黄水是固态发酵白酒的主要副产物，在白酒酿造过程中，微生物分解入窖的糟醅（含水量52%～55%）并产生大量的游离水，与窖池中的糟醅淋浆水逐渐沉降混合，同时酒醅中残留的淀粉、单糖、蛋白质、酵母自溶物及经微生物代谢产生的有机酸、芳香物质等溶于其中，逐渐沉积到窖池底部，形成棕黄色或褐色的黏稠液体[1-2]。黄水具有低pH值、高生化需氧量和化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）的特点[3]。由于受到原料性质、白酒产区、生产工艺以及生产周期等因素的影响，白酒黄水理化性质波动较大，但其主体成分的种类较为稳定，一般以糖类、醇类、酸类、酯类等物质组成为主[4]。其中，糖类物质含量占总有机质含量的1/3（以COD计），包括淀粉和还原性糖[5]。黄水中含有大量的有机酸，其中乳酸占比80%以上，导致黄水中酸度较高，pH值一般在2.5～4.2范围内波动[6-7]。黄水中醇类物质以乙醇为主，乙醇具有良好的水溶性，会在黄水中不断积累，体积分数可达3.2%～5.3%[8]。
黄水与窖池底部的窖泥和发酵的谷物长期接触，富集了微生物生长必需的营养物质，构成了一个极其复杂的微生态系统[9]。刘凯等[10]使用高通量测序对黄水中的真菌群落进行解析，检测出8个真菌门和77个真菌属，子囊菌门是优势菌门，哈萨克斯坦酵母属、曲霉属和嗜热子囊菌属是优势真菌属。赵培演等[11]对酿酒废水中的细菌进行高通量测序分析发现，与锅底水和综合废水相比，黄水中细菌丰度及多样性最高，厚壁菌门和变形菌门是黄水中的优势菌门，醋酸杆菌属和乳杆菌属是黄水中的优势菌属。
黄水中微生物资源丰富，富含大量经长期驯化，适应于高酸、高乙醇浓度等极端环境的微生物菌群，有利于新功能的挖掘[3,12]。潘宇等[13]从黄水中共筛选出9株产酯化酶菌株，这9株菌均具有良好的耐盐碱性能，能在pH 2.0～11.0的条件下生长。此外，黄水梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属具有纤维素酶产生能力，能够降解混合原料中纤维素，破坏细胞壁的骨架结构，释放其中的淀粉，进一步提高原料利用率，提高发酵速率，缩短发酵时间[14-16]。
对黄水中微生物的研究主要集中在群落结构以及酶活特性上，对功能菌株研究较少。为进一步探究黄水中微生物的功能及其生物学特性，本研究以酱香型白酒黄水为实验材料，对黄水中细菌进行分离纯化，并测定菌株的环境耐受性、酶活特性及挥发性代谢产物，为黄水中微生物资源综合利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄水 贵州省仁怀市茅台镇某酒厂。
乳酸、NaCl、KH2PO4、FeSO4·7H2O、KCl、K2HPO4、Na2HPO4（均为分析纯）、羧甲基纤维素钠（化学纯） 上海沪试实验室器材股份有限公司；MgSO4·7H2O（分析纯）、酸水解酪蛋白（生化试剂）、糊精（分析纯） 天津市众联化学试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 美国Thermo Fisher Scientific公司；果胶（来源橘皮） 合肥博美生物科技有限责任公司。
LB固体培养基：琼脂20 g，酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
LB液体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠10 g，琼脂粉20 g，蛋白胨1 g，KH2PO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
糊精培养基：糊精20 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO4 1 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
果胶酶产生培养基：果胶1 g，KH2PO4 1 g，蔗糖2 g，NaNO3 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 1 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
α-淀粉酶培养基：可溶性淀粉20 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
酪蛋白培养基：酪蛋白15 g，Na2HPO4 2 g，NaCl 5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
