花粉是植物雄性配子体，位于雄性花粉囊内，为植物最精华之所在，具有低脂肪、高蛋白的特点[1]。 花粉分为松花粉和蜂花粉两种，含有蛋白质、糖类、脂类、维生素等多种生物活性物质，具有抗氧化、清除自由基和提高免疫力等功效[2-4]。 花瓣粉含有花瓣多糖[5]、黄酮[6]等活性成分，具有美容养颜、改善肝脏损伤[7]等作用。 然而，花粉粒通常具有较厚的壁，且附带杂质，直接进行食品生产无法达到最优的营养效率预期[8]。目前研究人员已逐步开发出多种花粉和花瓣粉深加工方法，其中微生物发酵产品受到消费者的广泛喜爱，发酵过程中花粉营养成分被充分释放，并且产品富含保健因子，具有良好的应用前景[9-10]。
不同花粉的营养成分存在巨大差异，例如松花粉的不饱和脂肪酸以及膳食纤维含量更加丰富，而蜂花粉则含有更多的蛋白质、碳水化合物以及黄酮等活性物质。相比于单一花粉发酵，复合花粉发酵更加具有研究潜力。复合花粉发酵可以形成更全面的营养谱系，避免单一花粉的营养局限[11-12]。此外，复合花粉作为基底也可以提高微生物对环境的适应性，更有利于充分发酵。在选择花粉时，需要考虑花粉的资源可获得性、成本、活性成分以及相关食用历史等。向日葵花粉、松花粉价格适中，可以持续稳定供应[13-14]，而玫瑰花瓣粉、牡丹花瓣粉以及樱花花瓣粉富含多糖、黄酮等抗氧化物质[15-17]，并被证实具有一定的抗氧化、抗衰老作用，具有良好的功能特性。因此，选择松花粉、向日葵花粉、玫瑰花瓣粉、牡丹花瓣粉、樱花花瓣粉五种花粉作为复合花粉，配以营养物质丰富的枸杞粉进行发酵。
杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名“干贝菇”、“平菇王”，是一种中大型可食用真菌。杏鲍菇肉质肥厚，口感脆嫩，味道鲜美，不仅富含蛋白质、膳食纤维、维生素、矿物质等基本营养素[18]，还含有丰富的寡糖、多糖、黄酮、多酚等天然活性物质，具有抗癌[19]、抗氧化[20]、降血糖、降血脂[21]、增强免疫力[22]等多种生物功效。 杏鲍菇分解纤维素、木质素能力较强，对各种农副产品下脚料中的碳源和氮源都能吸收利用，适宜与蜂花粉发酵改善蜂花粉破壁难问题，利于营养物质的释放与吸收[23-24]。 蜂蜜含有大量营养物质与活性成分，具有抗氧化和补充能量等多种作用[25]，口感清甜，具有花香气味。目前使用蜂蜜、复合花粉、杏鲍菇等原料进行共发酵的研究尚鲜见报道。因此，本研究采用蜂蜜培养基，使用杏鲍菇对松花粉、向日葵花粉、枸杞粉、玫瑰花瓣粉、丹凤牡丹花瓣粉和关山樱花花瓣粉组成的复合花粉进行液态发酵，通过单因素及正交试验对其发酵工艺条件进行优化，并通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和超高液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技术分析发酵液中多糖单糖组成及酚酸成分，探究复合花粉杏鲍菇液体发酵工艺优化条件，并对发酵液中营养活性成分进行测定，旨在考察杏鲍菇液体发酵复合花粉发酵液的抗氧化活性，进一步拓展花粉在食品领域中的应用，为花粉发酵新产品的开发提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
杏鲍菇（Pleurotus eryngii）菌种CGMCC 5.1010：中国微生物菌种保藏管理中心；松花粉、向日葵花粉、枸杞粉、玫瑰花瓣粉、丹凤牡丹花瓣粉、关山樱花花瓣粉：国珍健康科技（北京）有限公司；洋槐蜂蜜：北京百花蜂产品有限公司。
1.1.2 试剂
BC1315—100T/96S总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、柠檬酸、碳酸钠（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖标准品（纯度均＞98%）、羟基苯甲酸、芦丁、水杨酸、槲皮素、木樨草素、山奈酚酸、芹菜酸标准品（纯度均＞98%）：美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、PDA液体培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
蜂蜜发酵培养基：洋槐蜜50 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
