白酒酿造废水主要由清洗水、蒸馏废水、尾水等组成，化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）在20 000～25 000 mg/L之间（不含冷却水），其中蒸馏废水贡献了大部分COD[1]。 蒸馏废水（底锅水）是在甑桶中蒸煮粮食或酒醅时，水蒸气冷凝并溶解糟醅中的可溶物后回流到甑桶底部，融合锅底用水的混合液体，因此相当于对糟醅进行了以水为溶剂的高温粗提取，蒸馏废水即为糟醅的粗提取液，其成分与酒糟中的可溶物相似，其中含有脂肪酸、还原糖、可溶性淀粉、粗蛋白等高沸点物质[2-3]，具有作为微生物培养基质的潜能[4-5]。黄水是固态酿造生产白酒过程中，糟醅入窖后发酵产生沉积于窖池底部的棕黄色粘稠浆水。黄水底锅水则是采用黄水代替蒸馏时所需的锅底用水，蒸馏后产生的废水。黄水底锅水作为废水的主要组分之一，目前大多均是直接进入工厂废水处理系统[6-7]，处理达标后间接排放，然而对其综合利用研究较少[8]，且只限于实验室阶段。
磷是植物生长发育必需的营养元素之一，在农业生态系统中，其有效供给直接影响作物的光合作用、能量代谢及生殖发育等关键生理过程[9-10]，能够促进细胞内核酸与核蛋白的形成，加速细胞的分裂与增殖[11]，从而推动植株的健康发育，并有助于延缓衰老、提升果实质量[12]。然而，目前中国化肥的利用率相对较低[13-14]，大部分磷元素会被固定成生物有效性较低的形态，仅有10%～20%的磷可以被作物有效吸收利用，导致磷肥的当季利用率低[15]。为了满足作物的生长需求，我国的农田常常过量施用磷肥，这进一步导致磷素在土壤中大量累积[16-17]。 解磷菌剂能够通过分泌有机酸、磷酸酶等代谢产物[18]，将难溶性磷转化为可溶性磷，是提高土壤磷利用率的重要策略之一，也是目前功能性生物肥料之一，被农业领域所热衷[19-20]。
本研究以高效解磷菌不动杆菌（Acinetobacter）S1发酵黄水底锅水，并以有效磷含量为响应值，通过单因素试验、PB试验、最陡爬坡试验和响应面法对其发酵培养基成分（如碳源、氮源、无机盐、磷酸钙等）及发酵条件（如温度、时间等）进行优化，以期进一步提高其溶磷能力，此研究不仅解决了酿造废水的排放问题，同时也为不动杆菌S1作为高效解磷菌剂的开发与应用提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
黄水底锅水（富含高沸点的多种氨基酸、有机酸等有机物质，通常呈酸性）：源自泸州浓香型白酒厂，-4 ℃冷藏保存备用；糖蜜（含52%糖，3.7%粗蛋白，8%矿物质）：市售；不动杆菌（Acinetobacter）S1：四川轻化工大学生物工程学院生物发酵技术及应用实验室分离保藏。
1.1.2 试剂
葡萄糖、氯化钾、硫酸铵（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；酵母侵粉、蛋白胨（均为生化试剂）、氯化钠（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖、尿素、硫酸镁（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸钙（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
无机磷培养基[21]：葡萄糖10.0 g，硫酸铵0.5 g，磷酸钙5.0 g，氯化钾0.3 g，氯化钠0.3 g，硫酸镁0.3 g，黄水底锅水1.0 L，pH 7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基[22]：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
PHS-3C pH计：上海佑科仪器仪表有限公司；Spectrostar Nano微孔板光度计：广州伯齐生物科技有限公司；DFD-700水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；MJ-8085H-JJ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；TG-16台式高速离心机：四川蜀科仪器有限公司；AIRTECH超净工作台：重庆市永生实验仪器厂；5424R离心机：德国Eppendorf公司；MS105DM十万分之一电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 不动杆菌S1发酵条件优化单因素试验