三丁酸甘油酯培养基：三丁酸甘油酯4 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
改良马丁氏培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，琼脂粉5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台 上海乔跃电子科技有限公司；DSX-18L-1手提式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；GelDoc-XR+凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；DH124D恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；7890B-5977A气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 黄水中细菌的分离纯化
从黄水中吸取10 mL加入到90 mL浓度为1 mol/L的无菌生理盐水中，制成10倍稀释液；采用同样的方法制备100、1 000倍稀释液。分别从10、100、1 000倍稀释液中吸取100 μL涂布到LB固体培养基上，倒置于30 ℃培养箱中培养2～3 d。挑取单菌落接种到新的孟加拉红平板上进行纯化。
1.3.2 菌株分子生物学鉴定
使用改良月桂酸钠法[17]提取菌株基因组DNA，使用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增菌株的16S rDNA片段。PCR扩增体系：2×Taq MasterMix 12.5 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 11 μL。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环数35；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保温。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序得到的序列提交到美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank数据库进行BLAST比对，下载与菌株同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列，使用MEGA7对同源序列进行对比，通过邻近法构建系统发育树，确定菌株种属[18-19]。
1.3.3 环境因素对菌株生长的影响
1.3.3.1 温度对菌株生长的影响
将菌株接种于LB液体培养基中，设置摇床的温度分别为30、40、50、60 ℃，转速为150 r/min，培养48 h。以空白培养基为对照，在波长600 nm条件下测定菌悬液的吸光度。
1.3.3.2 乙醇对菌株生长的影响
将乙醇加入LB液体培养基中，调整乙醇体积分数为2%、4%、6%、8%，将菌株接种到含不同乙醇体积分数的培养基中，置于摇床中，30 ℃、150 r/min培养48 h。以空白培养基为对照，在600 nm波长处测定菌悬液吸光度。
1.3.3.3 pH值对菌株生长的影响
向LB液体培养基中加入1 mol/L盐酸，调整培养基的pH值分别为2、3、4、5、6、7。将菌株接种到pH值梯度培养基中，置于摇床中，30 ℃、150 r/min培养48 h。以空白培养基为对照，在600 nm波长处测定菌悬液吸光度。
1.3.3.4 乳酸对菌株生长的影响
将乳酸灭菌（115 ℃、15 min）后加入到LB液体培养基中，调整乳酸的终质量浓度分别为5、10、15、20、25 g/L。将菌株接种到乳酸梯度培养基中，置于摇床中，30 ℃、150 r/min培养48 h。以空白培养基为对照，在600 nm波长处测定菌悬液吸光度。
1.3.4 酶活性检测
将菌株点接到纤维素酶、糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、蛋白酶、酯化酶和单宁酶活性检测培养基上，根据菌落周围能否形成透明圈判定菌株是否具有产酶活性，并计算透明圈直径（D）和菌落直径（d）的比值（D/d）。
1.3.4.1 纤维素酶活性检测
参照吴静[20]的方法，将菌株接种到羧甲基纤维素钠培养基上，置于30 ℃培养箱中培养3～5 d，在菌落周围加入1 mg/mL刚果红，染色30 min后，用1 mol/L NaCl溶液冲洗，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有纤维素酶活性。
