酱香型白酒以其复杂的风味体系和独特的酿造工艺在中国传统白酒中占据重要地位,其典型风格的形成与稳定在很大程度上取决于高温大曲的质量特性。大曲在酿造过程中不仅承担着糖化发酵的催化功能,其质量特征还直接影响基酒的风格形成[1-2]。在传统生产工艺中,人工制曲凭借其独特的经验传承与灵活的工艺调控,形成了具有鲜明特色的大曲生产体系。然而,随着产业规模的不断扩大,传统制曲方式面临着生产效率低、质量波动大、标准化程度不足等不足[3]。
为改善上述不足,机械制曲技术近年来在白酒酿造领域得到快速推广。与传统人工制曲相比,机械制曲在提升生产效率、保证产品质量一致性方面展现出显著优势[4]。现有研究表明,制曲工艺的差异会影响大曲的微生物群落结构和代谢特征。唐绍培等[5]利用高通量测序技术研究发现,人工制曲和机械制曲在微生物属水平上具有较高相似性,主要差异体现在各微生物属的相对丰度。张一博等[6]的研究表明,机械制曲在保持曲坯成型稳定性方面具有优势,且与传统人工制曲在感官、理化指标方面基本一致。在风味物质研究方面,张智超等[7]采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技 术研究发现,不同制曲方式下酒曲风味存在显著差异,传统制曲中酯类、醇类等挥发性风味物质含量明显高于机械制曲。值得注意的是,当前关于酱香型高温大曲机械与人工制曲的对比研究仍存在明显不足。一方面,现有研究多集中于豉香型白酒[7-9],对酱香型高温大曲的系统性研究较少;另一方面,对曲块物料特性(如密度分布、结构均匀性)与微生物代谢、风味形成之间的关联机制尚缺乏深入探讨。张健等[10]的研究表明,仿生机制曲在培养过程中的微生物种类、数量与传统人工曲基本相当,但在曲块物理特性方面的差异及其对发酵微环境的影响机制仍需进一步阐明。曲块的密度分布与结构特征直接影响发酵微环境的温湿度、通气性等关键参数,进而调控微生物群落的演替轨迹和代谢功能[11]。在实际生产中,大曲需要储存陈化后才用于酿酒,为了检验这两种曲在经历必要的储存期后,其品质差异是保持、扩大还是缩小,因此还需要对储存3个月后的指标进行分析,这是直接关系到它们在实际应用中的真实效果和稳定性。
因此,系统探究不同制曲方式下曲块物理特性与微环境、微生物代谢、风味形成之间的关联机制,对深化大曲发酵机理认知、优化生产工艺具有重要意义。该研究以酱香型高温大曲为研究对象,通过对曲块密度分布的量化分析,结合环境监测、微生物计数和风味物质检测等多维分析方法,系统比较机械与人工制曲在曲块物理特性、微环境动态、微生物群落及风味物质组成等方面的差异,旨在揭示制曲方式对大曲品质形成的影响机制,为酱香型高温大曲生产工艺的优化与创新提供理论依据和数据支撑。
酱香型高温大曲:取自某酒厂高温大曲制曲车间2025年正常生产的曲样,在生曲、1次翻曲、出仓曲、储存3个月等时间段分别取样,取样时按曲房的上、中、下3层划分,每层分别采集曲房长、宽边对角线中点及四周边缘位置的样品,再将每层所取得的样品混合均匀,作为对应发酵节点的样品。0.1%吕氏碱性美蓝染色液:上海恒远生物科技有限公司。
营养琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基:比克曼生物科技有限公司。
EinScan Pro 2X 3D扫描仪:先临三维科技股份有限公司;CX43电子显微镜:美国奥林巴斯公司;TP-A2000电子分析天平:华志电子科技有限公司;YXQ-75S11立式压力蒸汽火菌锅:上海博讯有限责任公司;TGL-16台式高速低温冷冻离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;OGS100烘箱:美国赛默飞公司;FJT652-L防爆型环境温湿度传感器:武汉奋进智能机器有限公司。
1.3.1 仓房温湿度及曲块温度的测定
自入仓至拆仓期间,环境温湿度传感器自动采集仓内温湿度数据,采样频率1次/h。同时,使用手持式探针温度计在曲堆中侧部深1 m处监测曲块温度,连续采集23 d,每日在靠门、中间、靠窗3个测温点记录温度数据。