ME204型电子天平、FiveEasy Plus型pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；LS-35HD型压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；Dl-CJ-1ND-Ⅱ型超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；HZQ-F160型恒温振荡器：太仓市豪成实验仪器制造有限公司；MH2100RA型离心机：美瑞克仪器（上海）有限公司；T6新世纪型紫外可见分光光度计：北京普析通用有限责任公司；LC-20AD型高效液相色谱（HPLC）仪：日本岛津公司；ACQUITY TQD型超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）仪：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 种子液培养
从斜面试管培养基中取直径约0.05 cm的杏鲍菇菌块接种于PDA平板中央，25 ℃培养至菌丝铺满平板。 从平板取6片直径为1 cm菌块接种到200 mL PDA液体培养基中，25 ℃、140 r/min条件下摇瓶培养7 d，得到杏鲍菇种子液。
1.3.2 复合花粉杏鲍菇发酵液的制备
向蒸馏水中添加50 g/L的洋槐蜜、3 g/L KH2PO4、1.5 g/L MgSO4·7H2O并混合均匀，制成蜂蜜发酵培养基。 无菌操作下吸取20 mL的杏鲍菇种子培养液，添加至200 mL蜂蜜发酵培养基中，添加4.00%的复合花粉（松花粉25%+向日葵花粉25%+枸杞粉15%+玫瑰花瓣粉15%+丹凤牡丹花瓣粉15%+关山樱花花瓣粉5%），25 ℃、140 r/min摇瓶培养7 d，于10 000 r/min条件下离心15 min得上清液即为复合花粉杏鲍菇发酵液。
1.3.3 总多糖、总黄酮含量、铁离子还原/抗氧化能力值测定及综合得分指数计算
总多糖含量：采用苯酚硫酸法[26]测定；总黄酮含量：采用比色法[27]进行测定；铁离子还原/抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）值：采用总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒进行测定。
Topsis法又称优劣解距离法，是一种基于多指标分析的综合评价法，能够很好地考察每种发酵条件对复合花粉杏鲍菇发酵液综合品质的影响，结果更加客观、准确[28]。基于花粉多糖含量、总黄酮含量和FRAP值，进行Topsis法（优劣解距离法）综合分析，根据计算得出的综合得分指数（composite score index，CI）[29]。
1.3.4 复合花粉杏鲍菇液体发酵工艺优化
（1）单因素试验
复合花粉添加量的确定：按复合花粉配比，设置复合花粉添加量分别为0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%，初始pH自然、25 ℃、140 r/min条件下振荡培养7 d。每组进行3次重复，考察复合花粉添加量对发酵液总多糖、总黄酮、FRAP值及CI的影响。
初始pH值的确定：用食用柠檬酸或食用纯碱将蜂蜜发酵培养基初始pH值调整为4、5、6、7、8，复合花粉添加量4.00%、25 ℃、140 r/min条件下振荡培养7 d。每组进行3次重复，考察初始pH 值对发酵液总多糖、总黄酮、FRAP值及CI的影响。
发酵时间的确定：设置发酵时间为3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，复合花粉添加量4%，初始pH自然，在25 ℃、140 r/min条件下振荡培养。每组进行3次重复，考察发酵时间对发酵液总多糖、总黄酮、FRAP值及CI的影响。
（2）正交试验
根据单因素试验结果，以CI为评价指标，以复合花粉添加量（A）、初始pH值（B）和发酵时间（C）为影响因素，按照L9（33）正交试验设计进行3因素3水平正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization
水平A 复合花粉添加量/%B 初始pH值C 发酵时间/d 123 2.00 3.00 4.00 567 456
1.3.5 多糖的单糖组成分析
多糖又称聚糖，是由不少于10个单糖分子通过脱水缩合形成的糖苷键连接而形成的聚合高分子碳水化合物，在人体中发挥着至关重要的作用，例如为机体供能、免疫调节、抗菌抗病毒、控制血糖血脂等[30]。多糖中最主要的成分是D-葡萄糖，还包括有其他单糖、单糖酸、氨基糖等。使用高效液相色谱（HPLC）法[31]分析发酵液中多糖的单糖组成。精密称取适量单糖对照品，加水溶解稀释至50 μg/mL，再配制成系列标准品溶液。
样品前处理：取0.5 mL发酵液样品于10 mL安瓿瓶中，向瓶中加入3.0 mL 2 mol/L三氟乙酸，充氮，封管，120 ℃酸解4 h。取出加入甲醇氮吹挥干后，加1.0 mL水复溶，待测。
衍生：精确吸取250μL混合对照溶液或样品溶液到5mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）-甲醇，70 ℃反应1 h后于冷水中冷却10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿漩涡1 min，3 000 r/min离心10 min，取上清萃取3次，用于HPLC检测。
