随着全球人口持续增长,预计到2050年将达到100亿[1],而肉类消费需求的增长将显著增加。据预测,到2030年,全球肉类消费需求将增长72%[2]。含量较高的动物性饮食会加剧动物养殖所需的温室气体排放和森林砍伐,从而会对环境造成危害[3]。与动物蛋白生产相比,植物蛋白的生产过程对土地、水等自然资源的需求大幅减少,近年来转向植物性食品的生产[4]。据预测,植物蛋白市场规模将超过122亿美元,2027年年增长率将达到7.3%[5]。随着居民健康与环保意识同步提升,兼具高营养价值、良好加工性能和低碳排放优势的植物蛋白,正逐步转变为食品创新的主角[6],为食品工业实现可持续发展提供新的解决方案。
近年来,植物蛋白在食品工业中的应用逐渐受到关注,在食品加工领域展现出广阔的应用潜力[7]。然而,植物蛋白在实际应用中常存在一些问题,其中最为突出的是不良的感官特性,一方面可以通过味觉感知,如异黄酮、呋喃、酚类化合物和皂苷等成分引起的苦涩味和金属味[8]。另一方面可以通过嗅觉感知,如豆腥味[9],其风味种类较多,在风味描述中表现为青草味、生豆味、涩味等,其味道主要是由各种小分子挥发性物质按不同配比组合形成的[10]。植物蛋白中挥发性不良风味物质主要通过自动氧化、光敏氧化、脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)诱导的酶促反应以及蛋白质降解等途径形成[11]。在这些途径中,LOX诱导的酶促反应是产生不良风味的主要原因[12]。豆腥味的存在不仅影响植物蛋白的风味品质、掩盖其他风味物质,还会在植物蛋白产品的应用中受到限制,阻碍产品的市场推广和拓展[13]。
常见的豆腥味改良方法有风味掩蔽法、抑制脂氧合酶活性法和微生物发酵法[14-16]。微生物发酵已被证实为一种高效方法,可以通过微生物代谢产生的酶分解豆腥味物质,或生成新的芳香物质来掩盖豆腥味[16]。生香酵母是一类能够代谢产生芳香化合物的微生物,在生长过程中可合成具有花香、清香或果香等特征的风味物质,这类酵母目前已被广泛用于豆乳、豆粕、腐乳等发酵食品的生产中,增强风味。近年来,已有不少研究报道了生香酵母在植物蛋白发酵中的应用。如徐文等[17]在发酵大豆组织蛋白时,生香酵母可以将豆腥味物质的含量降低70%;VONG W等[18]采用根霉菌(Rhizopus)和酵母协同发酵豆渣,显著提升了其良好风味物质含量;冯静文[19]的研究表明,生香酵母发酵豆乳能完全消除豆腥味物质,同时促进酯类等芳香化合物的生成;唐巧[20]研究发现,生香酵母发酵大豆粉,不仅完全去除了豆腥味物质,还显著增加了酯类等芳香物质的含量。然而由于大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦蛋白和花生蛋白的结构和组成不同,会导致生香酵母对其改良效果存在差异[21]。
本研究采用筛选自酵子的生香酵母13-1对4种植物蛋白(大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦蛋白、花生蛋白)进行发酵,通过香气评价结合顶空固相微萃取(head-space solid phase microextraction,HS-SPME)-气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用分析发酵前后挥发性风味物质的变化,深入分析生香酵母对4种植物蛋白风味的改良效果,并以整体接受度评分为响应值,通过单因素及响应面法优化生香酵母发酵大豆蛋白的条件,有助于提升植物蛋白产品的市场竞争力,促进食品工业的可持续发展。
1.1.1 菌株与材料
生香酵母13-1:分离自酵子,保藏于本实验室[22];植物蛋白(大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦蛋白和花生蛋白):市售。
1.1.2 试剂