1.3.2 曲块密度的测定
通过3D扫描仪对生曲块从整体、四周、龟背、上层、下层进行密度测定。
具体流程:测定曲块质量→标志点定位→多角度扫描→点云建模→模型裁剪→体积计算→密度推导(ρ=m/V)
1.3.3 水分的测定
参考QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[12]对生曲块从整体、四周、龟背、上层、下层进行水分测定。
1.3.4 曲块结构感官检测
参照DB52/T 1298—2018《酱香大曲生产技术规范》,对入仓生曲和一次翻仓曲的断面均匀性、紧实度、颜色等指标进行系统评定。
1.3.5 挥发性风味物质的测定
采用HS-SPME结合GC-MS技术进行挥发性风味物质的测定[13-15]。
顶空固相微萃取条件:取2 g大曲样品于20 mL顶空进样瓶中,加入5 μL内标2-辛醇(质量浓度为0.764 g/L);将装有样本的20 mL顶空进样瓶在65 ℃条件下平衡10 min;吸附样本前,SPME纤维头在250 ℃条件下,老化10 min;将老化后的SPME转移至孵育室,在65 ℃条件下,吸附样本60 min;吸附结束后,将SPME头转移至GC进样口,在250 ℃条件下解吸5 min。
GC条件:IN-NOWAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 μm×0.25 μm)。高纯氦气作为载气,恒定流速为1.0 mL/min。初始温度为40 ℃,保持2 min,以3 ℃/min的速度升至100 ℃,保持2 min,以5 ℃/min的速度升至230 ℃,保持10 min。不分流。
MS条件:传输线温度为250℃,电子电离源,离子源温度为250 ℃,电子能量为70 eV,质谱扫描范围为35~550 m/z。
定性定量:将质谱信息与美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)20谱库进行对比,同时结合保留指数(retention index,RI)对化合物进行定性分析[16],采用内标法进行相对定量分析,根据各化合物与内标物的峰面积比值及内标物浓度计算其含量。
1.3.6 微生物数量测定
酵母菌总数和酵母活菌数:采用血球板计数法测定酵母菌总数,采用美蓝染色法四测定酵母活菌数。称取10 g酒醅样品,加入含有90 mL无菌水的锥形瓶中,振荡15 min,取1 mL菌悬液低速离心,吸取上清液进行显微镜观察,读取酵母细胞数。将上清液高速离心,上清液经美蓝染色后计算酵母活菌数[17]。
细菌菌落总数:根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》方法进行测定[18]。
霉菌菌落总数:根据GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》方法进行测定[19]。
1.3.7 数据处理与分析
采用SPSS27.0对数据进行统计学分析,采用Origin2021对数据进行绘图,SIMCA14.1软件进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),计算变量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值,以VIP>1为条件筛选主要差异香气成分。