挑取活化的不动杆菌S1菌落一环至装有50 mL NB培养基的250 mL三角瓶中，于37 ℃、160 r/min条件下培养12 h，获得种子液。将种子液按1%（V/V）的接种量接种于无机磷培养基中，于37 ℃、160 r/min条件下发酵36 h。基于此，以发酵液中有效磷含量为评价指标，分别对碳源种类（葡萄糖、蔗糖、糖蜜）及添加量（葡萄糖和蔗糖的质量浓度梯度均为6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L；糖蜜的质量浓度梯度为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、氮源种类（尿素、酵母浸粉、硫酸铵、蛋白胨）及添加量（0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L）、磷酸钙添加量（3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L）、无机盐种类（氯化钾、氯化钠、硫酸镁）及添加量（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L）、接种量（1%、3%、5%、7%、9%）、发酵温度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、发酵时间（24 h、30 h、36 h、42 h、48 h）进行单因素试验。
1.3.2 Plackett-Burman试验
根据单因素试验结果，以有效磷含量（Y）为响应值，以糖蜜添加量（X1）、硫酸铵添加量（X2）、磷酸钙添加量（X3）、氯化钾添加量（X4）、接种量（X5）、发酵温度（X6）和发酵时间（X7）为考察因素，分别选取高（+1）、低（-1）两个水平，采用Design-Expert 12.0软件设计Plackett-Burman（PB）试验，筛选出对有效磷含量影响最为显著的因素，PB试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化Plackett-Burman试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests for fermentation conditions optimization
因素水平-11 X1糖蜜添加量/（g·L-1）X2硫酸铵添加量/（g·L-1）X3磷酸钙添加量/（g·L-1）X4氯化钾添加量/（g·L-1）X5接种量/%X6发酵温度/℃X7发酵时间/h 15 0.5 4033 3 30 25 1.5 6 0.2 7 37 42
1.3.3 最陡爬坡试验
基于PB试验的结果，得到对发酵液中有效磷含量具有显著性影响的3个关键因素糖蜜添加量、接种量、发酵时间。 为了进一步界定包含最优值的因素范围，并确定后续响应面试验设计所需的中心点，依据PB试验结果回归方程中的回归系数以及这3个关键因素的效应值大小，确定最陡爬坡试验的爬坡方向和步长。采用Design-Expert 12.0软件设计最陡爬坡试验，试验设计见表2。
表2 发酵条件优化最陡爬坡试验设计
Table 2 Design of the steepest ascent tests for fermentation conditions optimization
试验号糖蜜添加量/（g·L-1）接种量/%发酵时间/h 1 15342
续表
试验号糖蜜添加量/（g·L-1）接种量/%发酵时间/h 23456 20 25 30 35 40 45678 40 38 36 34 32
1.3.4 Box-Behnken中心组合试验
基于最陡爬坡试验结果，以有效磷含量（Y）作为响应值，以糖蜜添加量（A）、接种量（B）、发酵时间（C）为考察因素，采用Design-Expert 12.0软件设计3因素3水平的Box-Behnken中心组合响应面试验，试验因素与水平见表3。
表3 发酵条件优化Box-Behnken响应面试验因素与水平
Table 3 Factors and levels of Box-Behnken response surface tests for fermentation conditions optimization
因素-1水平0 1 A 糖蜜/（g·L-1）B 接种量/%C 发酵时间/h 25 5 34 30 6 36 35 7 38
1.3.5 有效磷含量的检测
发酵结束后，取发酵液离心（10 000 r/min，10 min），按照钼蓝比色法测定上清液中有效磷含量[23-24]。
1.3.6 数据统计与分析
每个试验重复3次，使用Microsoft Excel 2019软件和IBM SPSS Statistics 26.0软件处理数据，结果以“平均值±标准差”表示，采用Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 发酵培养基组分优化单因素试验
2.1.1 碳源种类及添加量对有效磷含量的影响
碳源是培养基中微生物或细胞生长的主要能量来源，也是合成细胞物质所需碳骨架的基础[25-26]。因此，考察不同碳源种类及添加量对有效磷含量的影响，结果见图1。由图1可知，随着蔗糖添加量的增加，有效磷含量呈先增加后降低的趋势，当蔗糖添加量为8 g/L时，有效磷含量达到最高，为83.72mg/L。而随着葡萄糖与糖蜜添加量的增加，有效磷含量呈先增加后趋于稳定的趋势，当葡萄糖和糖蜜添加量分别为8 g/L和20 g/L时，有效磷含量趋于稳定，分别为81.31 mg/L和87.60 mg/L。综合对比发现，糖蜜作为碳源时具有最高的有效磷含量，分析原因可能是糖蜜含有高浓度的可发酵糖（蔗糖、还原糖）、蛋白质、矿物质（如钾、镁）、维生素及生物素，可为微生物提供全面的营养[27-28]。 此外，糖蜜是制糖工业的副产物，来源广泛且价格低廉，可降低生产成本[29-30]。综合考虑，选择最佳碳源及添加量为20 g/L的糖蜜。