1.3.4.2 糖化酶活性检测
参照王新叶等[21]的方法，将菌株接种到糊精培养基，置于30 ℃培养箱中培养3～5 d，在培养基上加入0.02 mol/L碘液染色30 min，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有糖化酶活性。
1.3.4.3 果胶酶活性检测
参照全桂静等[22]的方法，将菌株接种到果胶酶产生培养基上，30 ℃培养3～5 d，滴加质量分数为1％的十六烷基三甲基溴化铵，静置30 min，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有果胶酶活性。
1.3.4.4 α-淀粉酶活性检测
根据王鹏昊等[23]的方法，将菌株接到淀粉培养基上，30 ℃培养3～5 d，滴加碘液染色30 min，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有淀粉酶活性。
1.3.4.5 蛋白酶活性检测
根据王鹏昊等[23]的方法，将菌株接到酪蛋白培养基上，30 ℃培养3～5 d，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有蛋白酶活性。
1.3.4.6 酯化酶活性检测
参照刘小改等[24]的方法，将菌株接种到三丁酸甘油酯培养基上，30 ℃培养箱3～4 d，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有酯化酶活性。
1.3.4.7 单宁酶活性检测
参照李啸飞[25]的方法，将1 mL 0.1 g/mL单宁酸溶液加到改良马丁氏培养基中，涂布均匀，放置过夜，待其表面形成一层薄膜后，接种菌株，30 ℃培养箱3～4 d，若菌落周围能形成透明圈，则表明菌株具有单宁酶活性。
1.3.5 挥发性风味物质测定
将菌株接种到LB液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养48 h后，8 000 r/min离心10 min去除菌体。在上清液中加入等量的二氯甲烷进行萃取，混合均匀后，静置分层，获得有机相，使用旋转蒸发仪对有机相进行浓缩，使用GC-MS对有机相中的挥发性风味物质进行检测。
GC条件：VF-WAX色谱柱（60 m×250 μm，0.5 μm），进样口温度为240 ℃，不分流进样，He为载气，流速1 mL/min，程序升温程序：烘箱初始温度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min速率升温到100 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持 3 min。
MS条件：电子离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电离能量70 eV，扫描范围m/z 40～400，溶剂延迟时间5 min。
定性定量：根据保留时间对物质进行定性，以各物质峰面积与所有物质峰面积总和的比值表征其相对含量。
1.4 数据分析
实验数据的整理与预处理通过Microsoft Excel 2019完成，利用Origin 8.0进行统计图形绘制及方差分析建模。为探究不同菌株生长（以吸光度表征）与不同环境因子（温度、pH值、乳酸、乙醇）处理水平之间的关联关系，本研究采用对应分析（correspondence analysis，CA）进行建模与可视化。分析基于由菌株（行）与各环境因子的特定处理水平（列）构成的交叉数据矩阵，矩阵中的每个单元格值为对应条件下的平均吸光度值。随后，使用R（4.3.1）软件的FactoMineR包对数据矩阵执行CA。最终，以前2个主维度（通常解释数据变异的最大比例）为横、纵坐标轴，将代表菌株和处理水平的坐标点绘制于同一散点图中，即得到CA双标图。在此图中，点与点之间的相对距离近似代表其关联性强弱，距离越近表明正关联越强，使用ggplot2包进行可视化呈现。代谢产物相对含量气泡图使用R软件pheatmap包进行绘制。
2 结果与分析
2.1 黄水中细菌的形态学观察
从黄水中分离得到8株细菌，对菌株进行编号：HS-1、HS-4、HS-5、HS-10、HS-12、HS-14、HS-16和HS-18，其菌落及细胞形态见图1。这8株菌在LB培养基上形成的菌落呈圆形，表面湿润，易挑起。这8株菌的细胞形态均呈现杆状，革兰氏染色结果表明，只有菌株HS-5被染成红色，为革兰氏阴性菌，其余7株菌均被染成紫色，为革兰氏阳性菌。