对机械制曲及人工制曲曲房温湿度及曲块温度进行23 d连续监测,结果见图1。由图1a可知,机械制曲曲房温度波动较大,曲块在发酵第2天出现急速升温,温度由第1天的25.7 ℃升至49.9 ℃,温差达24.2 ℃,这种非稳态的快速的升温可能导致酵母早期衰亡;于第9天进行1次翻仓后,曲块温度从63.3 ℃骤降至43.2 ℃,温差达20.1 ℃。于第17天进行第2次翻仓后,曲块温度再次出现降温,幅度为10.7 ℃。此外,曲房湿度波动较大,并在第4天出现短暂极端高湿,可能影响微生物平衡。由图1b可知,人工制曲曲房的温度稳定性较高。第1次翻仓后,曲块温度从63.1 ℃降至47.9 ℃,降温幅度为15.2 ℃。2次翻仓后的降温幅度为15.9 ℃,明显高于机械制曲同期幅度。人工制曲的湿度变化更为稳定,且与温度变化具有更好的协同性。综合比较,机械制曲在升温速率、翻仓后温度波动及湿度稳定性方面均与人工制曲存在显著差异。人工制曲因曲块密度更高,蓄热与保水能力更好,使得整体温湿度控制更为平稳。值得注意的是,两次翻仓后的降温区间均处于芽孢杆菌的最适生长温度范围,这一温度窗口实质上是对微生物群落的一次重要选择和调控。李喆等[20]的研究也明确了类似发酵过程中温湿度的变化规律,与本结果相互印证。上述分析表明,机械制曲工艺在关键阶段的温湿度控制稳定性不足,这可能是导致其微生物群落偏离理想状态的潜在环境因素。
图1 机械制曲(a)及人工制曲(b)曲房温、湿度及曲块温度曲线
Fig.1 Temperature and humidity curve of fermentation room and temperature curve of Qu bricks in mechanical (a) and manual (b) Qu-making processes
在曲块成型阶段,理想的曲块形态应呈现四周紧实、中间隆起、密度结构适度的“龟背”状特征。这种独特结构有利于促进空气向曲块内部扩散,从而为微生物的生长繁殖及代谢活动创造适宜的环境条件。因此,曲块的密度同样是评价曲块质量的重要指标之一。通过测定曲块密度,可以间接反映其疏松程度,进而实现对曲块品质的客观评估。对机械制曲和人工制曲的曲块密度进行测定,并对结果进行t检验分析,结果见图2。由图2可知,机械制曲所得曲块的密度整体显著低于人工制曲(P<0.05)。在曲块的不同区域,除上下层密度差异不显著外(P>0.05),龟背和四周部位均表现出机械曲块密度极显著低于人工曲块的密度差异(P<0.01)。虽然机械制曲在部分区域的密度控制效果与人工制曲存在一定的相似性,但在大多数区域,与人工制曲仍存在差异,这一结果表明,当前机械制曲技术在曲块密度控制方面存在明显不足。
图2 机械曲和人工曲各位置密度差异
Fig.2 Density differences in various locations of mechanically and manually made Qu
“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01),“NS”表示差异不显著(P>0.05)。下同。
对机械制曲和人工制曲的曲块的水分含量进行测定,并对结果进行t检验分析,结果见图3。
图3 机械曲和人工曲各位置水分差异
Fig.3 Moisture content differences in various locations of mechanically and manually made Qu
由图3可知,人工制曲曲块各部位的水分含量均极显著高于机械制曲(P<0.01),该差异主要源于两者制曲工艺的本质区别。其中,下层区域的水分含量差异最为显著,机械班组为39.17%,人工班组为40.57%,绝对差值达1.4%。进一步分析表明,两种制曲方式下曲块的水分分布趋势存在明显差异:机械制曲组表现为龟背>四周>混合>上层>下层(39.49%>39.45%>39.43%>39.26%>39.17%),其中龟背区水分含量较高可能与该区域表面密度较高、成型过程中水分散失速率较低有关,而上下层水分含量较低则与成型时受压较大导致水分挤出,以及挥发-蒸发双重作用相关。人工制曲则呈现下层>龟背>混合>上层>四周(40.57%>40.48%>40.41%>40.38%>40.34%)的分布特征,其下层水分保持较高水平可能与人工工艺中曲块堆积厚,在重力作用下水分迁移受阻有关。从成型机制分析,机械制曲采用高压快速成型工艺,导致发酵前期物料结构相对松散、孔隙率较高(1.00 g/cm3),发酵前期水分蒸发速率较快;而人工制曲通过渐进式踩制压实形成致密结构(1.07 g/cm3),具有更好的锁水性。