葡萄糖(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;2-甲基-3-庚酮(色谱纯):美国Sigma-Aldrich公司;正己烷(色谱纯):德国Meker公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptoneglucose,YPD)固体培养基[22]:蛋白胨10.0 g、酵母浸出粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂14.0 g、蒸馏水1 000 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。YPD液体培养基:YPD固体培养基中不添加琼脂。
大豆蛋白培养基:大豆蛋白15%、葡萄糖2%,105 ℃高压蒸汽灭菌10 min。同理配制豌豆蛋白、小麦蛋白和花生蛋白培养基。
AC2-4S1超净工作台:新加坡艺思高科技有限公司;固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)纤维萃取头(DCB/CAR/PDMS):美国Supelco公司;TRACE1310气相色谱-TSQ8000质谱仪、TG-Wax MS极性毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm):美国赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3.1 菌种活化
在无菌条件下,取保存在甘油中的生香酵母13-1涂布于YPD固体培养基,28 ℃条件下静置培养24 h。选择生长状态较好的单菌落接种于YPD液体培养基中,28 ℃、120 r/min条件下活化培养24 h,连续活化2~3次,备用。
1.3.2 植物蛋白的液体发酵
将活化好的生香酵母13-1按2%(V/V)接种量分别接种到大豆蛋白、豌豆蛋白、花生蛋白、小麦蛋白培养基中,同时将未接种的植物蛋白培养基作为对照,于28 ℃、120 r/min条件下培养24 h。
1.3.3 大豆蛋白发酵条件优化
1.3.3.1 单因素试验
在方法1.3.2的基础上,以整体接受度评分为主要评价指标,选择葡萄糖添加量(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、大豆蛋白添加量(10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%)、接种量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、发酵时间(8 h、16 h、24 h、32 h、40 h)作为影响因素,考察各单因素对大豆蛋白香气评分的影响。
1.3.3.2 响应面试验
在单因素试验的基础上,以葡萄糖添加量(A)、大豆蛋白添加量(B)、接种量(C)和发酵时间(D)作为自变量,以整体接受度评分(Y)为响应值,采用Design-expert 13软件设计Box-Behnken响应面试验,试验因素与水平见表1。
表1 大豆蛋白发酵条件优化Box-Behnken响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design for soy protein fermentation conditions optimization
1.3.4 测定方法
1.3.4.1 香气评价
由20名年龄在24~40岁之间的专业感官评价员组成品评小组,采用直接嗅闻法对植物蛋白发酵物与对照进行香气特征评价。香气特征的描述词以文献[22]为基准,通过系统分析,最终确立了7个关键香气描述词:坚果味、青涩味、油脂味、花香味、甜香味、果香味和整体接受度。采用100分量表对各香气描述词进行量化评估(10分及以下表示风味强度最弱,100分表示最强),并对其进行评分,具体评分标准见表2。
表2 植物蛋白发酵物香气评分标准
Table 2 Aroma scoring standard of fermented plant protein hydrolysates
1.3.4.2 挥发性风味物质的测定
