食醋是以谷物或水果为原料经微生物发酵制成的液态产品，兼具调味与防腐功能[1]。禄丰香醋是云南特色米醋[2]，以糯米为原料，通过多菌种协同的糖化-酒化-醋化工艺制备，其发酵微生物来源于麸皮、谷壳以及环境介质[3]。除调味外，食醋还具有调节胆固醇、抗菌[4]及保肝[5]等生理活性。抗氧化性能是食醋重要的品质特性，有研究表明，山西老陈醋的总抗氧化活性与其总多酚和总黄酮含量高度相关，尤其在发酵过程中的熏醅阶段抗氧化能力显著提升[6]。湘西香醋在低浓度下仍具有显著的自由基清除能力，尤其是对羟基自由基的清除效果明显，同时能有效降低体内活性氧含量，提高抗氧化酶活性，并减少细胞凋亡[7]。此外，抗氧化活性与酒精性肝损伤存在着密切联系，酒精性肝损伤的关键机制之一是氧化应激。当乙醇进入体内后，会刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）如超氧阴离子自由基（O2-·）和过氧化氢（H2O2）的过量生成，同时消耗内源性抗氧化物质，如谷胱甘肽（glutathione，GSH）和超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD），导致氧化-抗氧化系统失衡。这种氧化应激状态可引发肝细胞大分子物质过氧化损伤，最终造成肝细胞坏死[8]。目前关于食醋保肝效果的研究相对较少，而现有保肝效果研究多采用构建动物模型（如酒精诱导肝损伤小鼠模型），通过检测血清及肝脏生化指标，验证其保肝效果[9]。
禄丰香醋作为地方特色发酵产品，其抗氧化性和保肝效果的研究鲜有报道，因此本研究通过测定禄丰香醋的总黄酮（total flavonoid content，TFC）与总多酚（total phenolic content，TPC）含量并考察其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylben-zothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）阳离子自由基清除能力及羟基自由基清除活性，评价其体外抗氧化活性。采用乙醇诱导的小鼠急性酒精性肝损伤模型，测定血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）活性以及天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性，并结合肝组织苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色分析，评价禄丰香醋的体内、外抗氧化活性和急性酒精性肝损伤修复效果，为开发禄丰香醋作为功能性食品的原辅料提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样品与试剂
禄丰香醋：云南省楚雄市禄丰县禄丰香醋厂，陈酿时间分别为6、5、4、3年（对应生产年份为2017年、2018年、2019年、2020年）。无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级5周龄昆明鼠（合格证书编号：No.4100000000000005607）：河南斯克贝斯生物科技股份有限公司。
福林酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；芦丁、没食子酸（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；总蛋白定量试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、ABTS溶液、DPPH溶液：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
H2-16KR型高速台式离心机：湖南可成仪器设备有限公司；VOTEX-5型涡旋仪：其林贝尔有限公司；HH-4型恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；UV-9000S型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 总黄酮及总多酚含量分析
1.3.1.1 总黄酮含量测定