HPLC条件：使用Xtimate C18色谱柱（4.6 mm×200 mm×5 μm），柱温30 ℃，进样量20 μL，流速1.0 mL/min，流动相选择0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 6.70）与乙腈的混合体系（83∶17，V/V），在波长250 nm条件下进行测定。
定性定量方法：采用标准品保留时间定性，外标法定量。
1.3.6 酚酸成分分析
酚酸是一类含有酚环的有机酸，广泛存在于植物界中，具有抗炎、抗氧化、预防心脑血管疾病等功能[32]。使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法[31]分析发酵液中酚酸组成。 精密称取适量酚酸对照品，加甲醇溶解稀释至500 μg/L，再配制成系列标准品溶液。
样品前处理：称取适量样品，加入5 mL 70%甲醇溶液，置于棕色玻璃管中，70 ℃水浴中振荡提取30 min，自然冷却至室温后转移至离心管中，5 000 r/min离心5 min，转移上清液至10 mL容量瓶中。向残渣中再加入5 mL体积分数为70%甲醇溶液提取1次，重复以上操作，合并提取液，定容至10.00 mL，0.45 μm滤膜过滤，待用。
UPLC条件：流动相A相为乙腈，B相为含0.05%甲酸水溶液。 梯度洗脱程序为0～0.5 min，10%A；0.5～5.0 min，10%～30%A；5.0～9.5 min，30%～90%A；9.5～11.0 min，90%A；11.0～11.5 min，90%～10%A；11.5～14.0 min，10%A。进样量为5 μL，流速为0.3 mL/min，柱温30 ℃，自动进样器温度为20 ℃。
MS/MS条件：电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源，采用负离子和正离子多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，毛细管电压2.90 kV（负离子）、3.10 kV（正离子）；离子源温度120 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；脱溶剂气（N2）流速600 L/h；碰撞气（Ar）流速0.07 mL/min；锥孔气（N2）流速50 L/h。 酚酸组分标准品的质谱参数条件见表2。
表2 酚酸成分检测的质谱参数条件
Table 2 Mass spectrum parameters for phenolic acid components determination
注：“*”表示该离子用于定量。
酚酸离子模式母离子（m/z）子离子（m/z）锥孔电压/V碰撞能量/eV对香豆酸没食子酸对羟基苯甲酸芦丁绿原酸原儿茶酸芥子酸肉桂酸阿魏酸槲皮素香草酸水杨酸丁香酸儿茶素表儿茶素木樨草素芹菜酸山奈酚酸11，21 15，22 10，24 33，52 17，43 11，21 13，15 12，21 15，11 19，17 13，16 12，22 15，19 26，33 26，32 46，29 27，49 34，32，45负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子负离子正离子正离子正离子163.0 169.0 137.2 609.0 353.2 153.1 222.9 147.0 193.0 301.0 167.0 137.2 196.85 289.0 289.0 287.0 271.0 287.0 119*，93 125*，79 93*，65 300*，271 191*，85 109*，91 208*，164 103*，77 134*，178 151*，179 152*，108 93*，65 182*，167 109*，123 109*，123 89*，153 153*，91 121*，153，69 22 16 4 56 28 23 20 18 24 44 24 16 25 41 40 53 45 55
定性定量方法：采用标准品保留时间定性，外标法定量。
1.3.7 数据分析
每组试验设3个重复，结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 18.0统计软件进行显著性差异分析，Origin Pro 2021对数据进行绘图分析，色谱数据利用Chromeleon软件7.2.10处理。
2 结果与分析
2.1 复合花粉杏鲍菇液体发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 复合花粉添加量对发酵液总多糖、总黄酮、FRAP值及CI的影响