图1 菌株的菌落形态（A）及细胞形态（B）
Fig. 1 Colony (A) and cell (B) morphology of strains
2.2 黄水中细菌的分子生物学鉴定
将测序得到的这8株菌的16S rDNA序列与NCBI的GenBank数据库中的序列进行比对，下载与目标菌株的16S rDNA序列同源性较高的序列，构建系统发育树。由图2可知，菌株HS-1与贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis） CBMB205聚成一簇，HS-1与B. velezensis CBMB205的序列一致性为0.995。结合菌株HS-1的形态学特征，将菌株HS-1命名为贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis） HS-1；菌株HS-4、HS-10和HS-18与地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）ATCC 14580聚成一簇，菌株HS-4、HS-10、HS-18与B. licheniformis ATCC 14580的序列一致性分别为0.991、0.998、0.992。结合菌株HS-4、HS-10和HS-18的形态学特征，分别将菌株HS-4、HS-10、HS-18命名为地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）HS-4、HS-10、HS-18。菌株HS-14和东京芽孢杆菌（B. toyonensis）BCT-7112聚成一簇，HS-14与B.toyonensis BCT-7112的序列一致性为0.999。结合HS-14菌株的形态学特征，将HS-14命名为东京芽孢杆菌（B. toyonensis）HS-14。HS-5和居幼虫普罗威登斯菌（P. vermicola）OP1聚成一簇，菌株HS-5与P. vermicola OP1的序列一致性为0.994。结合菌株HS-5的形态学特征，将菌株HS-5命名为居幼虫普罗威登斯菌（P. vermicola）HS-5；菌株HS-12和HS-16与深层大洋芽孢杆菌（O. profundus）CL-MP28聚成一簇，菌株HS-12和HS-16与O. profundus CL-MP28的序列一致性分别为1和0.999，结合菌株HS-12和HS-16的形态学特征，分别将菌株HS-12、HS-16命名为深层大洋芽孢杆菌（O. profundus）HS-12、HS-16。
图2 基于菌株16S rDNA序列构建的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of strains
这8株菌属于3个属，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、普罗威登斯菌属（Providencia）和大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）。芽孢杆菌属的5株菌（HS-1、HS-4、HS-10、HS-14和HS-18）和大洋芽孢杆菌属的2株菌（HS-12和HS-16）在门水平上属于厚壁菌门（Firmicutes），普罗威登斯菌属的1株菌（HS-5）在门水平上属于变形菌门（Proteobacteria），这与前期报道的厚壁菌门和变形菌门是黄水中的优势菌门结果一致[11]。
2.3 菌株环境耐受性CA结果
为明确不同环境因素对供试菌株生长的影响，本研究测定了温度、乙醇、pH值及乳酸质量浓度对8株菌生长的影响，以吸光度表征菌株生长量，并采用CA探究菌株与各环境因子水平之间的关联关系，直观揭示了不同菌株的环境适应性差异，结果见图3。CA前2个维度（维度1＋维度2）的累计贡献率在各环境处理下均超过80%，表明该二维排序图能够较全面地反映原始数据的变异信息。
图3 菌株与环境因素间CA双标图
Fig. 3 Correspondence analysis biplot of the associations between strains and environmental factors
由图3A可知，供试菌株对温度的适应性存在明显差异。CA显示，菌株HS-1、HS-14和HS-18在排序图中与30 ℃的距离较近，表明它们更适宜在30 ℃条件下生长；菌株HS-5则与40 ℃及50 ℃均较为接近，且关联权重相近，表明其对中高温环境具有较宽的耐受范围；菌株HS-16靠近50 ℃，偏好该温度条件；而菌株HS-12紧邻60 ℃分布，表现出显著的高温偏好性。综合温度梯度与菌株分布的空间关系可知，在这8株菌中，HS-12的耐高温能力最强。