参考文献[10]的方法并加以修改，准确吸取芦丁标准溶液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL分别置于10 mL比色管中，加乙醇5 mL、10%NaNO2溶液0.4 mL，静置8 min；加10%AlCl3溶液0.4 mL，静置10 min；加4%NaOH溶液2 mL，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置10 min，在波长510 nm处测定其吸光度值，以芦丁质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线回归方程为y=0.011 1x+0.006 1，R2=0.999 5。
1.3.1.2 总多酚含量测定
参考文献[11]的方法并加以修改，配制不同质量浓度的没食子酸标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，于100 mL容量瓶中，吸取不同质量浓度的没食子酸标准溶液、水、样品液各1 mL于刻度试管内，加入福林酚5 mL、7.5%碳酸钠溶液4 mL，在波长765 nm处测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，以吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线回归方程为y=0.099 6x+0.019 2，R2=0.998 8。
1.3.2 不同陈酿时间禄丰香醋的体外抗氧化能力分析
1.3.2.1 ABTS阳离子自由基清除率测定
参照文献[12]的方法并加以修改，将ABTS（2.45mmol/L）与过硫酸钾（2.45 mmol/L）按1∶1（体积比）混合，并在25 ℃条件下暗处孵育16 h制备得到7 mmol/L ABTS阳离子自由基储备液。ABTS阳离子自由基储备液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）稀释，使734 nm处吸光度值达到0.70±0.02，制成ABTS阳离子自由基工作液。取150 μL ABTS阳离子自由基工作液，与50 μL待测样品溶液及50 μL超纯水混合，将该混合体系记为A组，另取150 μL PBS缓冲液与50 μL超纯水混合，作为空白对照组（A1），于波长734 nm条件下测定吸光度值。ABTS阳离子自由基清除率计算公式如下：
式中：A1为未加待测液时ABTS阳离子自由基溶液的吸光度值；A为加待样品测液时ABTS阳离子自由基溶液的吸光度值。
1.3.2.2 DPPH自由基清除率测定
参考文献[13]并加以修改，取待测液及等体积0.2 mmol DPPH溶液加入具塞试管中摇匀30 min后用无水乙醇作参比，在波长517 nm条件下测定其吸光度值A1，将0.2 mmol DPPH溶液与无水乙醇按等体积混合，测定其吸光度值（记为A2），将待测液与无水乙醇按等体积混合，测定其吸光度值（记为A3），DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：A1为加待测液时的吸光度值；A2为未加待测液时的吸光度值；A3为待测液在测定波长的吸光度值。
1.3.2.3 羟自由基清除率测定
参考文献[14]并加以修改，取9mmol/LFeSO4溶液1.5mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.5 mL和禄丰香醋稀释样品1.5 mL，混匀后，加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.5 mL，摇匀，在37 ℃条件下水浴10 min，以蒸馏水代替水杨酸-乙醇溶液为样品调零，后将待测溶液于510 nm波长处测定吸光度值A1。用蒸馏水作空白对照组，在510 nm波长处测定吸光度值A0。
式中：A0为采用蒸馏水时测定的吸光度值；A1为采用样品溶液测定的吸光度值。
1.3.3 不同陈酿时间禄丰香醋体内抗氧化活性分析
通过前述体外抗氧化活性效果筛选出一组体外抗氧化效果最好的醋来进行体内实验，建立小鼠急性酒精肝损伤模型来分析禄丰香醋的体内抗氧化活性。
1.3.3.1 小鼠分组与实验设计