不同复合花粉添加量对发酵液各项指标的影响结果见表3。由表3可知，随着复合花粉添加量在0.25%～4.00%范围内的增加，发酵液中总多糖含量、总黄酮含量、FRAP值及CI均呈上升趋势。这可能是由于随着复合花粉添加量的增加，发酵的底物更多，杏鲍菇能够利用更多花粉进行破壁及发酵，从而增加发酵液中多糖、黄酮以及其他活性物质的含量。董玉玮等[33]使用杏鲍菇对沛县黄皮牛蒡进行液体发酵，探究黄皮牛蒡含量对发酵液中多糖含量影响，发现随着牛蒡含量的不断增加，发酵液中多糖含量呈现先增加后降低的趋势，在牛蒡含量为3%时多糖含量最多，为2.38 mg/mL。但是由于当复合花粉添加量＞4.00%之后，发酵体系水分活度降低，发酵液变得粘稠，流动性较差，其中仍有未发酵的花粉颗粒，逐渐失去良好的液体发酵状态。因此，选择最适复合花粉添加量为4.00%。
表3 不同复合花粉添加量对发酵液总多糖、总黄酮、铁离子还原/抗氧化能力值及综合得分指数的影响
Table 3 Effects of different compound pollen addition on total polysaccharides, total flavonoids, Ferric ion reducing antioxidant power values and composite score indexes of fermentation liquid
注：同列中不同字母表示组间具有显著性差异（P＜0.05）。下同。
复合花粉添加量/%总多糖含量/（mg·100 mL-1）总黄酮含量/（mg·100 mL-1）FRAP值/（μmol·mL-1）CI 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 177.22±5.05a 283.49±15.91b 402.76±2.34c 518.13±23.87d 581.81±11.17e 5.26±0.14a 6.82±0.11b 10.97±0.39c 18.25±0.30d 28.23±0.20e 0.451±0.040a 0.555±0.068a 0.839±0.069b 1.195±0.092c 2.357±0.242d 0 0.11 0.29 0.52 1.00
2.1.2 初始pH对发酵液总多糖、总黄酮、FRAP值及CI的影响
pH是影响杏鲍菇液体发酵时菌丝体生长，营养富集以及相关活性酶产生及释放的关键培养条件之一[34]。 不同初始pH值对发酵液各指标影响结果见表4。
表4 不同初始pH值对发酵液总多糖、总黄酮、铁离子还原/抗氧化能力值及综合得分指数的影响
Table 4 Effect of different initial pH on total polysaccharides, total flavonoids, Ferric ion reducing antioxidant power values and composite score indexes of fermentation liquid
初始pH值总多糖含量/（mg·100 mL-1）总黄酮含量/（mg·100 mL-1）FRAP值/（μmol·mL-1）CI 45678 385.69±19.39b 524.59±4.03c 376.81±8.56b 514.71±4.25c 268.72±13.05a 10.28±0.50a 12.61±0.30b 15.58±0.67c 22.41±0.26d 35.27±1.22e 0.162±0.012a 0.175±0.014a 0.246±0.015a 1.004±0.015b 1.840±0.116c 0.12 0.24 0.16 0.53 0.77
由表4可知，在初始pH4～8范围内，随着初始pH值增大，发酵液总黄酮含量以及FRAP值逐渐增大，但总多糖含量呈波动变化。当初始pH值为5和7时，发酵液中总多糖含量较高，分别为（524.59±4.03） mg/100 mL和（514.71±4.25）mg/100 mL；当pH值为8时，总黄酮含量、FRAP值及CI最高，分别为（35.27±1.22） mg/100 mL、（1.840±0.116）μmol/mL、0.77，但其总多糖含量最低，为（268.72±13.05）mg/100 mL，杏鲍菇菌丝生长不好，且发酵液流动性差。TANG B S等[35]探究了培养基初始pH值大小对杏鲍菇菌丝体生长的影响，结果表明，pH值为6.5时杏鲍菇菌丝体生长良好，发酵产物干质量最大。方玲等[36]研究结果显示，杏鲍菇菌种在初始pH4～8时均可生长，但在初始pH值为6时菌株的生物量最大，富硒量最高，说明微酸性环境更加适合杏鲍菇进行液态发酵。在发酵过程中中性或偏酸性环境更加适合杏鲍菇生长与活性物质合成。当初始pH为8时，杏鲍菇的多糖合成关键作用酶活性大大降低，导致总多糖含量显著降低[37-38]。 总黄酮含量偏高可能是因为杏鲍菇在碱性胁迫环境下产生应激保护机制，黄酮合成酶活性增强，加速黄酮类物质的合成以抵抗氧化损伤，抗氧化能力随着总黄酮含量的升高而增强[39-40]。 当初始pH为7时，杏鲍菇菌丝生长情况良好，发酵液流动性好，花粉发酵完全，总多糖含量、总黄酮含量及FRAP值均处于较高水平。因此，选择最适初始pH值为7。
