黄水是在传统固态发酵法酿造白酒过程中，由微生物代谢和谷物发酵产生的渗漉到窖池底部的棕黄色黏稠浆水，含有大量的有机成分和丰富的微生物菌群，具有资源性（可利用）与（对环境）污染性双重属性[1]。多项研究表明，黄水中以乳酸菌为主，同时含有酵母、霉菌及少量其他细菌群落，共同参与有机酸、多糖等代谢产物的形成[2]。多糖作为天然大分子物质，广泛存在于动植物及微生物中，已被证实具有抗氧化、免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性[3-5]。研究表明，从黄水中提取的多糖也具有免疫调节、抗氧化和调节肠道菌群等活性[6-10]。因此，开发和利用黄水中的多糖，不仅有助于酿酒副产物的高值化利用，而且对功能食品和新型药物的研发具有潜在价值。
在多糖的生物学活性研究中，安全性评价是其应用开发的前提。多糖作为膳食成分进入人体，必须首先明确其毒理学特征。已有文献报道了来源于真菌[11]和海藻[12]多糖的急性或亚慢性毒性研究，证实了其具有较好的安全性。但关于黄水多糖的毒理学评价，目前鲜见报道。此外，天然多糖结构复杂，存在分子质量分布广、构型多样的特点。通过化学改性可以改变其理化性质，从而增强其生物活性[13]。硫酸化改性是多糖化学改性中常用的一种方法，引入的硫酸基团能够显著提高其水溶性、增加其负电荷，从而增强其与生物大分子的相互作用[14]。龙眼多糖和山药多糖经硫酸化改性后，其对肿瘤细胞的体外增殖抑制作用和免疫调节作用较未改性多糖明显增强[15-16]。而关于黄水多糖经硫酸化改性后的活性变化，目前尚缺乏报道。
基于此，本研究首先通过分级醇沉从黄水中获得不同粗多糖组分，并对其粗多糖混合物进行急性毒性试验，以评价其安全性。在此基础上，选择体积分数40%乙醇沉淀的多糖组分（cHSP40）作为研究对象，采用氯磺酸-吡啶法对其进行硫酸化改性，并通过体外抗氧化实验比较改性前后的活性差异，为揭示黄水多糖的安全性、探究其结构-功能关系，以及为黄水高值化利用和功能食品开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄水 取自宜宾五粮液股份有限公司；浓硫酸、三氯甲烷 现代东方（北京）科技发展有限公司；吡啶、正丁醇 福晨（天津）化学试剂有限公司；氯磺酸 上海安耐吉化学试剂有限公司；牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司；单糖标准品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上试剂均为分析纯。
葡聚糖标准品 日本Shodex公司；2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羟自由基试剂盒 北京迈瑞达科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HC-3018R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；RV8型旋转蒸发仪 德国IKA公司；iS10型傅里叶变换红外光谱仪（配Thermo Scientific OMNIC软件） 美国Thermo Fisher Scientific公司；SpectraMax M2e型多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；Christ型真空冷冻干燥仪 德国Christ公司；LC-20AT型高效液相色谱仪（配RID-20示差折光检测器） 日本Shimadzu公司；TSKgel GMPWXL凝胶色谱柱 日本TOSOH公司。
1.3 方法
1.3.1 黄水多糖的制备
参照文献[7]方法并适当改良。黄水经8 000 r/min离心15 min去除杂质，上清液用Sevag试剂（CHCl3/BuOH＝4∶1，V/V）反复脱蛋白，6 000 r/min离心20 min，收集去蛋白上清液。采用梯度乙醇分级沉淀获取粗多糖。具体步骤为：首先在4 ℃条件下缓慢加入无水乙醇，使体系乙醇体积分数达到40%，于4 ℃静置24 h后，以6 000 r/min离心20 min收集沉淀，得到第1梯度沉淀，该沉淀溶解于去离子水，经截留分子质量3.5 kDa的透析袋透析后冷冻干燥，记为多糖组分cHSP40。离心所得上清液在减压旋转蒸发条件下除去乙醇，作为下一梯度沉淀的起始溶液。随后向上述上清液补加无水乙醇，使终体积分数达到60%，按同样条件收集沉淀，经溶解、透析和冷冻干燥得到第2梯度多糖cHSP60。将该次离心上清液再次减压蒸发除去乙醇，补加无水乙醇至终体积分数80%，按同样条件收集沉淀，经相同后处理得到第3梯度多糖cHSP80。经称量，每升黄水得到的粗多糖cHSP40、cHSP60和cHSP80分别为0.78、12.15 g和2.33 g。