参考潘晓倩等[23]的HS-SPME-GC-MS法并稍作修改。HS-SPME条件:在20 mL顶空采样瓶中加入5 mL发酵液,1 μL 0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮(内标),混合均匀,50 ℃平衡10 min,将萃取纤维伸入顶部空间,50 ℃萃取40 min。萃取完成后,将萃取纤维头插入GC-MS的进样口进行解吸。
GC条件:TG-WaxMS极性毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.25 μm),不分流进样模式,载气为高纯氦气(He),流速1.0 mL/min,进样口温度250 ℃。升温程序为初始温度40 ℃保持3 min,以5 ℃/min速率升至200 ℃保持1 min,再以8 ℃/min的速率升温至220 ℃后保持3 min。
MS条件:电子电离(electron ionization,EI)源,电子能量70 eV,离子源温度280 ℃,接口温度260 ℃,传输线温度230 ℃,采用全扫描模式,质量扫描范围40~400 m/z,扫描时间为2 s。
定性定量方法:根据相对保留指数(retention index,RI)与美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)数据库进行对比,根据匹配度>800对挥发性风味物质进行定性;采用内标法进行定量。
1.3.5 数据处理
所有试验进行3次平行测定,采用SPSS 20.0软件对数据进行处理,结果以“平均值±标准差”表示,利用Origin 2021软件进行绘图。
2.1.1 生香酵母13-1发酵不同植物蛋白风味轮廓变化分析
通过对不同植物蛋白发酵物进行香气评价后,绘制风味雷达图,结果见图1。
图1 4种植物蛋白的风味轮廓图
Fig.1 Flavor profile mapping of four plant proteins
由图1可知,植物蛋白经发酵处理后其风味特征发生明显改变。未发酵的4种植物蛋白中均呈现突出的油脂味及明显的坚果与青涩味,整体接受度较低;而经生香酵母13-1发酵后,果香、甜香、酒香及花香味的强度均明显升高,呈现突出的果香味,整体接受度均升高。此外,发酵前后的豌豆蛋白、花生蛋白及小麦蛋白在各香气维度和整体接受度上得分差值较小,说明经发酵后,它们在风味方面改善幅度较小。反之,发酵前后的大豆蛋白在各香气维度和整体接受度上得分差值较大,说明经发酵后风味改善幅度较大,整体接受度由61.5分升至78.0分。结果表明,生香酵母13-1在一定程度上能够改善4种植物蛋白的风味,发酵后产物中不良特征削减明显,带来果香、酒香与甜香等良好风味特征,且对大豆蛋白风味改善效果最好,整体接受度最高。
2.1.2 生香酵母13-1发酵不同植物蛋白挥发性风味物质变化分析
采用HS-SPME-GC-MS对不同植物蛋白发酵前后的挥发性风味物质进行测定,结果见表3。由表3可知,从4种植物蛋白中共检测出49种挥发性风味物质,大豆蛋白、发酵大豆蛋白、豌豆蛋白、发酵豌豆蛋白、花生蛋白、发酵花生蛋白、小麦蛋白和发酵小麦蛋白中分别检测到20、17、20、23、16、24、24和15种挥发性风味物质,发酵后4种植物蛋白的醛类物质含量减少,而酯类物质含量增加,其中大豆蛋白变化较大,醛类物质含量由5.68 μg/kg降至未检出,酮类物质含量由19.17 μg/kg降至5.5 μg/kg,酯类物质含量由0.10 μg/kg升高至38.83 μg/kg。
表3 不同植物蛋白经生香酵母13-1发酵前后挥发性风味物质气相色谱-质谱测定结果
Table 3 Volatile flavor compounds in various plant proteins before and after fermentation with aroma-producing yeast strain 13-1 by GC-MS
续表
注:同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05),“—”表示未检出。