2.1.3 发酵时间对发酵液总多糖、总黄酮、FRAP值及CI的影响
不同发酵时间对发酵液各指标影响结果见表5。由表5可知，随着发酵时间在3～11 d范围内的延长，发酵液中总多糖含量先上升后下降，可能是因为在发酵初期，杏鲍菇生长速度快，对花粉破壁效果较好，总多糖含量增加，而发酵后期菌丝含量增加，营养物质消耗量大于增加量，总多糖含量随之下降。而总黄酮含量、FRAP及CI则逐渐降低，可能是由于杏鲍菇在发酵过程中体系pH逐渐降低，黄酮类物质被不断分解，FRAP值随之降低[41]。当发酵时间为5 d时，总多糖含量最高，为（657.97±27.26）mg/100 mL，总黄酮含量、FRAP值及CI较高，分别为（32.79±1.11）mg/100 mL、（2.516±0.133）μmol/mL、0.83。赵俊俊等[42]研究结果显示，当生长时间为6 d时，杏鲍菇菌丝体相对干质量最高，效果最好。本实验由于使用蜂蜜和复合花粉作为发酵底物，营养物质更加丰富，杏鲍菇生长速度也会更快，发酵最优时间缩短为5 d。与张杰等[43]研究结果一致。因此，最适发酵时间为5 d。
表5 不同发酵时间对发酵液总多糖、总黄酮、铁离子还原/抗氧化能力值及综合得分指数的影响
Table 5 Effect of different fermentation time on total polysaccharides,total flavonoids, Ferric ion reducing antioxidant power values and composite score indexes of fermentation liquid
发酵时间/d总多糖含量/（mg·100 mL-1）总黄酮含量/（mg·100 mL-1）FRAP值/（μmol·mL-1）CI 35791 1 450.33±49.42b 657.97±27.26d 513.66±12.06c 475.35±31.79b 383.83±23.29a 33.51±0.32b 32.79±1.11b 28.36±0.95a 27.85±0.28a 27.60±0.62a 2.875±0.055d 2.516±0.133c 2.363±0.046c 2.080±0.024b 1.884±0.111a 0.72 0.83 0.29 0.17 0.00
2.2 复合花粉杏鲍菇液体发酵工艺优化正交试验
在单因素试验结果基础上，以CI为评价指标，以复合花粉添加量（A）、初始pH值（B）和发酵时间（C）为影响因素，按照L9（33）正交试验设计进行3因素3水平正交试验，正交试验结果见表6。 由表6可知，最佳发酵工艺条件组合为A3B3C1，即复合花粉添加量4%、初始pH值为7、发酵时间4 d。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，发酵液的CI为0.90。总多糖含量为（792.39±96.54）mg/100 mL，总黄酮含量为（46.85±1.79） mg/100 mL，FRAP值为（3.884±0.313）μmol/mL。
表6 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization
试验号ABCD 空列CI 123456789k1 111222333 123123123 123231312 123312231 0.02 0.02 0.35 0.20 0.19 0.73 0.53 0.45 0.90 k2 k3极差R 0.13 0.37 0.63 1.75 0.25 0.22 0.66 1.76 0.40 0.38 0.35 0.84 0.37 0.42 0.34 0.58
2.3 发酵液多糖的单糖组成分析
取一定量在最优发酵工艺条件下得到的发酵液进行适当稀释，随后准确吸取5.0 mL稀释液，向其中加入20 mL无水乙醇，混匀，4 ℃下静置4 h以上，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用体积分数为80%乙醇溶液洗涤残渣，离心后弃去上清液，反复操作3次。 将残渣用水溶解并定容至25 mL，得到多糖溶液。使用HPLC法进行杏鲍菇复合花粉发酵液多糖的单糖组分分析，色谱图见图1，单糖组分分析结果见表7。
图1 复合花粉杏鲍菇发酵液多糖样品单糖组成分析高效液相色谱图