由图3B可知，在乙醇适应性方面，不同菌株表现出明显的偏好差异。CA排序图中，菌株HS-18、HS-5、HS-4和HS-10分别与2%、4%、6%和8%的乙醇体积分数距离最近，说明它们分别最适应相应体积分数的乙醇环境。其中，菌株HS-10位于最高乙醇体积分数（8%）附近，显示出在高体积分数乙醇胁迫下的生长优势，表明其对乙醇的耐受能力相对较强。
由图3C可知，从乳酸质量浓度适应性的结果来看，不同菌株对乳酸的响应呈现梯度演替趋势。菌株HS-10与低质量浓度乳酸（5 g/L和10 g/L）距离最近，反映其偏好低乳酸环境；随着乳酸质量浓度升高，菌株HS-5和HS-18与15 g/L乳酸关联密切；菌株HS-1主要与质量浓度20 g/L乳酸相关；而菌株HS-4与最高质量浓度（25 g/L）乳酸距离最近。这表明不同菌株的最适乳酸浓度随梯度递增而发生更替，其中菌株HS-4在乳酸质量浓度25 g/L条件下表现出较强的乳酸耐受能力。
由图3D可知，在pH值适应性方面，所有菌株均远离中性pH值（pH 7）区域，进一步证实其嗜酸特性。具体而言，菌株HS-5、HS-14、HS-16和HS-18聚集在pH 6附近，倾向于弱酸性环境；菌株HS-4距离与pH 4最近，适应中度酸性条件；而菌株HS-10紧邻pH 3，显示出对强酸性环境的高度适应性。因此，在这些菌株中，菌株HS-10对酸性环境的耐受能力最强。
上述结果表明，不同菌株对环境条件的响应具有高度特异性。具体而言，菌株HS-12表现出独特的高温（60 ℃）耐受性，HS-10在强酸（pH 3）和高体积分数乙醇（8%）环境下显示出最强耐受性，而HS-4则对高质量浓度乳酸（25 g/L）具有突出适应性。其余菌株亦分别与特定的温和条件紧密关联。这种耐受性差异模式不仅明确了各菌株的最适生态位，也为后续针对特定胁迫环境的菌种选育与应用提供了明确的表型依据和理论支撑。
2.4 菌株产酶能力
由表1可知，菌株HS-4和HS-10具有纤维素酶产生能力，其中菌株HS-10的D/d最大；菌株HS-4、HS-5、HS-10和HS-14具有糖化酶产生能力，其中菌株HS-5的D/d最大；菌株HS-1、HS-4和HS-16具有α-淀粉酶产生能力，其中菌株HS-4的D/d最大；菌株HS-5和HS-12具有蛋白酶产生能力，其中菌株HS-12的D/d最大；具有果胶酶产生能力的只有1株菌，为HS-16，其D/d为1.34；具有单宁酶产生能力的只有1株菌，为HS-5，其D/d为1.56。
表1 菌株产酶能力测定结果
Table 1 Determination results of enzyme-producing capacity of strains
编号纤维素酶糖化酶果胶酶α-淀D粉/d酶蛋白酶酯化酶单宁酶HS-1---＋（1.06）---HS-4＋（1.28）＋（1.34）-＋（1.28）---HS-5-＋（1.47）--＋（3.13）-＋（1.56）HS-10＋（1.75）＋（1.31）-----HS-12----＋（8.25）--HS-14-＋（1.37）-----HS-16--＋（1.34）＋（1.19）---HS-18-------
注：＋.菌株具有该酶产生能力；-.菌株不具有该酶产生能力。
在测试的7种酶中，分离出的8株菌能够产生6种酶，分别为纤维素酶、糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、蛋白酶和单宁酶，均不能产生酯化酶。果胶质存在于水果、蔬菜和谷类的细胞壁中，我国每年用于白酒生产的玉米、高粱、大麦、小麦、豆类等谷物中都含有果胶物质，果胶酶能够分解果胶质，破坏细胞壁[26]。在白酒酿造过程中，纤维素酶能够将酿酒原料中的纤维素和半纤维素等物质降解为可发酵性糖，为微生物生长繁殖提供必需的营养物质[27]。淀粉酶主要将酿酒原料中的淀粉分解为糊精和一系列的低聚糖，从而促进原料转化、乙醇及风味物质的生成[28]。糖化酶在酿酒过程中主要作用于直链淀粉，能够将淀粉完全水解为葡萄糖，为后续的酵母发酵提供充足的碳源[29]。蛋白酶能够将原料中蛋白质降解为小分子多肽和氨基酸，供酿酒微生物利用，促进酿酒微生物的生长繁殖，从而促进风味物质及风味前体物质的产生[30]。微生物产生的单宁酶能够降解植物组织的单宁生成丁香酸、丁香醛、4-乙基愈创木酚等香味物质[31]。这8株菌产生的酶能够通过多种途径促进白酒酿造过程中原料转化、微生物生长繁殖以及风味物质的生成，丰富白酒的口感和香气。
2.5 菌株代谢产物挥发性风味物质解析