4种植物蛋白经生香酵母13-1发酵后醛类物质的含量普遍降低,醛类物质通常具有刺激性气味或不愉快的风味[13],主要来源于亚油酸、亚麻酸等多不饱和脂肪酸氧化以及蛋白质的Strecker降解反应,醛类阈值较低,对植物蛋白风味形成具有重要作用[24]。大豆蛋白发酵后醛类物质的含量从5.68 μg/kg降至未检出,花生蛋白发酵后醛类物质的含量从3.26 μg/kg降至0.16 μg/kg,豌豆蛋白发酵后醛类物质的含量从7.05 μg/kg降至3.68 μg/kg,小麦蛋白发酵后醛类物质含量从6.65 μg/kg降至1.09 μg/kg,其中大豆蛋白与小麦蛋白发酵前后醛类物质含量变化较大。结果表明,发酵有助于去除植物蛋白中的不良风味[25],其中对大豆蛋白和小麦蛋白改善效果更为明显。
除花生蛋白外,其他3种植物蛋白发酵后醇类物质的含量降低。醇类物质主要来源于微生物代谢、脂肪酸氧化降解、醛的还原反应[26]。大多数醇类物质具有果香、花香,还有一部分醇类物质具有不良风味。其中,正己醇是植物蛋白中脂肪氧化产生的,具有树脂、花香和绿色气味。大豆蛋白、豌豆蛋白、花生蛋白及小麦蛋白经发酵后,正己醇的含量分别从44.67μg/kg、52.80μg/kg、25.22μg/kg、10.39μg/kg降至3.92 μg/kg、10.07 μg/kg、19.38 μg/kg、2.85 μg/kg,其中大豆蛋白与豌豆蛋白中正己醇的含量变化较大。1-辛烯-3-醇具有蘑菇味,在植物蛋白生长、加工储藏的过程中由氧化反应及脂肪酸的降解生成[27]。4种植物蛋白经发酵后1-辛烯-3-醇的含量显著降低(P<0.05),其中大豆蛋白含量变化较大,从16.55 μg/kg降至0.89 μg/kg。除此之外,生香酵母在发酵过程中通过苯丙氨酸降解生成苯乙醇,该芳香化合物呈现出典型的玫瑰花香和蜂蜜甜香特征[28],其中花生蛋白与大豆蛋白发酵后生成的苯乙醇含量最高,分别为142.75 μg/kg、4.28 μg/kg。结果表明,发酵有助于去除植物蛋白中的不良风味,增加更丰富更愉悦的香气物质。
酯类物质是发酵植物蛋白香气的重要成分,常具有良好的香气,如水果香、花香等,可以为植物蛋白风味提供较大的贡献度[29]。4种植物蛋白经发酵后,酯类物质的种类及含量均有所增加,主要酯类物质为乙酸己酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯,具有水果和葡萄的香气,其中花生蛋白与大豆蛋白发酵后含量较高,分别为58.50 μg/kg、38.83 μg/kg。生香酵母的酯类代谢途径主要包括醇酰基转移酶途径、酯酶途径、醇脱氢酶途径[28],不同酯类的生成途径不尽相同,因此,发酵过程中生香酵母通过这些代谢途径生成了更多的酯类物质,从而增加了良好的香气物质。
酸类物质主要来源于脂质的氧化降解。除大豆蛋白外,其他3种植物蛋白发酵后酸类物质含量降低。但发酵后大豆蛋白的酸类物质含量普遍升高,生成了较多的乙酸,产生强烈的酸味[30],这在一定程度上加剧了植物蛋白的不良风味,因此需要优化发酵条件来防止产生令人不愉快的风味化合物。
酮类物质的形成途径主要包括脂肪的氧化降解、醇类物质的氧化、酯类化合物的降解[31]。大豆蛋白中主要酮类物质是甲基庚烯酮和2-壬酮,其具有胡椒、肥皂气味,是植物蛋白中的脂肪氧化产物[25],在生香酵母代谢调控下,这些不良风味都被代谢到较低水平甚至未检出,产生了具有奶油、黄油等良好风味的3-羟基-2-丁酮,而豌豆蛋白、花生蛋白和小麦蛋白发酵前主要的酮类物质为3-羟基-2-丁酮,其在发酵后含量下降,甚至在小麦蛋白中未检出,这说明在豌豆蛋白、花生蛋白和小麦蛋白发酵后会使原有产生积极效应的3-羟基-2-丁酮风味物质减少。其他风味物质中具有绿豆、黄油气味的2-正戊基呋喃,由亚油酸等不饱和脂肪酸通过氧化反应生成[32]。经过发酵后,大豆蛋白与小麦蛋白中2-正戊基呋喃的含量降低至未检出,而花生蛋白与豌豆蛋白中2-正戊基呋喃的含量增加。
综上,生香酵母13-1发酵能够显著降低植物蛋白的刺激性醛类、酮类及脂氧化异味,同时富集果香味、花香味酯类及玫瑰蜂蜜型醇类等愉悦香气,整体提升植物蛋白的风味品质与感官整体接受度,其中对大豆蛋白风味的改良效果更好。
2.2.1 葡萄糖添加量对发酵大豆蛋白香气评分的影响