Fig. 1 High performance liquid chromatogram for the analysis of monosaccharide composition of polysaccharide samples in the fermentation liquid of compound pollen by Pleurotus eryngii
表7 发酵液中多糖的单糖组成
Table 7 Monosaccharide composition of polysaccharides in fermentation liquid
单糖组分保留时间/min占比/%甘露糖核糖鼠李糖葡萄糖醛酸半乳糖醛酸葡萄糖半乳糖木糖阿拉伯糖岩藻糖14.409 18.784 19.646 23.376 27.381 30.651 35.554 37.446 38.525 44.610 4.07 0.29 0.90 1.04 1.09 85.99 2.20 0.49 3.73 0.20
由图1可知，通过对比单糖标准品出峰时间，发酵液中多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖10种单糖组成，按保留时间依次鉴定为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖。
根据单糖标准品及发酵液多糖样品的峰面积，计算得到多糖样品中各单糖组成，结果见表7。
定量结果表明，甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖的占比分别为4.07%、0.29%、0.90%、1.04%、1.09%、85.99%、2.20%、0.49%、3.73%、0.20%。其中单糖平均含量占比最高的是葡萄糖，为85.99%，其次是甘露糖和阿拉伯糖，分别为4.07%和3.73%。甘露糖具有抗癌、降糖[44]等作用，而阿拉伯糖具有抗氧化、调节肠道菌群[45]等功效。
2.4 发酵液酚酸成分分析
采用超高效液相色谱质谱联用法对发酵液的酚酸成分进行分析，酚酸成分检测结果见表8。
表8 发酵液的酚酸成分含量测定结果
Table 8 Determination results of phenolic acid components contents in fermentation liquid
酚酸组分含量/（μg·L-1）对羟基苯甲酸芦丁水杨酸槲皮素木樨草素山奈酚酸芹菜酸2 803.74±343.56 3.20±0.38 246.58±10.83 30.83±18.97 14.87±7.84 15.91±5.88 65.69±4.62
由表8可知，发酵液中共检出羟基苯甲酸、芦丁、水杨酸、槲皮素、木樨草素、山奈酚酸、芹菜酸等7种酚酸化合物，其中含量最多的为对羟基苯甲酸，含量为（2 803.74±343.56）μg/L，其次为水杨酸含量为（246.58±10.83） μg/L和芹菜酸水杨酸含量为（65.69±4.62）μg/L。对羟基苯甲酸具有改善关节炎功效[46]，因此，推测复合花粉杏鲍菇发酵液可能具有辅助抗炎、降血糖等的潜在功效。
3 结论
本研究以杏鲍菇为发酵菌株，在洋槐蜂蜜培养基中添加复合花粉（松花粉、向日葵花粉、枸杞粉、玫瑰花瓣粉、丹凤牡丹花瓣粉和关山樱花花瓣粉）进行发酵，并结合单因素及正交试验其发酵工艺进行优化。结果表明，最优的发酵工艺条件为复合花粉添加量4%、初始pH值为7、发酵时间4 d。在此优化条件下，杏鲍菇复合花粉发酵液的总多糖含量为（792.39±96.54）mg/100 mL，总黄酮含量为（46.85±1.79）mg/100 mL，FRAP值为（3.884±0.313）μmol/mL。杏鲍菇花粉发酵液中的多糖由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖10种单糖组成。 杏鲍菇花粉发酵液中共检出羟基苯甲酸、芦丁、水杨酸、槲皮素、木樨草素、山奈酚酸、芹菜酸等7种酚酸物质。
丰富多样的营养成分赋予了复合花粉杏鲍菇发酵液降低炎症反应、抗氧化、调节血糖血脂等多种潜在的功能特性，未来可通过体外实验及动物实验对杏鲍菇花粉发酵液的功能特性进行更加具体深入的研究。随着健康养生观念的不断深入，今后可进一步探索如何将具有多功能的真菌与复合花粉共发酵液和食品产业高度融合，例如基于本研究结果，企业可以结合生产实际创新食品配方，或者直接研发天然的新型花粉保健食品等，持续推动新型发酵食品产业的创新发展。
[1] 洪佳瑞，张丽梅，王思凡，等.花粉发酵研究进展[J] .保鲜与加工，2024，24（7）：117-123.
[2] SU J,YANG X Y,LU Q,et al.Antioxidant and anti-tyrosinase activities of bee pollen and identification of active components[J] .J Apic Res,2021,60(2)：297-307.
