氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一种可引发肺癌、肝癌等恶性肿瘤的致癌物，长期摄入会显著提升癌症发病率[1-3]。2007年被世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）由2B类致癌物升级为2A类致癌物[4-5]。同时EC也是发酵食品和酒精饮料在发酵和贮存过程中的天然伴随产物[6-7]。葡萄酒作为一种发酵酒，在其发酵过程中也会产生EC[8]，2002年联合国粮食及农业组织（FoodandAgricultureOrganizationof the United Nations，FAO）确定EC为重点监控物质，并制定了国际标准：规定葡萄酒中其质量浓度不得超过20 μg/L[9]，其他国家也制订了标准限量：加拿大和美国佐餐葡萄酒中EC的限量分别为不得超过30 μg/L和15 μg/L[10-11]。我国目前还未制定相应限量标准，但随着我国消费者的消费水平越来越高、对食品安全要求越来越高，葡萄酒的品质和安全问题越来越受瞩目。基于这些现状，我国对于葡萄酒中EC的研究越来越重视。因此，准确检测葡萄酒中EC的含量至关重要。
目前检测EC的方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等。检测方法成熟但各有优缺点，可结合实际样品情况与检测条件选择相应检测手段。本实验根据GB 5009.223—2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》[12]，选择气相色谱-质谱联用法，结合CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[13]，梳理实验过程中关键环节，对葡萄酒中EC不确定度进行评定，为葡萄酒中EC检测的准确性及可靠性提供保障。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡萄酒样品：河北沙城产区瓶贮期干红葡萄酒，酒精度13.5%vol。
无水硫酸钠、氯化钠、乙醚（均为分析纯）：国药集团化学试剂公司；正己烷、乙酸乙酯、甲醇（均为色谱纯）：美国Fisher Scientific公司；氨基甲酸乙酯（EC）标准品（纯度＞99.0%）、D5-氨基甲酸乙酯（D5-EC）（纯度＞98.0%）：天津阿尔塔科技有限公司。
1.2 仪器与设备
6890N-5975C气相色谱-质谱仪、HP-INNOWAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦科技公司；Cleanert EC固相萃取（solid-phase extraction，SPE）柱（碱性硅藻土填料）、SPE-12P固相萃取装置：博纳艾杰尔科技有限公司；HGC-12A氮吹仪：天津恒奥科技发展有限公司；KQ5200DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SX-2.5-12D箱式电阻炉：天津市泰斯特仪器有限公司；BT125D电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
将葡萄酒实验样品摇匀后吸取2 g，加100 μL D5-EC内标使用液（2.00 μg/mL），加氯化钠0.3 g，功率200 W超声5 min，溶解，混匀，将样品加至固相萃取柱上，使之缓慢渗入萃取柱中，静置10 min。经10 mL正己烷淋洗，用洗耳球挤干萃取柱，用10 mL的5%乙酸乙酯-乙醚溶液以约1 mL/min流速洗脱，用洗耳球挤干萃取柱，洗脱液中加2 g无水硫酸钠脱水，脱水后倒入带刻度试管中，室温下氮吹至约0.5 mL附近，用甲醇定容至1 mL[12]，过0.22 μm有机膜，上机检测。
1.3.2 标准曲线的制作
配制质量浓度为2.00 μg/mL的D5-EC内标使用液：准确吸取D5-EC（100 μg/mL）标准物质1 mL，用甲醇定容至50 mL容量瓶。
配制质量浓度为1.00 μg/mL的EC储备液：准确吸取EC（100μg/mL）标准物质1mL，用甲醇定容至100mL容量瓶中。
从EC储备液（1.00 μg/mL）中准确吸取5.0 μL、10.0 μL、20.0 μL、50.0 μL、100 μL、200 μL，各加100 μL D5-EC内标使用液（2.00 μg/mL），用甲醇定容至1 mL容量瓶，得到0.005 μg/mL、0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL的标准曲线工作溶液。以EC质量浓度为横坐标（x），以标准曲线工作溶液中EC峰面积与D5-EC的峰面积的比为纵坐标（y），制作标准曲线。