葡萄糖作为关键碳源,可以促进生香酵母代谢生成风味物质的速率[33]。因此,考察葡萄糖添加量对发酵大豆蛋白香气评分的影响,结果见图2。由图2可知,随着葡萄糖添加量的增加,发酵大豆蛋白的青涩味与油脂味评分均呈先下降后升高的趋势,坚果味评分呈下降趋势,而甜香味及酒香味评分均呈升高趋势,果香味评分呈升高后趋于稳定的趋势,整体接受度呈先升高后下降的趋势。分析原因可能是,葡萄糖添加量过高时,发酵后酒味风味轮廓越来越明显及代谢产物酸类物质增加,对其整体接受度有不良影响,酒味过重及过酸条件下酵母生长受到抑制会造成大豆蛋白发酵物风味整体接受度变差。当葡萄糖添加量为2.5%时,整体接受度最高,为82.1分。因此,选择最佳葡萄糖添加量为2.5%。
图2 不同葡萄糖添加量对发酵大豆蛋白香气评分的影响
Fig.2 Effect of different glucose addition on the aroma score of fermented soy protein
2.2.2 大豆蛋白添加量对发酵大豆蛋白香气评分的影响
大豆蛋白主要含蛋白质,因提取工艺的影响会残留以多糖为主的碳水化合物等非蛋白成分[34],蛋白添加量的增加可以提高生物合成效率。因此,考察大豆蛋白添加量对发酵大豆蛋白香气评分的影响,结果见图3。由图3可知,随着大豆蛋白添加量的增加,发酵大豆蛋白的坚果味、青涩味与油脂味评分升高,酒香味、果香味、甜香味及花香味评分下降,整体接受度呈先升高后下降的趋势。当大豆蛋白添加量为12.5%时,大豆蛋白发酵物的整体接受度最高,为83.7分,因此,确定最佳大豆蛋白添加量为12.5%。
图3 不同大豆蛋白添加量对发酵大豆蛋白香气评分的影响
Fig.3 Effect of different soy protein addition on the aroma score of fermented soy protein
2.2.3 不同接种量对发酵大豆蛋白香气评分的影响
接种量对发酵大豆蛋白香气评分的影响见图4。由图4可知,随着接种量的增加,发酵大豆蛋白的坚果味、青涩味与油脂味评分下降,酒香味、果香味、甜香味及花香味评分升高,整体接受度呈先升高后下降的趋势。当接种量为2.5%时,整体接受度最高,为84.7分。分析原因可能是,接种量过低,营养物质丰富,但微生物活性不足,难以降解豆腥味物质;接种量过高时,微生物快速消耗营养物质,酒香味加重,对感官评分有不良影响。因此,确定最佳接种量为2.5%。
图4 不同接种量对发酵大豆蛋白香气评分的影响
Fig.4 Effect of different inoculum on the aroma score of fermented soy protein
2.2.4 不同发酵时间对发酵大豆蛋白香气评分的影响
酵母菌株对环境条件的适应性的差异会直接影响其代谢活性及发酵周期[35]。因此,考察发酵时间对发酵大豆蛋白香气评分的影响,结果见图5。由图5可知,随着发酵时间的延长,青涩味评分呈先下降后升高的趋势,油脂味及坚果味评分均呈下降的趋势,酒香味、果香味、甜香味及花香味评分均呈升高趋势,整体接受度呈先升高后下降的趋势。当发酵时间为32 h时,整体接受度最高,为84.9分。分析原因可能是,发酵时间过长,酒香味加重,对香气有不良影响。因此,确定最佳发酵时间为32 h。
图5 不同发酵时间对发酵大豆蛋白香气评分的影响
Fig.5 Effect of different fermentation time on the aroma score of fermented soy protein
2.2.5 大豆蛋白发酵条件优化响应面试验
基于单因素试验结果,选取葡萄糖添加量(A)、大豆蛋白添加量(B)、接种量(C)和发酵时间(D)为考察因素,以整体接受度评分(Y)为响应值,通过Design-expert 13软件设计4因素3水平的Box-Behnken响应面试验,试验结果与分析见表4,方差分析结果见表5。
表4 大豆蛋白发酵工艺优化Box-Behnken响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken response surface experiments for soy protein fermentation conditions optimization