[3] 潘立涛，杨长军，谷雨琦，等. 松花粉和发酵松花粉现代应用进展[J] .食品工业，2025，46（3）：184-187.
[4] ZHOU W T,HE Y Z,LV J M,et al.Preparation technologies,structural characteristics and biological activities of polysaccharides from bee pollen：A review[J] .Int J Biol Macromol,2025,306：141545.
[5] TU J, HE Y F, ZHANG H F, et al. Anti-tumor effect of Crocus sativus petals polysaccharides by reconstructing tumor microenvironment[J] .Int J Biol Macromol,2023,248：125878.
[6] 李学震，马艳蕊，孟园，等.“金花菌”发酵牡丹花瓣茶工艺及其活性研究[J] .食品科技，2022，47（11）：66-71.
[7] 李雨欣. 牡丹花瓣粉的主要营养和化学成分检测及其防治酒精性肝损伤的评价[D] .西安：西北大学，2023.
[8] 卢新阳，孙奕舒，徐涛，等. 玫瑰蜂花粉破壁工艺优化及其醇提物生理活性比较[J] .食品工业科技，2025，46（4）：176-184.
[9] 李春梅，陈恩海，韩佳临，等.红茶、玫瑰花发酵乳饮料工艺技术的优化[J] .食品研究与开发，2023，44（20）：160-166.
[10] CHENG Y,ANG B J,XUE C Y,et al.Insights into the fermentation potential of pollen：Manufacturing, composition, health benefits, and applications in food production[J] .Trends Food Sci Technol,2024,143：104245.
[11] 王谦，耿越，李晓，等. 蜂花粉和松花粉主要营养成分对比分析[J] . 食品研究与开发，2017，38（14）：219-224.
[12] 董彩文，邱彦军，王明雷，等. 蜂花粉黄酮的固态发酵提取工艺优化及抗氧化活性研究[J] .中国调味品，2025，50（5）：217-222.
[13] 冯洲旭，张根生，孔令杰，等.向日葵蜂花粉中酚胺类化合物定性定量分析[J] .食品研究与开发，2021，42（5）：177-183.
[14] 朱阳东，丁金铭，黄一真，等.松属植物多糖研究进展[J] .中华中医药学刊，2025，43（9）：143-149.
[15] 王斌. 玫瑰花中黄酮提取及其抗氧化活性的研究[J] . 湖北文理学院学报，2017，38（5）：29-32.
[16] 彭腾腾，王信，李海燕，等. 紫斑牡丹花粉对D-半乳糖致衰老模型小鼠的影响[J] .中国药理学通报，2024，40（4）：730-739.
[17] 毛静春，罗发美，代腾云，等.6种可食用花卉化学成分的测定及其抗氧化活性对比分析[J] . 食品安全质量检测学报，2025，16（12）：294-302.
[18] WANG D Q,SU D B,XU H H,et al.New insights into the drying technology of Pleurotus eryngii：Effects on protein structure,properties and product flavor analysis[J] .Int J Biol Macromol,2025,285：138306.
[19] HU Q H,YUAN B,XIAO H,et al.Polyphenols-rich extract from Pleurotus eryngii with growth inhibitory of HCT116 colon cancer cells and antiinflammatory function in RAW264.7 cells[J] . Food Funct,2018,9(3)：1601-1611.
[20] 李惠琳，李珏，李宝通，等. 杏鲍菇多糖对小鼠急性化学性肝损伤的抗炎及抗氧化作用[J] .食品研究与开发，2024，45（21）：68-74，117.
[21] ZHAO Y Y,ZHANG Z,WANG L,et al.Hypolipidemic mechanism of Pleurotus eryngii polysaccharides in high-fat diet-induced obese mice based on metabolomics[J] .Front Nutr,2023,10：1118923.
[22] WANG H,MA S,MARIGA A M,et al.Structural characterization and anti-inflammatory activities of novel polysaccharides obtained from Pleurotus eryngii[J] .Food Science Human Wellness,2024,13(5)：3031-3042.
[23] PETRAGLIA T,LATRONICO T,PEPE A,et al.Increased antioxidant performance of lignin by biodegradation obtained from an extract of the mushroom Pleurotus eryngii[J] .Molecules,2024,29(23)：5575.
[24] 曹红刚，张政，木华芬，等. 油菜蜂花粉的4种真菌发酵破壁酶活变化及营养分析[J] .中国食品学报，2016，16（1）：258-263.