1.3.2 急性毒性试验
1.3.2.1 实验动物及饲养管理条件
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级SD大鼠（体质量180～220 g，生产许可证号：SCXK（京）2024-0001，伦理审批编号：PONY-2024-FL-20） 斯贝福（北京）生物技术有限公司。
动物饲养管理条件：环境温度20～26 ℃，相对湿度30%～70%，12 h光照/黑暗交替。自由饮水，饲以标准块状维持饲料（产品许可证号：SCXK（京）2024-0001。实验动物使用许可证号：SYXK（京）2023-0038）。动物饲料购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。
1.3.2.2 多糖样品制备及试验设计
由于黄水中多糖以多极性组分的形式共存，将分级醇沉得到的cHSP40、cHSP60与cHSP80按其在每升黄水中的质量比（0.78∶12.15∶2.33，约1∶16∶3）进行复配，以尽可能还原黄水多糖的原始组成比例，用于急性毒性试验。
依据GB 15193.3—2014《急性经口毒性试验》选取健康SD大鼠（雌雄各半，n＝20），随机分为空白对照组（对照组，n＝10）与黄水多糖组（HSP组，n＝10），每组包括雌性和雄性大鼠各5只。实验前禁食12 h，自由饮水。HSP组以最大剂量10 000 mg/kg灌胃给药，对照组给予等体积生理盐水。灌胃后观察14 d，记录大鼠一般状态、体质量变化及死亡情况。末次称体质量后，大鼠禁食12 h，采用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，通过眼眶静脉丛采集全血。部分血液置于无抗凝促凝管中，室温静置30 min后以3 000 r/min离心10 min，分离血清，用于检测葡萄糖、尿素、肌酐和总胆固醇等血清生化指标。
1.3.2.3 脏器指数测定
将麻醉后的大鼠固定于解剖板上依次取其心、肝、脾、肺、肾及胸腺，磷酸盐缓冲液冲洗表面血液，吸干水分，称质量，按式（1）计算脏器指数：
1.3.2.4 脏器组织学观察
主要脏器（肝脏、肾脏、肺部和脾脏）取代表区域，置于10%中性甲醛固定至少24 h，经常规脱水、石蜡包埋，切片厚度4 μm，经苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色后，使用光学显微镜观察肝脏、肾脏、肺部和脾脏的病理学改变[17]。
1.3.3 硫酸化改性
乙醇分级沉淀基于多糖溶解度差异进行分级，通常较低乙醇体积分数下更易优先沉淀相对高分子质量组分，而较小分子质量组分往往需要更高乙醇体积分数才能完全沉淀[7]；本研究选用体积分数40%乙醇沉淀获得的黄水多糖组分cHSP40作为相对高分子质量代表组分用于硫酸化改性底物，以便更清晰地观察硫酸基团引入及反应酸性环境可能导致的链段降解对结构与抗氧化活性的影响。在冰水浴条件下，将氯磺酸缓慢滴加至预冷吡啶中，分别按氯磺酸与吡啶体积比1∶4和1∶2配制，边滴加边搅拌，制得2种氯磺酸-吡啶复合物，置于冰浴中预冷30 min备用。取300 mg黄水多糖溶于无水甲酰胺，随后将10 mL上述复合物分别加入多糖溶液中，于70 ℃反应2.5 h。反应结束后冷却，NaOH溶液调pH值至中性，离心除去沉淀，产物经3 500 Da透析袋透析72 h，冻干得硫酸化黄水多糖。2种衍生化多糖记为S1∶4-cHSP40和S1∶2-cHSP40。
1.3.4 多糖的化学组成测定与结构表征
选用cHSP40以及经硫酸化改性获得的2种衍生物（S1∶2-cHSP40、S1∶4-cHSP40）为研究对象，对其进行基本化学组成测定和结构表征。
1.3.4.1 基本化学组成
总糖、蛋白质和糖醛酸分别采用苯酚-硫酸法[18]、考马斯亮蓝法[19]、硫酸-咔唑法[20]测定。
采用氯化钡-明胶法[21]测定多糖组分中硫酸根含量，代入式（2）计算多糖样品的硫酸化取代度。
