小麦是人类饮食中广泛使用的重要谷物，中国小麦产量已连续多年稳居世界第一[1]。淀粉是小麦粉中的主要成分，约占小麦籽粒总质量的60%～70%，小麦淀粉由A型和B型两种不同形式的颗粒组成，其中A型淀粉颗粒呈圆盘状或透镜状，而B型淀粉颗粒的形状为球形或多边形。淀粉改性可以改变其结构，而淀粉结构的变化会显著影响淀粉的溶解性、黏度等理化性质[2]。近年来，物理、化学及生物法淀粉改性技术快速发展，其中微生物发酵处理因条件温和、绿色高效成为研究热点[3]。微生物通过分泌淀粉酶、有机酸等代谢产物，可降解糖苷键，改变淀粉多尺度结构[4-5]。研究表明，乳酸菌与酵母菌联合发酵小麦淀粉，可侵蚀淀粉颗粒表面，破坏部分结晶结构，增加淀粉分子的分支度和短链比例[6]。
酱香型大曲以小麦为原料，小麦经破碎添加母曲和适量水搅拌后，采用人工或机械成坯、培养、翻坯、贮存等阶段制成。 目前已经通过微生物调控、酶工程及多组学技术对制曲过程进行了系统性研究，发现小麦发酵既是淀粉改性的过程，也是风味前体物质生成的关键步骤。 但发酵淀粉研究多集中于短周期处理及单一菌种作用[7-8]，对于较长周期自然发酵下淀粉结构动态演变规律研究不足。自然发酵会降低小麦淀粉分子量[9]；酸面团发酵过程中淀粉颗粒微观结构以及理化性质会发生明显改变[10]。现有研究鲜有整合形貌、晶体、分子等多尺度分析手段解析小麦淀粉结构的变化规律，限制了对发酵改性机制的深入解析[11]。本研究以小麦为研究对象，采用酱香型大曲进行发酵，探究发酵处理对小麦淀粉结构及理化性质的影响，以期为改善小麦淀粉的加工性能及发酵改性技术在小麦制曲的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小麦：产自河南省漯河市；酱香型大曲：产自贵州省仁怀市；二甲基亚砜-d6（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；氯化钠（分析纯）：天津众泰化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Sigma 300型扫描电子显微镜：德国卡尔蔡司公司；Mini Flex 600桌面式X射线衍射仪：日本理学株式会社；Spcctrum Two红外光谱仪：美国Perkin Elmer公司；500 MHz核磁共振波谱仪：德国Bruker公司；Q 20差示扫描量热仪：美国TA公司；RVA-TM快速粘度分析（rapid visco analyser，RVA）仪：瑞典波通仪器公司；H1650R离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；800Y高速多功能粉碎机：永康市铜欧五金制品公司。
1.3 方法
1.3.1 小麦淀粉的提取
称取100 g小麦用粉碎机粉碎后过100目筛，加适量水和成面团，采用2.5%NaCl溶液洗涤[12]将小麦面筋完全洗出并收集淀粉，得到的淀粉浆液以4 000 r/min离心10 min，弃去上清液并将上层黄色杂质刮去，淀粉沉淀用蒸馏水洗净后收集下层的淀粉，连续水洗至4 000 r/min离心后淀粉浆液呈白色，并将收集到的淀粉放入40 ℃的干燥箱中干燥48 h；用粉碎机打成粉末状，过200目筛，即得小麦淀粉。
1.3.2 酱香型大曲发酵小麦工艺流程
将小麦按照粮水比100∶8（g∶mL），40 ℃润粮4 h，粉碎成粗细比6∶4的颗粒，加入5%的酱香型大曲曲粉搅拌均匀，随后加水搅拌至手捏成团不粘手的状态，将其捏成圆球状（每个200 g），放入不锈钢桶中用稻草保温，常温发酵20 d。 将实验组小麦分别在发酵0、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d时取出[13]，重复1.3.1所述方法制得不同发酵时间的小麦淀粉样品。
1.3.3 小麦淀粉颗粒的形貌观察
参考牛潇潇等[14]的方法并作适当修改。使用德国卡尔蔡司Sigma 300扫描电子显微镜对小麦淀粉进行观察。 取适量小麦淀粉均匀分散在导电胶带上，将固定好样品的导电胶带放入离子溅射仪中进行喷金处理，喷金时间设定为30～60 s，随后放入扫描电镜进行观察，加速电压为3 kV，图片扫描倍数为500、2 000、5 000倍。
1.3.4 小麦淀粉结晶度测定