[25] 雷露，许浩翔，李婷，等. 黄花梨蜂蜜与其他蜜源蜂蜜的抗氧化特性研究[J] .轻工学报，2025，40（1）：32-40.
[26] 王熙彤，杨嘉祥，王爱家，等. 微量苯酚-硫酸法快速测定西瓜翠衣多糖含量[J] .食品安全质量检测学报，2024，15（22）：204-210.
[27] SAVA C,SÎRBU R.Analytical study of the determination of flavonoids in Black Sea algae[J] .Ovidius Univ Annals Chem,2010,21(1)：29-34.
[28] 张厅，陈思奇，丁筑红，等.TOPSIS法综合评价不同助干剂对刺梨汁喷雾干燥粉品质的影响[J] .包装与食品机械，2021，39（5）：1-7.
[29] 常云鹤，尹大海，阮响应，等. 基于逼近理想解排序法的鱼腥草干燥粉抗氧化和抗炎活性多指标综合评价[J] . 食品安全质量检测学报，2025，16（17）：130-138.
[30] 路帅帅，杨奥淇，徐硕，等. 植物多糖生物活性及其应用研究进展[J] .畜牧与饲料科学，2025，46（2）：86-94.
[31] 洪佳瑞，张丽梅，王思凡，等. 复合花粉灵芝发酵工艺优化及活性物质组分分析[J] .保鲜与加工，2024，24（11）：107-117.
[32] 徐程楠，王天玉，姚周麟，等. 柑橘果实中酚酸类化合物研究进展[J] .浙江柑橘，2022，39（1）：2-7.
[33] 董玉玮，朱曹凯，顾鑫玥，等. 杏鲍菇液体发酵沛县黄皮牛蒡对多糖含量影响的研究[J] .农产品加工，2023，21（9）：6-10.
[34] LIU C Q,FENG J J,WANG S M,et al.Enhancement of hyphae growth and medium optimization for Pleurotus eryngii-3 under submerged fermentation[J] .Agronomy,2022,12(10)：2413.
[35] TANG B S,LAI P F,WENG M J,et al.Optimization of submerged fermentation conditions for biosynthesis of ergothioneine and enrichment of selenium from Pleurotus eryngii 528[J] .Food Sci Technol,2022,42：e40022.
[36] 方玲，汤强，韩永斌. 富硒杏鲍菇液体菌种深层发酵条件优化[J] . 芜湖职业技术学院学报，2020，22（4）：15-19.
[37] 赵圆圆. 杏鲍菇子实体多糖的提取纯化、结构表征及降脂活性研究[D] .西安：陕西科技大学，2020.
[38] 王苑螈，王波，王秀英，等.毕赤酵母异源表达β-葡聚糖酶酶学特性的研究[J] .上海农业学报，2016，32（1）：10-14.
[39] HAN D, WANG K, LONG F, et al. Effects of endophytic fungi on the secondary metabolites of Hordeum bogdanii under alkaline stress[J] .AMB Express,2022,12(1)：73.
[40] 孔庆林，罗丹，杨赫，等.野生大豆内生真菌酸碱胁迫下次生代谢产物分析[C] .哈尔滨：全国植物生物学大会论文集，2018.
[41] ZHANG H F,LU Q,LIU R.Widely targeted metabolomics analysis reveals the effect of fermentation on the chemical composition of bee pollen[J] .Food Chem,2022,375：131908.
[42] 赵俊俊，马瑞霞. 杏鲍菇液体菌种摇瓶发酵条件的研究[J] . 中国园艺文摘，2017，33（8）：27-28，83.
[43] 张杰，侯潞丹，贺志斌.响应面试验优化杏鲍菇液体发酵菌种培养条件[J] .食品科学，2017，38（6）：147-152.
[44] SANG J Q, ZHAO G, KOIDIS A, et al. Isolation, structural, biological activity and application of Gleditsia species seeds galactomannans[J] .Carbohydr Polym,2024,334：122019.
[45] LIU K,DONG H X,Li X R,et al.L-arabinose alleviates functional constipation in mice by regulating gut microbiota and metabolites[J] .Foods,2025,14(5)：900.
[46] 马怡晗，魏承琼，徐笑天，等.对羟基苯甲酸通过抑制NF-κB/caspase-1信号通路抗类风湿性关节炎的研究[J] . 中国现代应用药学，2023，40（18）：2519-2525.