式中：S为硫酸根相对含量/%；1.62和1.02分别由无水葡萄糖单元摩尔质量（162 g/mol）和每引入一个硫酸酯基团（—OSO3Na）取代氢原子（—H）产生的净增摩尔质量（102 g/mol）除以100得到，旨在将硫含量的百分数值转换为质量分数参与计算；32为硫的摩尔质量（32 g/mol）。
1.3.4.2 红外光谱
参考赖文群等[22]的方法略有改动。取干燥样品约2 mg，直接置于衰减全反射（attenuated total reflection，ATR）晶体上测试（ATR模式）。确保样品完全覆盖晶体，放置完成后迅速开始扫描，扫描条件：波数400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，累计64次扫描。
1.3.4.3 单糖组成
单糖组成的测定参考Huo Jiaying等[6]的方法稍作修改。样品经2 mol/L三氟乙酸于110 ℃水解8 h后复溶，1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮衍生，经氯仿萃取除去杂质。采用高效液相色谱分析。色谱条件为C18色谱柱（200 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为0.05 mol/L KH2PO4溶液 （pH 6.7）与乙腈（83∶17，V/V），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长250 nm。以10种单糖标准品为对照，通过保留时间定性，峰面积计算各单糖的摩尔分数。
1.3.4.4 分子质量
多糖分子质量采用高效凝胶渗透色谱法测定。将样品配制成2.0 mg/mL水溶液，经0.22 μm 滤膜过滤后进样。色谱条件：TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱（分子质量300～1 000 000 Da），流动相为含0.1% NaNO3和0.06% NaN3的蒸馏水，流速0.8 mL/min，柱温40 ℃，进样量20 μL。以多种葡聚糖标准品建立标准曲线，在相同色谱条件下获得各标准品保留时间为横坐标、以标准品重均分子质量（mw）的十进对数为纵坐标，进行线性回归拟合，得到校准方程：lg mw＝-0.666 6t＋14.483 8（R2＝0.997 2）。根据保留时间计算平均分子质量。
1.3.5 抗氧化能力测定
羟自由基、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力的测定参照试剂盒说明书中的方法进行。分别使用质量浓度0.5、1.0、1.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的多糖溶液进行标准曲线测定。
1.4 数据处理与统计分析
所有实验重复3次，结果以
表示。采用单因素方差分析检验差异显著性（P＜0.05），绘图使用Origin 2021软件。
2 结果与分析
2.1 急性毒性试验结果
2.1.1 行为学观察
在整个14 d观察期内，所有实验大鼠均存活，未见死亡个体。HSP组大鼠精神状态正常，表现为自主活动规律、反应灵敏；毛发光洁，粪便性状正常，未观察到明显的异常表现。这些结果表明，即使在高给药剂量（10 000 mg/kg）条件下，黄水多糖对实验动物的生理活动未产生急性毒性作用，提示其具有较好的急性安全性。
2.1.2 体质量变化
体质量是反映实验动物整体健康状况和营养代谢水平的重要指标，实验开始前记录各组大鼠的基础体质量。雄性对照组和HSP组的体质量分别为（198.33±10.23）g和（203.41±9.32）g，雌性对照组和HSP组分别为（201.34±8.93）g和（204.98±7.23）g，对大鼠7 d和14 d的体质量增长率进行测定，结果见表1。由表1可知，HSP组与对照组大鼠在7 d与14 d的体质量增长率差异均无统计学意义（P＞0.05）。雄性与雌性大鼠均呈现正常的生长趋势，未出现体质量停滞或下降的现象。这说明黄水多糖在高剂量（10 000 mg/kg）灌胃条件下，不会抑制动物的生长发育，也未造成营养吸收和代谢障碍。结合大鼠行为学观察，可证明黄水多糖对实验动物的整体机体状况无不良影响。
表1 急性毒性试验中大鼠体质量增长率
Table 1 Growth rates of body weight of rats in the acute toxicity tests %