在实验之前，所有昆明小鼠适应性饲养1周，期间自主取食饮水。1周后将小鼠随机分为5组（n=10/组），实验期间每日对各组小鼠进行灌胃，空白对照组和阳性对照组灌胃蒸馏水，禄丰香醋干预组灌胃未经稀释的禄丰香醋。实验期间所有动物均给予相应的饮食和水，每周记录体质量。根据参考文献[15]可知，每人每日推荐食用醋量为20 g，最多不超过100 g，我国男女总平均体质量为60 kg，以20 g为基础换算为成人每日摄入食用醋量为0.33 g/kg。根据《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则》的要求[16]，将人体推荐量的10倍设为低剂量组，中剂量组为人体推荐摄入量的15倍，高剂量为20倍，因此不同的香醋干预组灌胃剂量标准分别为：低剂量组3.30 g/kg、中剂量组4.95 g/kg、高剂量组6.60 g/kg，实验期间灌胃剂量以当周体质量为基础，结合实验组别设计灌胃剂量标准进行调整，实验分组如表1所示。
表1 动物实验分组
Table 1 Experimental groups of animals
在第37天灌胃处理2h后，除空白对照组小鼠给予12mL/kg蒸馏水外，其余各组均按12 mL/kg的剂量灌胃体积分数50%乙醇以构建急性酒精性肝损伤模型[17]。随后，所有小鼠禁食禁水12 h，最终通过摘眼球取血并脱颈处死的方式完成样本采集。采用试剂盒测定脂质氧化产物、还原性谷胱甘肽的含量，与空白对照组相比，脂质氧化产物显著升高、抗氧化酶活力显著降低以及还原性谷胱甘肽显著降低则说明模型构建成功[18]。
1.3.3.2 小鼠血清和肝组织预处理及病理组织分析
小鼠血收集后，5 000 r/min离心15 min，取上层，离心2次后将血清放于4 ℃保存。小鼠解剖后取肝脏，实验小鼠处死后，立即取适量肝组织置于组织固定液中，4 ℃保存并送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行HE染色检测。剩余肝脏组织迅速转移至-80 ℃超低温冰箱保存，待后续相关指标测定时取出使用。
1.3.3.3 小鼠肝组织抗氧化系统及生理与病理指标分析
肝组织处理方式[19]：按料液比1∶9（g/mL）加入4 ℃生理盐水（0.9%），机械匀浆3 min，后将10%匀浆液置于低温离心机中以2 500 r/min离心10 min，取上清液进行测定。参考文献[20]并加以修改，抗氧化体系采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白定量法检测小鼠肝组织匀浆液的蛋白含量，随后采用试剂盒检测肝组织中CAT、SOD、GPx和丙二醛（MDA）的含量。生理病理指标根据试剂盒相应说明书中的操作分别检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量。
1.3.4 数据处理
数据采用SPSS Statistics 21软件进行统计分析，其中P＜0.05时表示差异显著，P＞0.05时表示差异不显著；试验数据均以“平均值±标准差”表示，相关图形绘制采用Origin 2021软件。
2 结果与分析
2.1 不同陈酿时间禄丰香醋总黄酮及总多酚含量分析
多酚类化合物是含多个酚羟基的芳香族化合物总称，主要包括黄酮类及酚酸类化合物[21]。不同陈酿时间禄丰香醋中总多酚及总黄酮含量的测定结果见表2。由表2可知，陈酿3～6年禄丰香醋的总黄酮与总多酚含量与陈酿时间呈显著正相关（P＜0.05），其中陈酿6年样品的总黄酮[（0.22±0.01）g/100 mL]和总多酚[（0.40±0.02）g/100 mL]含量最高，较陈酿3年样品的总黄酮[（0.02±0.01）g/100 mL]和总多酚[（0.26±0.02）g/100 mL]分别高出11倍和53.8%。同时，陈酿6年的香醋在总黄酮和总多酚含量上也显著高于陈酿4年香醋，且总黄酮含量显著高于5年样品（P＜0.05）。梁楷等[19]研究发现随着陈酿时间的延长，食醋中的总黄酮和总多酚含量呈现上升趋势，山西老陈醋在陈酿10年时，总黄酮含量达到显著水平，远高于陈酿初期，这一发现与本研究结果基本一致。这一变化趋势可能是由于陈酿过程中水分含量逐渐减少进而促进单体类黄酮的缩聚反应，造成聚合酚类化合物和抗氧化活性增加[23]。此外，孙晓琪等[24]的研究也发现陈酿过程中功能物质均呈增长趋势，在陈酿10年醋中最高，总酚、总黄酮含量分别达到298.62 mg/100 mL、503.62 mg/100 mL。这可能是由于醋醅中的水分逐渐蒸发，使得酚类物质的浓度相对增加，同时黄酮配糖体在水解作用下释放更多的黄酮类化合物[25]。
