85不能产菊粉酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、β-半乳糖苷酶，菌株Jm85能够产β-葡萄糖苷酶和植酸酶。β-葡萄糖苷酶可以水解食物中的糖苷类物质（如黄酮苷、萜类苷），释放具有抗氧化、抗炎活性的苷元，增强食品的功能价值[30]。植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶，具有特殊的空间结构。植酸（肌醇六磷酸）是植物性饲料中磷的主要存在形式，且植酸能够与钙、铁、锌等元素结合，形成不溶性植酸盐，降低动物对矿物质的吸收。由于单胃动物缺乏分泌植酸酶的能力，因此只能在饲料中添加外源性植酸酶，菌株Jm85能够分泌植酸酶，表明其具有生物降解植酸盐的能力，能够提升磷和微量元素的生物利用率[31]。
2.6 菌株Jm85安全性
2.6.1 菌株Jm85溶血活性
溶血是指红细胞溶解破裂的现象，若菌株出现溶血现象，则表明可能含有溶血素或溶血基因，动物摄入含有溶血性的菌株会破坏红细胞，可能损伤机体组织[32]。菌株的溶血现象分2种：1）α-溶血，即不完全溶血，由高铁血红蛋白被氧化所致，在血琼脂平板上菌落周围有半透明溶血环；2）β-溶血，即完全性溶血，在血平板上菌落周围有2～4 mm宽、界限分明、无色透明的溶血环。以金黄色葡萄球菌ATCC 6538为阳性对照，菌株Jm85溶血实验结果见图7。
图7 菌株Jm85溶血实验结果
Fig. 7 Hemolysis test results of strain Jm85
由图7可知，金黄色葡萄球菌ATCC 6538产生β-溶血，而菌株Jm85菌落周围无透明圈出现，为α-溶血。研究发现，临床使用的益生酵母布拉氏酵母CNCM I-745以及许多人体正常菌群（如口腔链球菌等）均属α-溶血菌株，通常无害[14,33]。结果表明，菌株Jm85为安全菌株。
2.6.2 菌株Jm85血浆凝固酶和明胶酶活性
血浆凝固酶是某些致病菌的关键毒力因子，该酶能被血浆中的协同因子激活，转化为凝血酶样物质，催化可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，导致血浆凝固，可能引发局部感染和血栓[34]。明胶酶的主要危害在于对细胞外基质中IV型胶原、V型胶原和明胶等基底膜关键成分的特异性降解能力，从而破坏组织的物理屏障和结构完整性[35]。结果表明，菌株Jm85血浆凝固酶和明胶试验均为阴性，表明菌株Jm85不产生这两种毒力因子，降低了其潜在致病风险。
2.6.3 菌株Jm85抗真菌药物敏感性实验结果
唑类药物（氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑）和多烯类药物（两性霉素B）是目前临床上使用较为广泛的抗真菌药物。由表2可知，根据药敏试验结果，菌株Jm85对伏立康唑和伊曲康唑敏感，对氟康唑表现为中介敏感，对两性霉素B表现为耐药。初步认为菌株Jm85在抗真菌药物敏感性方面具有较好的安全性。
表2 菌株Jm85药敏实验结果
Table 2 Results of drug susceptibility tests of strain Jm85
氟康唑2516.62±0.57I伏立康唑130.20±1.51S抗生素类别抗生素含量/（μg/片）抑菌圈直径/mm敏感程度伊曲康唑819.88±0.86S两性霉素B308.18±0.21R
注：R.耐药；S.为敏感；I.中介敏感。
3 结 论
本研究对乙醇毕赤酵母Jm85进行益生特性及安全性评价，结果表明，Jm85对人工模拟胃肠道环境具有一定的耐受性，经人工胃肠液连续处理2 h后存活率为80.55%。菌株Jm85具有较强的胃肠道定植能力，疏水率最高可达61.19%；自聚集率达到81.18%；与大肠杆菌之间共聚集率达到48.75%；菌株Jm85的CFS有一定的抗氧化活性；具有良好的胆固醇同化能力；能够分泌胞外 β-葡萄糖苷酶和胞外植酸酶。体外安全性评估表明，该菌株无β-溶血活性、血浆凝固酶和明胶酶试验均为阴性，且对伏立康唑和伊曲康唑具有敏感性，具备一定安全性。综上，乙醇毕赤酵母Jm85具有良好的益生特性及安全性，具有开发益生菌剂的应用潜力。
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