时间/d雌雄743.41±2.9746.77±4.2916.70±1.5320.69±1.93对照组HSP组对照组HSP组1459.54±10.1561.70±7.2524.63±1.8726.92±2.76
2.1.3 脏器指数
由表2可知，大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃及胸腺等主要脏器外观均正常，未见肿大、萎缩或出血坏死等异常表现。各HSP组脏器指数均与对照组差异不显著（P＞0.05），说明黄水多糖对实验大鼠的脏器质量和功能无明显影响。与对照组一致的结果进一步证明，该物质在急性毒性水平下未引起明显的脏器损伤。
表2 急性毒性试验中大鼠的主要脏器指数
Table 2 Main organ indexes of rats in the acute toxicity tests
%心脏0.56±0.690.58±0.270.41±0.100.45±0.46胸腺0.18±0.230.18±0.0470.21±0.0630.21±0.042脾0.23±0.0390.24±0.0340.25±0.0360.24±0.017胃0.56±0.0110.57±0.0470.64±0.0540.57±0.092脏器雌雄对照组HSP组对照组HSP组肝3.93±0.173.51±0.183.72±0.324.01±0.317肾0.74±0.0550.72±0.0600.66±0.0500.65±0.022肺0.44±0.0280.54±0.0170.50±0.0210.49±0.060
2.1.4 血清生化指标
血清学检测是评价毒性反应的常用指标。本研究选取血糖、尿素、肌酐和总胆固醇作为主要指标，分别反映机体糖代谢、肾功能和脂质代谢状态。由表3可知，HSP组与对照组在上述指标上均无显著差异（P＞0.05），且数值均处于大鼠正常参考范围内。这表明黄水多糖不会引起血糖异常波动，也未对肾小球滤过功能和肾小管代谢产生不良影响。同时，总胆固醇水平正常，提示该物质未造成脂质代谢紊乱。综合来看，血清生化结果从功能层面支持了黄水多糖的低毒性特征。
表3 急性毒性试验中大鼠的血清生化指标
Table 3 Serum biochemical parameters of rats in the acute toxicity test
组别葡萄糖浓度/尿素浓度/肌酐浓度/总胆固醇浓度/（mmol/L）（mmol/L）（μmol/L）（mmol/L）标准范围4.98～15.953.48～8.1110.90～118.071.13～3.48雄11.33±1.836.10±0.5783.08±21.692.58±0.070对照组雌13.75±0.805.59±0.5687.93±12.262.20±0.19雄9.80±1.826.91±0.04481.52±21.562.58±0.070 HSP组雌12.84±0.657.03±0.1566.65±3.502.26±0.21
2.1.5 组织学观察
为进一步评价黄水多糖的急性毒性作用，本研究对大鼠主要脏器（肝脏、肾脏、肺脏、脾脏）进行了病理组织学检查。由图1可知，无论是对照组还是HSP组，雄性与雌性大鼠各脏器的组织学结构均保持完整，未见明显病理性损伤。具体而言，肝脏切片中肝细胞排列规整，门静脉（portal vein，PV）结构清晰，肝细胞（箭头所指）完整，未观察到脂肪变性、坏死或炎症细胞浸润；肾脏中肾小球（箭头所指）与肾小管（distal tubule，DT）结构正常，细胞形态完整，未见坏死、水肿或管型形成；肺组织中肺泡（alveolus，Al）和血管（箭头所指）结构清晰，腔隙完整，未见明显炎症反应或纤维化表现；脾脏中红髓（red pulp，RP）与白髓（white pulp，WP）界限分明，小梁（箭头所指）结构完整，淋巴细胞分布均匀，无坏死及异常病变。该结果表明，黄水多糖在急性毒性试验条件下对大鼠主要脏器无明显不良影响，与血清生化指标结果相一致。结合已有文献报道，天然来源多糖普遍具有较低的毒性风险[23]，本研究结果进一步支持了黄水多糖的安全性评价。总体来看，组织学观察结果为黄水多糖的食品开发与应用提供了可靠的安全学依据。
图1 急性毒性试验中大鼠肝脏与肾脏（×200）、肺脏与脾脏（×50）的HE染色结果
Fig. 1 Hematoxylin-eosin staining results of liver and kidney (×200), lung and spleen (×50) of rats in acute toxicity test