1.3.3 仪器条件
色谱条件：进样口温度220 ℃；升温程序：初始温度50 ℃，保持1 min[17]，以8 ℃/min升至180 ℃，然后以20 ℃/min升至240 ℃后运行5 min。
质谱条件：传输线温度250 ℃；四级杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；溶剂延迟11.5 min；不分流进样；选择离子模式监测（selected ion monitor，SIM）；EC选择监测离子：62、44、74；D5-EC选择监测离子：64、76。
1.3.4 定性定量方法
定性：按照上述色谱和质谱条件测定样品和标准工作溶液，根据样品与标准工作溶液的色谱峰保留时间定性。
定量：根据待测物的峰面积，通过标准曲线确定样品中EC的质量浓度。
1.3.5 结果计算
相对校正因子（f值）的计算公式如下：
式中：f：EC的相对校正因子；A1：工作溶液f值测定时内标D5-EC的峰面积；A2：工作溶液f值测定时EC的峰面积；d1：添加于工作溶液中的D5-EC质量浓度，μg/mL；d2：工作溶液中EC质量浓度，μg/mL。
葡萄酒中EC含量计算公式如下：
式中：X：样品中的EC含量，μg/kg；A3：样品中EC的峰面积；A4：添加于样品中内标D5-EC的峰面积；V0：检测样品的定容体积，mL；d3：添加于样品中D5-EC的质量浓度，μg/mL；m：样品质量，g。
1.3.6 不确定度来源分析
葡萄酒中EC含量测定不确定度可能的来源见图1，其主要来源有以下6个方面：A类评定：①样品的测量重复性引入的不确定度；②标准曲线拟合引入的不确定度；③回收率引入的不确定度。B类评定：①标准溶液配制过程引入的不确定度[14-15]；②样品制备过程中引入的不确定度[16]；③气相色谱-质谱仪引入的不确定度[17]。
图1 葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量测定的不确定度来源
Fig.1 Uncertainty sources in the determination of ethyl carbamate content in wine
2 结果与分析
2.1 A类不确定度的评定
2.1.1 测量结果重复性的不确定度urel（r）
在重复性条件下，对葡萄酒样品中的氨基甲酸乙酯进行重复10次（n=10）独立测试，得到的测定结果见表1。
表1 葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量测定结果
Table 1 Determination results of ethyl carbamate content in wine
2.1.2 标准曲线拟合引入的不确定度urel（B）
将配制好的不同质量浓度的标准溶液上机检测，每个质量浓度分别测量6次，样品平行测量10次，取平均值进行标准曲线拟合。得出标准曲线线性回归方程为y=1.254x+0.000 783 9，相关系数＞0.999，平均值67.0 μg/kg。
式中：yi为各质量浓度EC和内标峰面积的比值，y0为各标准溶液质量浓度代入到线性回归方程中得到的标液峰面积与内标的比值，n为标准溶液测量次数（本实验测定6次），α为标准曲线斜率，p为样品测量次数（本实验测定10次），Ci为各标准溶液质量浓度，C¯为标准溶液质量浓度平均值（64.17 μg/kg），Cs为待测样品的平均值（67.0 μg/kg）。
经计算得到标准曲线拟合相对标准不确定urel（B）=
2.1.3 回收率引入的不确定度urel（R）
在本底值为67.0 μg/kg的样品中加入标准溶液，加标量为20 μg/kg，重复测定10次，得到加标回收结果，结果见表2。由表2可知，回收率平均值为：
；单次测量标准差
表2 样品加标回收试验测定结果
Table 2 Determination results of standard addition recovery tests of sample
式中：Xi为每次测定EC的结果，
为测定的EC的平均值，n为测定次数。
因此由回收率引起的相对不确定度
0.004 6。
2.2 B类不确定度的评定
2.2.1 标准物质配制引入的不确定度urel（P）
2.2.1.1 标准物质引入的不确定度
标准物质引入的不确定度属于B类不确定度[15]，通过查阅标准物质证书可知，EC标准物质相对扩展不确定度为5%（k=2），特性量值99.8 μg/mL，纯度99.9%，因此EC标准物质引入的不确定度为
D5-EC标准物质相对扩展不确定度为5%（k=2），特性量值99.9 μg/mL，纯度99.3%，因此D5-EC标准物质引入的不确定度为