对曲块断面的均匀性、紧实度、内部物料堆叠方式的跟踪研究,其生曲、一次翻曲及拆仓曲的断面图见图4。
图4 生曲(a,b)、一次翻曲(c,d)及拆仓曲(e,f)断面示意图
Fig.4 Cross-section diagram of raw Qu (a,b),first-turn Qu (c,d) and Chaicang Qu (e,f)
a、c、e为机械曲,b、d、f为人工曲。
由图4a和4b可知,在物料堆叠方式上,机械曲呈现堆叠型,而人工曲呈现内嵌型,二者内部结构特征明显不同。从生曲断面观察,机械制曲曲块内部物料排列较为有序,气孔分布相对均匀,整体结构一致性较好,无明显松散或过度紧实现象,表明其在原料混合与成型环节控制良好。相比之下,人工制曲曲块均匀性稍差。在紧实度方面,人工曲整体紧实度略高于机械曲,机械曲仅在龟背处稍显松散。由图4c和4d可知,在一次翻曲断面中,械制曲整体结构保持较好,仅龟背处略显松散;人工制曲则部分区域气孔分布较为密集,局部松散问题依然存在,反映出其在生曲制作环节受人为操作差异影响较大,均匀性控制难度较高。由图4e和4f可知,在拆仓曲断面中,人工制曲曲块紧实度良好且分布较为均匀,而机械制曲曲块则出现表皮与内部分层现象。这种差异可能源于制曲工艺的不同,人工制曲凭借经验与操作力度可实现整体均匀紧实;机械制曲受设备参数、模具及压曲方式影响,易导致曲块在成型过程中表皮与内部受力不均,从而形成结构分层。这一结构差异可能进一步影响发酵过程中水分与气体的传递,导致微生物分布与生长不均,对最终发酵效果产生潜在影响。
2.5.1 挥发性风味物质含量分析
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HSSPME-GC-MS)对机械制曲与人工制曲的拆仓曲及储存3个月后的大曲样品进行挥发性风味物质分析,各类挥发性风味物质含量测定结果见表1,聚类分析热图见图5。
表1 机械及人工拆仓曲和储存3个月大曲挥发性风味物质含量测定结果
Table 1 Determination results of volatile flavor compounds in mechanical and manual Chaicang Qu and three-month-stored Daqu
图5 人工与机械拆仓曲(a)及储存3个月大曲(b)挥发性风味物质热图
Fig.5 Heat map of volatile flavor compounds in mechanical and manual Chaicang Qu (a) and three-month-stored Daqu (b)
“A1~A10”为人工曲,“M1~M10”为机械曲。
由表1及图5可知,在对机械大曲的研究中,拆仓曲中共检测出148种挥发性风味物质,主要为44种酯类物质和25种吡嗪类物质。从总量来看,机械大曲的挥发性风味物质总含量为248.11 μg/g,高于人工大曲的106.48 μg/g。进一步对各类物质进行分析发现,酯类物质在机械大曲中含量为52.60 μg/g,远高于人工大曲的17.98 μg/g;吡嗪类物质含量分别为68.74 μg/g(机械)与27.48 μg/g(人工),显示出机械大曲在关键风味组分方面的优势、酸类亦呈现相同趋势,机械大曲中含量为83.65 μg/g,人工大曲为45.45 μg/g。而部分可能对风味产生负面影响的物质在机械大曲中同样含量较高,如酮类(机械7.45 μg/g,人工2.07 μg/g)、醛类(机械6.02 μg/g,人工1.16 μg/g)及醇类(机械16.43 μg/g,人工4.49 μg/g)。这些差异可能与机械制曲过程中温湿度、通气等工艺参数的控制有关,后续需进一步优化工艺,以调控不良风味物质的形成。此外,蒋力力等[21-22]对不同高温大曲中挥发性成分差异及对贮曲过程中微生物和理化因子会影响风味的研究,均从不同角度佐证了制曲方式对风味轮廓的显著影响,与本研究结论相互支撑,共同揭示机械与人工制曲在风味物质构成方面的特征差异。