2.2 黄水多糖的硫酸化改性
2.2.1 多糖组分分析
经氯磺酸-吡啶法处理后，得到2种硫酸化黄水多糖（S1∶2-cHSP40与S1∶4-cHSP40）。由表4可知，与原多糖（cHSP40）相比，总糖含量显著下降（P＜0.05），这与多糖主链的降解相关，糖醛酸显著减少（P＜0.05），反映了糖醛酸基团在硫酸化过程中的消耗。蛋白质含量显著降低（P＜0.05），可能与硫酸化过程中蛋白质的部分去除或降解有关。其取代度分别为0.63和0.56，表明在酸性条件下，多糖主链发生了一定程度的降解，使理化性质发生改变[21]。已有研究报道，硫酸化常伴随多糖链断裂与糖醛酸减少[24]，本研究结果与之相符。同时，吡啶用量减少时取代度升高，说明反应条件对改性效率具有显著影响[25]。
表4 黄水多糖及硫酸化黄水多糖的化学组成
Table 4 Chemical composition of Huangshui polysaccharide and sulfated Huangshui polysaccharide
糖醛酸质量分数/%质量分数/%样品总糖蛋白质量分数/%取代度cHSP4093.61±1.45a2.80±0.98a0.90±0.22aN S1∶2-cHSP4070.62±2.56b2.30±0.92b0.52±0.22c0.63±0.08a S1∶4-cHSP4080.80±4.12c2.20±0.33b0.61±0.09b0.56±0.04b
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。N.未检出，表5同。
2.2.2 黄水多糖及硫酸化黄水多糖红外光谱分析
由图2可知，原多糖（cHSP40）及其硫酸化衍生物（S1∶2-cHSP40、S1∶4-cHSP40）均呈现出典型的多糖特征吸收峰，表明硫酸化改性未破坏黄水多糖的基本骨架结构。具体而言，图中3 410 cm-1附近的吸收峰为
的伸缩振动，2 900 cm-1附近处为C—H伸缩振动峰，1 660 cm-1附近处为C＝O伸缩振动峰[26]，1 360 cm-1附近处为存在于羧基中C—O伸缩振动峰[27]。以上特征峰为多糖的特征峰。此外，3种多糖在约1 143、1 074、1 028 cm-1处均观察到吸收峰[28]，表明吡喃糖的存在。除了多糖的特征吸收峰以外，与原多糖相比，硫酸化衍生物在1 230 cm-1附近处的吸收峰归因于不对称S＝O的伸缩振动，在810 cm-1附近的吸收峰归因于对称C—O—S的伸缩振动[24]，两者均是硫酸酯的特征吸收峰。这一结果证实硫酸基团已成功引入分子链，说明改性反应有效发生。
图2 黄水多糖及硫酸化黄水多糖的红外吸收光谱图
Fig. 2 Infrared absorption spectra of Huangshui polysaccharides and sulfated Huangshui polysaccharides
图3 黄水多糖及硫酸化多糖的分子质量分布
Fig. 3 Molecular weight distribution of Huangshui polysaccharides and sulfated Huangshui polysaccharides
2.2.3 黄水多糖及硫酸化黄水多糖单糖组成分析
由表5可知，cHSP40主要由10种单糖组成，其中葡萄糖含量最高，此外还包括甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。硫酸化改性后，S1∶2-cHSP40和S1∶4-cHSP40均未检出岩藻糖，而葡萄糖含量下降，其余单糖比例则不同程度升高。单糖组成的变化表明改性过程中多糖结构发生改变。岩藻糖的消失推测与硫酸化反应条件有关。氯磺酸-吡啶法在反应过程中会产生酸性环境，虽然实现了硫酸基团的引入，但同时也会引起糖苷键的断裂。已有研究表明，不同类型的糖苷键对酸水解的稳定性不同，其中岩藻糖苷键（尤其是位于末端的岩藻糖）对酸较为敏感，极易在酸性条件下发生水解脱落[29]，这种由改性引起的单糖组成变化改变了多糖的整体结构特征[30]。这种组分差异可能影响多糖与自由基或其他生物大分子的相互作用，从而对其功能活性产生调控作用。
表5 黄水多糖及硫酸化多糖的单糖组成
Table 5 Monosaccharide composition of Huangshui polysaccharide and sulfated Huangshui polysaccharide