参考LIUGX等[15]的方法并作适当修改。用X射线衍射仪测定淀粉的结晶结构和结晶度，测定参数：扫描速率2°/min，电流40 mA，电压40 kV，扫描范围5～50°，步长0.02°，连续扫描。结果采用Origin 2021软件计算曲线的峰面积。 淀粉的结晶度按公式（1）计算：
1.3.5 小麦淀粉分子结构测定
参考YU X S等[16]的方法并作适当修改。分别取不同发酵时间的小麦淀粉适量，利用ATR傅里叶变换红外光谱仪进行红外光谱测定。 扫描条件：扫描次数32次，扫描范围4 000～400 cm-1，扫描分辨率为4 cm-1。
1.3.6 小麦淀粉分支度测定
参考胡荣等[17]的方法并作适当修改。将10 mg样品溶解在0.6 mL二甲基亚砜中，采用核磁共振氢谱（nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H NMR）法测定淀粉样品的糖苷键比。α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键分别在δ=5.12和δ=4.89处测定。淀粉的分支度（degree of branching，DB）按公式（2）计算：
式中：DB为分支度，%；Iα-1，4和Iα-1，6分别为α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的1H NMR峰面积。
1.3.7 小麦淀粉溶解度和膨胀度测定
参考张晓萌等[18]的方法，准确称取1 g淀粉样品（干基）于离心管中，向管中加入50 mL蒸馏水，制备质量分数为2%的淀粉乳悬浮液。然后将离心管置于沸水中水浴搅拌30 min。冷却后5 000 r/min，离心15 min，所得沉淀为膨胀淀粉，将上清液倒入铝盒中，于105 ℃烘箱中烘干至恒质量即得水溶性淀粉。淀粉的溶解度（S）和膨胀度（SC）按公式（3）和公式（4）计算：
式中：A为上清液烘干至恒定后的质量，g；W为淀粉质量，g；P为离心后沉淀物质量，g。
1.3.8 小麦淀粉热力学特性测定
参考李慧敏等[19]的方法，通过差示扫描量热仪分析样品的热力学特性，称取3 mg发酵后小麦淀粉和9 μL蒸馏水置于铝坩埚中压盖密封，4 ℃平衡24 h，将平衡后的样品置于差示扫描量热仪样品室中进行测定，扫描温度范围30～110 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气流速50 mL/min。
1.3.9 小麦淀粉糊化特性测定
参考宋旭东等[20]的测定方法，称取不同发酵时间小麦淀粉3.00 g与25 mL蒸馏水混合，利用RVA-TM快速粘度仪测定淀粉黏度特征值，主要包括峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值、峰值时间、糊化温度。
1.3.10 数据处理
所有实验均重复测定3次，采用SPSS 24.0软件Duncan检验进行方差分析（P＜0.05表示差异显著），采用Origin2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉微观结构的影响
酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉扫描电镜结果见图1。由图1可得，发酵时间不同，所得小麦淀粉微观结构差异明显，发酵前淀粉颗粒极大部分呈圆饼形，球形，少部分呈不规则形状，且颗粒表面光滑，颗粒完整，小颗粒淀粉极少；发酵4 d相较0 d变化不大，但小颗粒淀粉逐渐增多；随着发酵时间在8～20 d增加，淀粉粒表面出现明显的被腐蚀空洞，表面粗糙。 小颗粒淀粉的增多，是由于发酵过程中微生物产生的代谢产物使淀粉分子发生一定程度的降解[21-23]；小麦淀粉表面空洞是由微生物酶的定向降解与代谢有机酸的腐蚀共同造成，这与李彦慧等[6]的研究结果一致。综上，经酱香型大曲发酵处理显著改变了小麦淀粉颗粒表面形态。
图1 酱香型大曲发酵过程小麦淀粉扫描电镜图
Fig. 1 Scanning electron microscope image of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
2.2 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉结晶度的影响
酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉X射线衍射图谱见图2。 由图2可知，小麦淀粉特征衍射峰在15°、17°、18°、23°附近出现，在17°、18°处有相连的双峰，为A型结晶衍射特征[24]。 发酵0～20 d，衍射峰未发生明显改变，没有新的衍射峰生成，表明小麦淀粉的晶体类型没有发生改变[25]，这与卫娟等[10]的研究结果一致。小麦淀粉经发酵处理后，结晶度随发酵时间的增加呈先增后降的趋势，发酵0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d的结晶度分别为17.95%、16.82%、20.70%、23.54%、22.70%、18.48%。 淀粉结晶度在发酵第12天达到最大值。小麦淀粉结晶度的上升可能是由于微生物代谢物破坏了发酵前期淀粉颗粒的无定形区，结晶度下降可能是由于发酵产生的酸、酶渗入了淀粉颗粒内部，使结晶区开始水解[10]。 整体来看，发酵20 d的结晶度（18.48%）较0 d（17.95%）略有提高，表明长期自然发酵对小麦淀粉结晶度的整体影响较小，但中间过程存在显著的动态变化。 这可能是由于发酵前期无定形区的破坏与后期结晶区的水解达到了一定平衡，使得最终结晶度与初始水平接近。
图2 酱香型大曲发酵过程小麦淀粉X射线衍射图谱
Fig. 2 X-ray diffraction pattern of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
2.3 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉分子结构的影响
酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉傅里叶变换红外光谱图见图3。由图3可得，吸收峰3 429.5 cm-1为羟基伸缩振动特征峰，2 992 cm-1为C-H伸缩振动，1 662.8 cm-1处的特征峰归因于淀粉无定形区域中水分子的-OH的剪切振动，1 147.7 cm-1、1 077 cm-1、981.1 cm-1处的特征峰分别对应于C-O-C、C-O和C-C骨架伸缩振动[26]。发酵处理前后小麦淀粉的特征峰峰形和波数位置一致，没有新的特征峰产生，表明发酵处理没有使淀粉分子的分子链断裂，也没有产生新的官能团。1 047 cm-1处的吸收峰强度与1 022 cm-1处的吸收峰强度比值（R1047/1 022）通常用于反映淀粉分子链的有序化程度或短程有序结构的变化[19，24]，R1047/1022越大，表示有序度越高。发酵0～20 d，各实验组小麦淀粉R1047/1022依次为0.652、0.652、0.647、0.687、0.679、0.690，随着发酵时间的延长，该比值呈先下降后升高的趋势。比值在发酵初期的轻微下降可能暗示了微生物活动初期对淀粉无定形区分子链构象产生了轻微的扰动，导致短程有序度略有降低。而发酵第8天后，R1 047/1 022比值的大幅升高则表明淀粉分子的短程有序结构有所增强，这可能与发酵过程中部分直链淀粉的降解或支链淀粉侧链的重排有关，使得淀粉分子链间的氢键作用增强，分子排列更为有序[10]。这一变化趋势与前述结晶度在发酵中后期先升后降的规律存在一定关联，共同反映了发酵处理对小麦淀粉多尺度结构的影响。
图3 酱香型大曲发酵过程小麦淀粉傅里叶变换红外光谱图
Fig. 3 Fourier transform infrared spectroscopy of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
2.4 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉分支度的影响
酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉核磁共振氢谱图见图4。由图4可知，发酵前后小麦淀粉的1H NMR谱图信号峰无明显差异，说明酱香型大曲发酵处理不会使淀粉产生新的质子信号，即发酵过程未生成淀粉新组分，仅对原有糖苷键结构产生作用。 图中δ=5.11和δ=4.90处的化学位移分别代表了α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键结构。分支度反映淀粉中α-1,6-糖苷键的相对比例，其变化与α-1,4、α-1,6糖苷键的破坏程度直接相关。发酵0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d，小麦淀粉分支度（DB）依次为12.01%、12.12%、12.24%、12.59%、10.92%、12.30%。 发酵过程中优先破坏α-1,4-糖苷键，使分支度大多升高；仅在发酵后期（16 d）因α-1,6-糖苷键被破坏，分支度显著降低（P＜0.05）。同时，发酵未改变淀粉的质子信号类型，仅选择性破坏原有α-1,4和α-1,6糖苷键的结构完整性[27]，综上酱香型大曲发酵16 d对小麦淀粉分支度有显著影响，其他发酵阶段对分支度无显著影响。
图4 酱香型大曲发酵过程小麦淀粉核磁共振氢谱图
Fig. 4 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
2.5 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉溶解度、膨胀度的影响
由图5A可知，小麦淀粉的溶解度随着发酵时间的延长不断升高，发酵0～20 d，小麦淀粉的溶解度为7.64%～13.24%，溶解度的增加可能与微生物对淀粉分子解聚有关[28]。 膨胀度主要发生在无定形区，反映的是直链淀粉的水合作用。由图5B可知，小麦淀粉的膨胀度随着发酵时间的延长先不断升高后趋于稳定，发酵0～20 d，小麦淀粉的膨胀度为6.02%～6.89%，显著高于发酵前（P＜0.05），这与陈晓明[29]的研究结果类似。可能是发酵时微生物产生的代谢产物随着发酵时间的增加与淀粉形成较强的氢键使膨胀度升高[30]。
图5 酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉溶解度（A）和膨胀度（B）的变化
Fig. 5 Changes in solubility (a) and swelling power (b) of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
2.6 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉热力学特性的影响
不同发酵时间小麦淀粉的热力学特性参数见表1。 由表1可知，随着发酵时间的增加，淀粉糊化的起始温度、峰值温度、终止温度均呈上升趋势，明显著高于发酵前，这可能是由于小麦淀粉降解产生的物质与小麦淀粉之间的相互作用不断加强[31]，两者形成了稳定的网络结构，降低了淀粉链的流动性，从而需要更多的热量来破坏分子结构[32]。糊化焓值是淀粉糊化过程中吸收热量的量化指标，反映淀粉结晶区破坏所需的能量，随着发酵的进行，小麦淀粉糊化焓值变化呈现出显著的波动状态，可能是淀粉分子链的不断断裂、重排造成的[33]。综上，发酵处理增强了小麦淀粉的热稳定性。
表1 酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉热力学特性参数
Table 1 Thermodynamic characteristic parameters of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
注：同一列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下同。
发酵时间/d 起始温度/℃ 峰值温度/℃ 终止温度/℃ 糊化焓值/（J·g-1）0481 2 16 20 54.08±0.16c 58.06±1.08b 58.06±1.09a 58.06±1.10a 58.06±1.11a 58.06±1.12a 59.58±0.01a 60.67±0.02c 62.08±0.32e 61.28±0.04b 61.25±0.03d 64.56±0.10f 66.00±0.33ab 68.38±1.76ab 72.47±1.02a 73.78±1.22a 70.00±3.69c 72.51±0.27a 4.67±2.01bc 7.34±0.58a 4.98±0.89bc 6.43±0.13ab 3.98±0.52c 6.60±1.46ab