表2 不同陈酿时间禄丰香醋中总多酚及总黄酮的含量分析结果
Table 2 Analysis results of total polyphenols and total flavonoids content in Lufeng aromatic vinegar with different aging time
注：同指标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下同。
2.2 不同陈酿时间禄丰香醋体外抗氧化活性分析
禄丰香醋体外抗氧化活性测定结果见图1。由图1可知，随着陈酿时间的延长，禄丰香醋的抗氧化性呈现显著增加趋势。DPPH自由基清除率排序为：陈酿时间6年[（64.8±0.8）%]＞5年[（63.9±0.3）%]＞4年[（63.8±0.3）%]＞3年[（56.9±0.3）%]，其中3年样品DPPH自由基清除率显著低于其他年份（P＜0.05），陈酿6年样品清除率较陈酿3年提升7%。ABTS自由基清除率变化较为显著，3年样品为（20±0.01）%，而6年升至（75±0.01）%（增幅达55%），同时组间差异显著（P＜0.05）。这种清除能力增强可能与贮藏过程中黄酮、多酚等抗氧化物质的积累相关[26]。研究表明，食醋中多酚及黄酮类物质的含量与组成随贮藏时间动态变化，并对其抗氧化活性具有重要影响[27]，如苏静[28]发现山西老陈醋陈酿时间与总黄酮和多酚含量呈正相关，且抗氧化能力与生产过程中总酚含量、总黄酮含量均具有较高的正相关性。此外，本研究中的抗氧化活性结果与黄酮多酚含量结果相互印证，即总黄酮、总多酚含量最高的6年禄丰香醋样品具有最佳的DPPH和ABTS自由基清除率。
图1 禄丰香醋的体外抗氧化活性
Fig.1 In vitro antioxidant activity of Lufeng aromatic vinegar
羟自由基清除率随陈酿时间延长呈显著上升趋势（P＜0.05），表明长期贮藏可能促进金属离子螯合类活性成分（如原儿茶酸、表儿茶素）的积累[29]，这与夏婷等[26]研究发现山西老陈醋中多酚类物质（包括原儿茶酸）随着陈化时间的延长而增多，且其与金属离子螯合后抗氧化活性显著提升的结果一致。
综上所述，陈酿6年的陈醋抗氧化性最佳，基于该结果，本研究选用陈酿6年的陈醋样品进行后续动物实验，以探究其对急性酒精性肝损伤的抗氧化保护作用和修复效果。
2.3 禄丰香醋的总黄酮和总多酚含量与抗氧化活性关联性 分析
禄丰香醋的总多酚和总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析结果见图2。由图2可知，总黄酮及总多酚含量与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除率等抗氧化指标均呈正相关，其中总黄酮含量与ABTS阳离子自由基清除率显著正相关（P＜0.05），总多酚与DPPH清除率及ABTS清除率分别呈显著（P＜0.05）和极显著正相关（P＜0.01）。黄酮类化合物通过直接清除自由基、抑制氧化酶产生自由基以及螯合催化自由基生成的金属离子等方式，发挥其抗氧化作用[30]。高欣月等[31]研究发现黄酮含量与ABTS阳离子自由基清除率的相关性系数为0.940，这与本研究结果基本一致，即总黄酮含量与ABTS阳离子自由基清除率具有正相关关系。多酚在与自由基反应时可以提供氢原子，氢原子的电子与自由基所带的电子组成一对，然后与自由基反应生成稳定物质，因此多酚可以作为抗氧化剂将体内的自由基还原为稳定的物质[32]。崔梦情等[33]的研究也发现赤霞珠葡萄皮渣中葡萄籽提取物中总酚含量与DPPH自由基清除能力和ABTS阳离子自由基清除能力呈显著正相关（P＜0.05），均与本研究结果基本一致。因此，陈酿时间6年的禄丰香醋因其总多酚和总黄酮含量最高而具有较强的抗氧化能力。
图2 禄丰香醋的抗氧化成分与抗氧化活性相关性
Fig.2 Correlation between antioxidant components and antioxidant activity of Lufeng aromatic vinegar
“*”表示显著相关（P＜0.05），“**”表示极显著相关（P＜0.01）。
2.4 禄丰香醋的体内抗氧化活性及急性酒精性肝损伤的修复效果分析
2.4.1 禄丰香醋的体内抗氧化活性分析