从表1及图5亦可知,储存3个月后的大曲共检测到122种挥发性风味物质,主要成分为41种酯类物质和18种吡嗪类物质,但物质总数较拆仓阶段有所下降。在总含量方面,人工大曲由106.48 μg/g降至99.63 μg/g,机械大曲则由248.11 μg/g降至135.28 μg/g,降幅分别为6.4%和45.5%。就关键风味物质而言,酯类在机械大曲中含量为45.28 μg/g,仍高于人工大曲的38.84 μg/g,但差距较拆仓阶段明显收窄;吡嗪类亦呈现相同趋势,机械大曲中含量为39.87 μg/g,人工大曲为19.70 μg/g,差异比例有所降低。此外,在储存过程中新检出的烯烃类与吡啶类物质中,机械大曲中含量分别为0.96 μg/g和0.19 μg/g,略高于人工大曲的0.49 μg/g和0.15 μg/g,说明储存过程中机械大曲在部分次生代谢产物方面仍具生成优势[23-24]。
综上,储存对两类大曲风味组成的调控作用具有差异性,也为后续优化机械制曲工艺与贮曲管理提供了数据依据。
2.5.2 挥发性风味物质差异分析
为进一步挖掘大曲挥发性风味物质的差异性,分别对拆仓及储存3个月后的人工和机械大曲挥发性风味物质进行PLS-DA和200次置换检验,并利用VIP值来衡量各代谢物表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力,从而辅助筛选代谢标志物,结果见图6。
图6 人工与机械拆仓曲及储存3个月大曲挥发性风味物质偏最小二乘判别分析(a,d)、200次置换检验结果(b,e)及变量重要性投影值(c,f)
Fig.6 Partial least squares discriminant analysis (a,d),200 permutation test results (b,e),and variable importance projection values (c,f) of volatile flavor compounds in manual and mechanical Chaicang Qu and three-month-stored Daqu
由图6a可知,在拆仓阶段,第1主成分(principal component 1,PC1)与第2主成分(PC2)的方差贡献率分别为53.1%与6.96%,两类样本在得分图中呈现明显分离趋势,说明人工制曲与机械制曲在拆仓时期的风味物质组成具有明显差异。模型的R2为0.995,R2越接近1,表示该PLS-DA模型的解释能力越好,一般R2在0.7~0.8间模型的解释能力较好。Q2表示模型的预测能力,为0.971,Q2越接近1,表示该PLS-DA模型的预测能力越好,一般Q2>0.5较好。对该模型参数R2和Q2进行了置换检验,次数为200次。Q2的回归线在纵坐标上的截距<0则说明不存在过拟合,PLS-DA模型比较可靠(图6b)。依据VIP值>1筛选主要差异物质,结果共确定82种主要差异挥发性风味物质,这些差异组分主要涵盖吡嗪类、酯类及酸类等关键风味物质,是区分人工与机械大曲的核心风味标志物。VIP值排名前3的差异物质分别为乙酰胺(VIP值=1.40)、肉豆蔻酸甲酯(VIP值=1.39)与十一醇甲酯(VIP值=1.37)。其中,乙酰胺作为胺类物质可能对风味轮廓产生一定影响,而两种酯类化合物则通常贡献果香与脂肪香韵(图6c)。