表5 回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance for the regression model
续表
注:“**”表示对结果影响极显著(P<0.01)。
采用Design-expert 13软件对表4数据进行多元二次回归拟合分析,得到多元二次回归方程:
由表5可知,模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P=0.525 1>0.05),说明该模型拟合度较好,试验结果具有良好的准确度与可靠性。模型的决定系数R2为0.987 1,说明98.71%结果可用该回归模型解释。由回归模型的F值可知,各因素对整体接受度评分的影响大小为大豆蛋白添加量>葡萄糖添加量>发酵时间>接种量。根据P值可知,一次项A、B、C、D以及交互项AB、BD和二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著(P<0.01),其他项则对结果无显著影响(P>0.05)。
交互项AB、BD对发酵大豆蛋白整体接受度评分影响的响应面及等高线见图6。由图6可知,AB和BD对发酵大豆蛋白整体接受度评分影响的等高线呈椭圆形分布,且响应面为凸面,坡度趋势陡峭,有最大值,说明对结果影响较大,这与方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对发酵大豆蛋白整体接受度评分影响的响应曲面和等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the overall acceptance score of fermented soy protein
采用Design-expert 13软件对多元二次回归方程进行最优求解,得到大豆蛋白的最佳发酵工艺条件为发酵时间31.30 h、葡萄糖添加量2.74%、接种量2.42%、大豆蛋白添加量13.48%,在此条件下整体接受度评分预测值为85.68分。为便于实际操作,将最优发酵条件修正为发酵时间31 h、葡萄糖添加量2.7%,接种量2.4%,大豆蛋白添加量13.5%,在此发酵条件下进行3次验证性试验,得到发酵大豆蛋白的平均整体接受度评分为86.62分,与预测值接近,说明模型可靠、工艺可行,优化发酵条件对于提高大豆蛋白发酵品质具有重要意义。
本研究通过香气评价结合HS-SPME-GC-MS系统评价了生香酵母13-1对大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦蛋白和花生蛋白的风味改良潜力,结果发现,生香酵母13-1发酵可明显削弱4种植物蛋白的青涩味、油脂味与坚果味等不良风味特征,同步提升果香、甜香、酒香味及整体接受度,其中大豆蛋白的风味改善幅度最大,整体接受度评分由61.5分增至78.0分。同时,通过GC-MS分析证实,发酵后4种植物蛋白的醛类物质含量明显降低,酯类等愉悦香气物质大幅增加,其中大豆蛋白中挥发性风味物质改良效果最好,醛类物质含量由5.68 μg/kg降至未检出,酮类物质含量由19.17 μg/kg降至5.50 μg/kg,酯类物质含量由0.10 μg/kg升至38.83 μg/kg。进一步以整体接受度评分为响应值,通过单因素试验及响应面法优化得到大豆蛋白的最佳发酵工艺条件为:发酵时间31 h、葡萄糖添加量2.7%,接种量2.4%,大豆蛋白添加量13.5%。在此条件下,大豆蛋白发酵物的整体评分最高,达到86.62分。综上,生香酵母13-1发酵不仅能够高效去除植物蛋白的豆腥味等不良风味,还可定向富集果香、花香等愉悦香气,为高品质植物基食品的开发提供了切实可行的技术路径,优化后的大豆蛋白发酵工艺可直接服务于工业化生产,对提升植物蛋白市场竞争力和推动食品工业绿色转型具有重要意义。
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