由图4可知，8株菌能够产生42种挥发性风味物质，这些挥发性风味物质中包括2种醛类化合物（甲缩醛、乙醛）、2种酮类化合物（环己酮、2-哌啶酮）、6种醇类化合物（3-甲基-1-丁醇、2-丁氧基乙醇、2-甲基硫乙醇、苯甲醇、苯乙醇和3-(甲硫基)-1-丙醇）、4种酸类化合物（2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、己酸、正癸酸）和13种酯类化合物（甲酸甲酯、甲酸丁酯、甲酸异戊酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、正丙酸酯、异丁酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、己二酸二异辛酯、丙二醇甲醚醋酸酯）、5种杂环类化合物、7种芳香族化合物和3种其他物质。气泡图显示，戊二酸二甲酯在所有菌株中的产量最高，其次为乙酸丁酯，丁二酸二甲酯，己二酸二甲酯，以及丙二醇甲醚醋酸酯。值得注意的是，菌株HS-12所产的挥发性产物中，吲哚的含量最高。范文来等[32]应用HS-SPME结合GC-MS在浓香型白酒生产使用的窖泥中检测到吲哚和3-甲基吲哚等2种香气化合物，并推测其与浓香型白酒“窖泥臭”风味密切相关。菌株HS-12高产吲哚的特性，暗示其可能为窖泥中“窖泥臭”风味的潜在贡献者之一。
图4 不同菌株发酵产挥发性风味物质相对含量气泡图
Fig. 4 Bubble chart of relative contents of volatile flavor compounds produced by different strains fermentation
醇、醛、酸、酯是白酒中重要的风味物质[33-40]。其中，苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物在酱香型白酒中呈现花香和水果香[41]，本研究的菌株P. vermicola HS-5能够同时产生这2种物质。张建敏[42]也发现白色链霉菌亚种A22和解淀粉芽孢杆菌B6在固态模拟发酵中可产生苯甲醇与苯乙醇。乙醛是白酒的主要醛类物质，原酒中的乙醛含量与黄水中的发酵单胞菌属（Fermentimonas）丰度呈显著正相关[1]。本研究中，B. velezensis HS-1、P. vermicola HS-5、B. toyonensis HS-14、O. profundus HS-16共4株菌能够利用LB液体培养基发酵产生乙醛。己酸是酱香型白酒及其大曲的重要风味物质，通常由己酸菌、丁酸菌代谢生成[43]，本研究在P. vermicola HS-5、B. toyonensis HS-14、B. licheniformis HS-18的代谢产物中也检测到了己酸。此外，吡嗪类物质贡献焙烤、烤面包及坚果香，主要通过氨基酸降解及美拉德反应产生；其中，2,5-二甲基吡嗪是香气强度最大的吡嗪类化合物[34]，B. licheniformis HS-4能够代谢生成该物质。上述醇、醛、酸、酯及吡嗪类等多种白酒重要风味物质的产生，构成了酱香型窖池黄水风味特征的重要物质基础。
3 结 论
本研究从酱香型窖池黄水中分离筛选出8株细菌，其在LB固体培养基上均呈现典型细菌菌落形态，显微观察显示均为杆状。除HS-5为革兰氏阴性菌外，其余均为革兰氏阳性菌，结合分子生物学鉴定，这8株菌分别为B. velezensis HS-1、B. licheniformis HS-4、P. vermicola HS-5、B. licheniformis HS-10、O. profundus HS-12、B. toyonensis HS-14、O. profundus HS-16和B. licheniformis HS-18。对应分析表明，各菌株对环境胁迫具有特异性耐受能力：HS-12耐高温（60 ℃）能力最强，HS-10对乙醇（8%）及低pH（pH 3）环境耐受性最突出，HS-4则对乳酸（25 g/L）胁迫耐受最强。在产酶能力方面，这些菌株可产6类水解酶，其中HS-10的纤维素酶活性最高，HS-5的糖化酶与单宁酶活性最强，HS-4的α-淀粉酶活性最高，HS-12的蛋白酶活性最强，HS-16则具有果胶酶活性。此外，在LB液体发酵体系中，8株菌共生成42种挥发性风味物质，涵盖醛、酮、醇、酸、酯等白酒特征风味组分。综上所述，本研究从酱香型窖池黄水中获得的8株菌，不仅具备适应酿造苛刻环境的多重耐受性，还拥有系统的产酶谱系和丰富的挥发性风味物质生成潜力，初步阐释了其在酱香型白酒酿造微环境中的功能多样性，为后续开发用于发酵调控的功能微生物资源提供了理论依据。
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