基于乙醇诱导的小鼠急性酒精性肝损伤模型，禄丰香醋的体内抗氧化活性研究结果见图3。由图3可知，空白组（B组）与模型组（P组）对比显示，酒精暴露显著升高血清丙二醛（MDA）水平（P＜0.05），同时抑制关键抗氧化酶活性——过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性均显著降低（P＜0.05），证实急性肝损伤模型构建成功[8]。禄丰香醋干预后，各剂量组（M-L、M-M、M-H）显著逆转酒精诱导的氧化损伤：与模型组相比，各剂量组的MDA含量显著降低（P＜0.05）；低、中剂量组SOD活性显著升高（P＜0.05）；此外，低、中、高剂量组GPx活性均提升（P＜0.05），其中中剂量组（M-M）在SOD和GPx活性恢复中表现最优。SOD作为抗氧化酶，能够清除体内的超氧阴离子自由基，防止细胞损伤，GPx则通过催化还原性反应，保护细胞结构免受氧化损伤[34，35]。何晓磊等[36]研究发现在高剂量（10.0 mL/kg）的条件下，石榴红曲保健果醋能明显降低D-半乳糖氧化损伤小鼠血清的MDA含量，升高CAT、SOD和GPx的活性。因此，禄丰香醋干预后可明显提升小鼠的体内抗氧化活性能力，具有显著的体内抗氧化效果。
图3 禄丰香醋的体内抗氧化活性
Fig.3 In vivo antioxidant activity of Lufeng aromatic vinegar
乙醇诱导的酒精性肝损伤模型组（P组）小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活性较空白对照组（B组）显著升高（P＜0.05），证实酒精暴露引发肝功能损伤。禄丰香醋干预后，各剂量组（M-L、M-M、M-H）血清ALT、AST活性均显著降低（P＜0.05），其中，中剂量组（M-M）调控效果最显著。该结果与体内抗氧化指标（SOD、GPx活性恢复，MDA降低）具有一致性。综上，禄丰香醋可显著逆转乙醇诱导的小鼠血清AST、ALT活性异常，证实其对酒精性肝损伤具有修复作用，其中中剂量组（M-M）效果最佳。
2.4.2 禄丰香醋对急性酒精性肝损伤修复效果
通过HE染色可进一步评估禄丰香醋对急性酒精性肝损伤的修复作用，肝脏组织学特征见图4。由图4可知，空白对照组（B组）肝小叶呈典型多边形结构，中央静脉周围肝细胞放射状有序排列，肝窦间隙清晰，未见明显病理改变。阳性对照组（P组）肝组织结构紊乱，肝细胞空泡化显著，呈现典型酒精性肝损伤病理特征。禄丰香醋干预后：低剂量组（M-L）肝细胞排列紊乱程度减轻，但仍有局部空泡残留；中剂量组（M-M）肝细胞排列有序性显著恢复，空泡面积减少；高剂量组（M-H）肝组织形态接近正常组，坏死区域基本消失。高剂量组虽然在组织学层面恢复最优，但前期生化指标显示中剂量组（M-M）对血清ALT/AST活性调节更显著。这种差异可能源于HE染色通过形态学评估肝细胞和纤维化，而ALT/AST通过代谢活性反映肝功能[37-38]。此外，HE染色对局部病理变化敏感，而ALT/AST易受全身代谢因素干扰[39]。综上，通过HE染色分析进一步证实禄丰香醋对酒精性肝损伤具有显著的修复作用。
图4 乙醇诱导小鼠肝损伤HE染色结果（200×）
Fig.4 HE staining results of liver damage in ethanol-induced rats(200×)
3 结论
本研究系统评估了云南禄丰香醋的抗氧化活性及其对急性酒精性肝损伤的修复效果。结果表明，陈酿6年的禄丰香醋其总黄酮（0.22 g/100 mL）和总多酚（0.40 g/100 mL）含量最高，且对ABTS阳离子自由基和DPPH自由基清除能力[（75±0.01）%和（64.8±0.8）%]显著高于其余陈酿时间（P＜0.05）。此外，黄酮及多酚含量与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基等抗氧化指标均呈显著正相关（P＜0.05）。在肝损伤模型中，香醋禄丰香醋干预后显著降低血清MDA水平和AST、ALT活性，并提高CAT、SOD及GPx活性，HE染色进一步证实其对急性酒精肝损伤具有修复作用。该研究表明6年的云南禄丰香醋具有较高含量的黄酮和多酚类物质，具备显著的抗氧化活性和急性酒精性肝损伤修复效果，为开发云南禄丰香醋作为功能性食品的原辅料提供了科学依据。
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