由图6d可知,储存3个月后,发现两组样本区分性很好,PC1与PC2的方差贡献率分别为46.4%与10.3%,仍能有效区分两类大曲,表明随着储存时间延长,人工与机械大曲在挥发性风味轮廓上仍保持稳定差异,进一步验证了制曲方式对风味构成的持续影响。使用置换检验(n=200)对构建的PLS-DA模型进行可靠性验证,模型分析数据良好。置换检验图显示(图6e),左侧所有的R2和Q2值均低于右侧的原始点,表示3组模型未过度拟合,模型有意义,可用于后续筛选差异代谢物。依据VIP值>1筛选关键差异物质,共筛选出56种主要差异挥发性风味物质(图6f)。VIP值最高的三种差异物质依次为2,3,5,6-四甲基吡嗪(VIP值=1.47)、2-甲基-4-甲氧基苯胺(VIP值=1.46)及乙酸乙烯酯(VIP值=1.45)。2,3,5,6-四甲基吡嗪作为典型吡嗪类物质,具有浓郁的烘烤与坚果香气;2-甲基-4-甲氧基苯胺可能带来特殊胺类风味;乙酸乙烯酯则为酯类组分之一,常赋予清爽果香。这些高VIP值物质在两类大曲中含量差异显著,进一步从变量贡献角度明确了人工与机械制曲在挥发性风味组成方面的关键差异,也为后续定向调控机械制曲工艺提供了潜在标志物。
对储存3个月后的机械曲与人工曲进行微生物计数,并进行差异性分析,结果见表2。
表2 人工曲与机械曲的微生物计数结果
Table 2 Microbial count results of manually and mechanically made Qu
注:“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01)。
由表2可知,机械曲与人工曲中酵母菌数量均远超细菌和霉菌,占据绝对优势。对两种大曲的微生物数量的进一步分析显示,两组的酵母活细胞数及活菌率并无显著差异(P>0.05),表明酵母菌在储存期间活性维持良好,稳定性较强[25-26]。相比之下,霉菌数量整体处于较低水平,但人工曲的霉菌数量显著高于机械曲(P<0.05)。这一差异清晰地反映了制曲工艺对微生物的影响:人工制曲主要依赖自然微生物群落,霉菌的多样性或许更为丰富,这为大曲赋予了独特风味,开放式环境促进了部分功能菌的富集;机械制曲则有效减少了人为因素干扰,抑制了杂菌生长,提升了生产效率与产品稳定性,但该方式限制了微生物多样性,可能对风味丰富度产生影响。两种工艺在调控特定微生物群落方面展现出不同的侧重点。
该研究系统对比了酱香型高温大曲的机械与人工制曲差异,机械制曲呈现“快速升温-剧烈波动”的温控特征,而人工制曲温湿度协同稳定。曲块物理特性分析表明,人工制曲具有更高的密度和更均匀的水分分布,内嵌的结构特性有效维持了曲块的整体紧实度,而机械制曲则出现表皮与内部分层现象。在挥发性风味物质方面,HS-SPMEGC-MS分析显示,拆仓曲中机械制曲的酯类(52.60 μg/g)和吡嗪类(68.74 μg/g)等风味物质含量高于人工制曲;进一步分析显示,两类大曲在酮类与醛类物质含量上存在明显差异,机械制曲中此类物质的含量相对较高。这些物质在适量时可贡献特定香气,但过量积累可能形成风味缺陷,影响大曲风味的纯净与协调,因此在工艺中需加以关注与控制。PLS-DA显示,人工曲与机械曲样本呈现明显分离趋势,通过变量重要性投影分析,鉴定出82种VIP值>1.0的主要差异物质。储存3个月后,人工曲和机械曲的风味物质总量均有所下降,其中机械大曲降幅更为明显;尽管关键风味物质的绝对差值缩小,通过构建PLS-DA模型仍能有效区分二者,进一步的VIP值分析,识别出了56种VIP值>1.0的主要差异物质。在微生物方面,储存3个月的大曲,人工制曲霉菌数量(7.33×103CFU/g)极显著高于机械制曲(5.26×103CFU/g)(P<0.01),酵母菌活细胞数(约4.5×107 CFU/g)和活菌率(约90%)与机械制曲无显著差异(P>0.05)。研究结果不仅为优化高温大曲的生产工艺提供了重要参考,也为提升酱香型白酒的品质奠定了坚实基础。
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Effect of mechanical and manual Qu-making on the quality of high-temperature Daqu