2.7 酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉糊化特性的影响
糊化是淀粉在水介质中受热后发生的物理化学过程，表现为淀粉颗粒吸水膨胀、结构解体并形成粘稠胶体溶液[34]。 不同发酵时间小麦淀粉RVA曲线见图6，不同发酵时间小麦淀粉糊化特性参数见表2。由图6和表2可知，随着发酵时间的增加，峰值黏度与谷值黏度均呈现先急剧下降后缓慢回升的趋势，且均低于未发酵样品。 这表明发酵初期（0～12 d）大曲中的酶系迅速降解淀粉分子，后期（12～20 d）黏度略有回升，可能与易降解组分已被完全消耗有关，但淀粉结构已发生不可逆的改变。崩解值先升后降，说明发酵前期淀粉糊耐剪切能力变差，热稳定性降低[23]。最终黏度与回生值在发酵后期（16～20 d）上升且显著高于发酵前（P＜0.05），这表明发酵产生了大量直链淀粉片段或短链糊精，它们在冷却过程中更易重排结晶，导致淀粉的老化趋势显著增强。峰值时间的缩短也说明淀粉颗粒因被降解而更易糊化。 综上，经酱香型大曲发酵处理降低了小麦淀粉的黏度和淀粉糊的热稳定性，增强了其老化回生。
表2 酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉糊化特性参数
Table 2 Gelatinization characteristic parameters of wheat starch during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
发酵时间/d峰值黏度/cP谷值黏度/cP崩解值/cP最终黏度/cP回生值/cP峰值时间/min糊化温度/℃0481 2 16 20 2 449.23±50.33a 2 285.17±35.11ab 2 269.11±30.55ab 1 820.08±20.07c 2 101.04±50.00b 2 120.05±20.07b 1 710.15±25.33a 1 470.12±30.00b 1 310.16±20.33c 872.03±15.67d 1 315.07±35.00c 1 235.01±25.33c 739.0±20.11c 815.0±25.17b 958.9±15.67a 948.0±10.33a 785.9±30.33b 885.0±20.67ab 2 500.1±45.67d 2 435.2±40.33d 2 580.1±35.00c 1 995.0±30.67e 3 350.0±60.33a 3 205.0±55.33b 790.03±15.00d 965.13±20.33c 1 269.9±25.33b 1 123.0±20.67c 2 034.9±45.67a 1 970.0±35.33a 6.4±0.05a 6.2±0.10b 6.1±0.08b 5.6±0.06c 6.1±0.05b 6.0±0.07b 88.1±0.15a 84.8±0.20b 85.5±0.25c 84.1±0.30d 87.3±0.20e 84.7±0.25b
图6 酱香型大曲发酵过程中小麦淀粉的糊化曲线
Fig. 6 Pasting curves of wheat during the fermentation process of sauce-flavor Daqu
3 结论
本研究探究了酱香型大曲发酵对小麦淀粉结构及理化性质的影响。结果表明，发酵0～20 d，小麦淀粉颗粒表面由完整光滑变为粗糙多孔；结晶度呈先升后降趋势，发酵第12天达到峰值，为23.54%；淀粉分子的R1 047/1 022先略微下降后大幅升高，发酵第20天达到峰值，为0.69。该比值的动态变化，证实淀粉分子短程有序性经破坏后重组，有序性增强；1H NMR显示发酵16 d显著提高了淀粉分支度（10.92%）；溶解度与膨胀度均呈持续上升趋势，发酵第20天达到峰值，分别为13.24%和6.89%，显著高于发酵前（P＜0.05）；热力学分析表明发酵提高了淀粉分子的热稳定性；降低了小麦淀粉的黏度和淀粉糊的热稳定性，增强了其老化回生。 本研究为酱香型大曲发酵处理对小麦淀粉多尺度结构和理化性质的影响提供理论依据，对小麦发酵相关制品有一定的指导意义。
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