单糖摩尔分数/%cHSP40S1∶2-cHSP40S1∶4-cHSP40甘露糖8.1963.4172.029核糖0.1360.3900.299鼠李糖0.1080.3810.299葡萄糖醛酸1.1052.7092.718半乳糖醛酸0.3522.1973.535葡萄糖82.59374.33477.453半乳糖3.0273.9373.239木糖1.7222.6292.166阿拉伯糖2.64910.0088.252岩藻糖0.112NN
2.2.4 黄水多糖及硫酸化黄水多糖分子质量分析
分子质量是决定多糖生物学功能的重要因素。cHSP40的mw为2.3×106 Da，而S1∶2-cHSP40和S1∶4-cHSP40的mw分别降至8.7×103 Da和4.0×104 Da，类似的分子质量降低现象也存在于其他来源的多糖中。Wang Zhijun等[31]研究表明，硫酸化处理后艾蒿多糖的分子质量从7.3×104 Da降至（0.4～3.2）×104 Da。另外，葵花粉多糖的分子质量在硫酸化后从1.93×106 Da降至1.58×106 Da[32]。分子质量降低可能源于酸性条件下的水解，使多糖链断裂并生成较小分子质量片段。已有研究表明，低分子质量多糖通常表现出更好的溶解性和更高的自由基清除效率，因此推测硫酸化处理不仅通过引入硫酸基团改变了电荷特性，还通过降低分子质量进一步改善了其活性潜力[33]。
2.3 抗氧化活性的分析
由图4可知，所有样品的自由基清除率均随多糖质量浓度升高而显著增强，且总体活性顺序为VC＞S1∶2-cHSP40＞S1∶4-cHSP40＞cHSP40。在6 mg/mL时，S1∶2-cHSP40对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的清除率分别为67.13%、59.26%、68.38%，均高于S1∶4-cHSP40（62.34%、52.15%、59.14%）和cHSP40（57.31%、47.21%、55.42%），说明硫酸化改性能够显著提升黄水多糖的抗氧化性能。结合取代度分析结果，S1∶2-cHSP40的取代度高于S1∶4-cHSP40，其抗氧化活性也相应更强，提示自由基清除能力与取代度存在正相关关系。硫酸基团的引入可增加分子骨架的负电荷密度，增强电子离域效应和供氢/供电子能力，从而提高对稳定自由基（如DPPH自由基、ABTS阳离子自由基）和活性氧物种（如羟自由基）的清除效果。此外，较高取代度还可能改善多糖的水溶性与分子链伸展性，增加与自由基的接触机会，从而进一步增强清除效率。该结果与既往研究报道基本一致，Gong Pin等[34]在研究海藻硫酸化多糖时发现，其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力随取代度升高而增强；Bhuyan等[35]亦指出，硫酸化改性是提升植物来源多糖抗氧化活性的有效途径；Hao Zitong等[36]研究发现，硫酸基团作为关键取代基团，通过改善供氢/电子转移能力，对多糖抗氧化性的提升具有决定性作用。本研究结果与上述结论类似，说明取代度大小是调控硫酸化多糖抗氧化性能的重要结构因素。
图4 黄水多糖及其硫酸化衍生物的体外抗氧化活性
Fig. 4 In vitro antioxidant activities of Huangshui polysaccharides and their sulfated derivatives
3 结 论
本研究结果表明，黄水多糖在10 000 mg/kg灌胃条件下未对大鼠造成明显急性毒性反应，其体质量增长、脏器指数、血清生化指标及主要脏器组织学切片均与对照组无显著差异，说明其具有较好的急性安全性。经硫酸化改性后，多糖的取代度增加、分子质量降低，单糖组成比例发生变化。体外抗氧化实验进一步证明，硫酸化衍生物在DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除体系中的活性均显著优于原多糖，且取代度较高的S1∶2-cHSP40表现更强，提示抗氧化能力与取代度呈正相关关系。
黄水多糖是一类安全性良好的天然多糖资源，硫酸化改性能够有效提升其抗氧化性能，为黄水资源的高值化利用提供了科学依据。但本研究仍局限于急性毒性和体外抗氧化实验，其长期毒理学和作用机制层面的系统研究至关重要，未来可结合细胞及动物模型进一步探讨其结构-功能关系及应用潜力。
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