2.2.1.2 标准溶液配制过程中计量器具引入的不确定度
标准溶液配制过程中使用的容量瓶及移液器会引入不确定度。在实验过程中使用的容量瓶均为A级容量瓶，其相关参数据依据JJG196—2006《常用玻璃量器检定规程》[18]；移液器的相关参数依据JJG 646—2006《移液器检定规程》[19]。均采用三角分布计算，引入误差可以得到量器示值允差产生的不确定度。
根据1.3.2配制标准曲线工作溶液，在此过程中由计量器具引入的不确定度见表3。
表3 标准曲线工作溶液配制过程中计量器具引入的不确定度
Table 3 Uncertainty introduced by measuring instruments during the preparation of standard curve working solutions
因此得出由标准溶液配制过程中使用的计量器具引入的不确定度：
式中：当n≠12时，cn=1；当n=12时，cn=6。
2.2.1.3 标准溶液配制过程中温度引入的不确定度
实验室温度在（20±2）℃范围内，温度变动对体积测量的影响可以通过体积膨胀系数来进行计算。甲醇的体积膨胀系数为1.18×10-3/℃，远大于玻璃的体积膨胀系数2.5×10-5/℃，体积变化主要考虑膨胀系数较大的溶剂即可[20]，因此由甲醇的体积变化产生，按均匀分布计算温度变化产生的不确定度，根据定容体积计算相对不确定度，结果见表4。
表4 标准溶液配制过程中温度引入的不确定度
Table 4 Uncertainty introduced by temperature during the preparation process of standard solution
因此得出由温度引入的不确定度：urel（T）=
0.004 0。
综上，标准物质配制过程引入相对不确定度：urel（P）=
2.2.2 样品制备过程引入的不确定度urel（S）
2.2.2.1 样品称量引入的不确定度
2.2.2.2 由5%乙酸乙酯-乙醚溶液引入的不确定度
在样品前处理过程中，使用5%乙酸乙酯-乙醚溶液进行最后的洗脱步骤，所以考虑该溶液引入的不确定度[22]。用5 mL分度吸量管（允许误差±0.025 mL）吸取乙酸乙酯至100 mL容量瓶（允许误差±0.10 mL），用乙醚定容。按照三角分布计算[23]，5 mL分度吸量管引入的相对不确定度为：
；100 mL容量瓶引入的相对不确定度为：
2.2.3 气相色谱-质谱仪引入的不确定度urel（I）
2.3 合成不确定度urel（X）
对葡萄酒中EC测定过程中不确定度分量进行汇总，结果见表5。
表5 不确定度分类汇总
Table 5 Classification and summary of uncertainty
由表5可知，在测定过程中，对EC不确定度的贡献大小依次为：urel（I）＞urel（P）＞urel（S）＞urel（R）＞urel（r）＞urel（B），其中气相色谱-质谱仪引入的不确定度最大。
2.4 扩展不确定度U
依据JJF1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[25]，取置信水平p=95%，包含因子k=2，扩展不确定度为U=urel（X）×2=0.199 8。该样品最终结果可表示为：X=（67.0±0.199 8）μg/kg，k=2。
3 结论
本研究采用GC-MS内标法测定葡萄酒中EC的含量，标准曲线回归方程线性良好（R2＞0.999），RSD为0.417 9%，回收率为97.5%～102.5%，对该过程中引入的不确定度进行分析、评定。结果表明，当检测样品中EC含量为67.0 μg/kg时，其扩展不确定度为0.199 8 μg/kg（k=2）。不确定度主要来源于样品测量重复性、标准曲线拟合、加标回收、标准溶液配制、样品前处理及使用到的气相色谱-质谱联用仪。其中气相色谱-质谱联用仪引入的不确定度最大，标准物质配制过程中引入的不确定度次之，样品制备过程、回收率、重复性引入的不确定度较小，而标准曲线拟合引入的不确定度影响极小。在实验过程中，相关人员要特别注意对仪器的维护保养，定期校准，及时核查。同时也要提高实验室检测人员操作技术水平，规范实验流程，使用合格校准检定的仪器设备，合理控制环境温度，从而降低各环节引入的不确定度，提高实验数据的准确度、可信度。
[1] MILLER Y E,DWYER-NIELD L D,KEITH R L,et al.Induction of a high incidence of lung tumors in C57BL/6 mice with multiple ethyl carbamate injection[J].Cancer Lett,2003,198(2):139-144.
[2] WU D H,LI X M,SHEN C.Decreased ethyl carbamate generation during Chinese rice wine fermentation by disruption of CAR1 in an industrial yeast strain[J].Int J Food Microbiol,2014,180:19-23.
[3] GOWD V,SU H M,KARLOVSKY P,et al.Ethyl carbamate:an emerging food and environmental toxicant[J].Food Chem,2018,248:312-321.
[4] BAAN R,STRAIF K,GROSSE Y,et al.Carcinogenicity of alcoholic beverages[J].Lancet Oncol,2007,8(4):292-293.
[5] 辛茜，贾少杰，郑欣欣，等.白酒中氨基甲酸乙酯的研究进展[J].酿酒科技，2022（1）：42-46.
[6] 王金梦，范文来，徐岩，等.中试规模壶式二次蒸馏对白酒中氨基甲酸乙酯和氰化物以及原酒品质影响[J].食品与发酵工业，2022，48（5）：53-57.
[7] OUGH C S.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods.I.Naturally occurring ethyl carbamate[J].J Agr Food Chem,1976,24(2):322-328.
[8] 马延琴，许尤尤，叶丕平，等.红葡萄酒中氨基甲酸乙酯检测方法的优化[J].中国酿造，2022，41（7）：220-224.
[9] 周勇，李晓明，梁德沛，等.气相色谱-串联质谱法测定酒中氨基甲酸乙酯的含量[J].酿酒科技，2013（5）：97-99.
[10] 王根杰，李德美，张亚东，等.不同发酵处理对赤霞珠葡萄酒中氨基甲酸乙酯产量的影响[J].食品与发酵工业，2018，44（8）：172-176.
[11] 阮仕立，王宏安，张杰，等.干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量及影响因素调查[J].中外葡萄与葡萄酒，2022（4）：45-49.
[12] 国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.223—2014食品中氨基甲酸乙酯的测定[S].北京：中国计量出版社，2015.
[13] 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL006：2019化学分析中不确定度的评估指南[S].北京：中国计量出版社，2019.
[14] 王绮，林武，王衍添.气相色谱法测定食品接触塑料制品中1,4-丁二醇迁移量的不确定度评定[J].化学分析计量，2025，34（6）：131-136.
[15] 王佳欣.气相分子吸收光谱仪测定水质硫化物的不确定度评定[J].广州化工，2025，53（13）：75-77，80.
[16] 秦燕飞，孙建平，任艳文，等.气相色谱-质谱法测定葡萄酒用软木塞中2,4,6-三氯苯甲醚的不确定度评定[J].中国酿造，2020，39（11）：163-168.
[17] 赵毅，赵君楠，王滢，等.GC-MS外标法测定邻苯二甲酸二正丁酯含量的不确定度评定[J].盐科学与化工，2022，51（8）：17-20.
[18] 国家质量监督检验检疫总局.JJG196—2006常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2006.
[19] 国家质量监督检验检疫总局.JJG 646—2006移液器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2006.
[20] 李珍，蔡良平，张学荣，等.食品检测实验室不确定度评估的探讨[J].粮食与食品工业，2022，29（6）：65-67，72.
[21] 张吉，周吉峙，段路路.气相色谱法测定土壤中石油烃含量的不确定度评定[J].肥料与健康，2020，47（2）：70-76.
[22] 刘继辉，汤丽华，高琳.红酒软木塞中愈创木酚残留量的不确定度评定[J].食品工业，2023，44（8）：323-327.
[23] 严开芹，谭荣威，曾小平，等.高效液相色谱法测定酱油中苯甲酸含量的测量不确定度评定[J].食品安全导刊，2024（36）：42-45.
[24] 许晓寒思，岑耀颖，朱彤，等.超高效液相色谱-质谱法测定肉类食品中瘦肉精的不确定度评定[J].化学分析计量，2023，32（4）：83-87.
[25] 国家质量监督检验检疫总局.JJF 1059.1—2012测量不确定度评定与表示[S].北京：中国计量出版社，2012.