图1 不同碳源种类及添加量对有效磷含量的影响
Fig. 1 Effects of types and addition of different carbon sources on effective phosphorus contents
2.1.2 氮源种类及添加量对有效磷含量的影响
氮源是培养基中微生物或细胞合成蛋白质、核酸等含氮物质的必需成分，对细胞生长、代谢及遗传信息传递至关重要[31]。因此，考察不同氮源种类及添加量对有效磷含量的影响，结果见图2。 由图2可知，随着尿素及蛋白胨添加量的升高，有效磷含量均呈下降趋势，当未添加尿素及蛋白胨时，有效磷含量最高，分别为77.23mg/L、82.50 mg/L，分析原因可能是这两种氮源不适合该菌株代谢解磷相关酶[32-33]。然而随着酵母浸粉及硫酸铵添加量的升高，有效磷含量均呈现先增加后降低的趋势。当酵母浸粉及硫酸铵添加量分别为1.5 g/L、1.0 g/L时，有效磷含量最高，分别为85.24 mg/L、93.64 mg/L，说明硫酸铵作为氮源时具有最高的有效磷含量，这与唐岷宸等[33]的研究结果一致。因此，选择最佳氮源及添加量为1.0 g/L的硫酸铵。
图2 不同氮源种类及添加量对有效磷含量的影响
Fig. 2 Effects of types and addition of different nitrogen sources on effective phosphorus contents
2.1.3 磷酸钙添加量对有效磷含量的影响
磷酸钙作为基质中主要的磷源，为不动杆菌S1提供难溶性磷形态的底物。磷酸钙添加量对有效磷含量的影响见图3。由图3可知，随着磷酸钙添加量的升高，有效磷含量呈先上升后下降的趋势。这可能是由于磷酸钙添加量过低导致不动杆菌S1转化磷源的底物不足，然而，添加量过高则可能抑制不动杆菌S1的生长[34]。当磷酸钙在添加量为5 g/L时，有效磷含量达到最高，为94.09 mg/L，因此，选择磷酸钙的最佳添加量为5 g/L。
图3 磷酸钙添加量对有效磷含量的影响
Fig. 3 Effects of calcium phosphate addition on effective phosphorus contents
2.1.4 无机盐种类及添加量对有效磷含量的影响
无机盐在培养基中为微生物或细胞提供必需的矿物质元素，维持渗透压平衡、作为酶的辅因子及参与能量代谢，对细胞结构稳定和生理功能调控不可或缺[35-36]。 因此，考察不同无机盐种类及添加量对有效磷含量的影响，结果见图4。由图4可知，氯化钠与硫酸镁添加量对有效磷含量整体无显著影响（P＞0.05），然而随着氯化钾添加量的升高，有效磷含量呈明显先升高后下降的趋势，当添加适宜浓度的氯化钾时，其K+对不动杆菌S1的生长代谢起到积极作用，并参与细胞内多种生理过程，然而氯化钾添加量过高则会引起细胞内离子失衡，破坏渗透平衡，阻碍细胞正常的生理活动，导致解磷能力降低，使得有效磷含量降低[37]。 当氯化钾添加量为0.1 g/L时，有效磷含量最高，为98.12 mg/L。因此，选择添加0.1 g/L氯化钾作为无机盐成分。
图4 不同无机盐种类及添加量对有效磷含量的影响
Fig. 4 Effects of types and addition of different inorganic salts on effective phosphorus contents
2.2 发酵条件优化单因素试验
2.2.1 接种量对有效磷含量的影响
接种量对有效磷含量的影响见图5。 由图5可知，随着接种量的增加，发酵液中有效磷含量呈现先增加后降低的趋势，当接种量低时，菌体的生长繁殖周期延长，产酶量降低，总体的解磷能力弱，有效磷含量不高，随着接种量增多，在营养物质充足的环境下，菌体数量多，解磷能力强，然而接种量过大时，培养环境营养物质不足，且自生的代谢废物也会影响其生理过程，使得相关解磷酶活性降低，有效磷含量降低[38-39]。当接种量为5%时，有效磷含量最高，为106.78mg/L，但其与接种量为3%时的有效磷含量（105.82 mg/L）差异不显著（P＞0.05），因此，选择最佳接种量为3%。
图5 接种量对有效磷含量的影响
Fig. 5 Effects of inoculum on effective phosphorus contents
2.2.2 发酵温度对有效磷含量的影响
发酵温度对有效磷含量的影响见图6。 由图6可知，随着发酵温度的升高，有效磷含量呈先增加后降低的趋势，当培养温度较低时，菌体生长及新陈代谢缓慢，解磷能力弱，有效磷含量较低，随着温度的升高，菌体数量和解磷能力显著增强，有效磷含量升高，但过高的温度会引起原生质胶体的变性及细胞内蛋白质的损伤，相关酶活性降低，导致有效磷产量降低[37]。当发酵温度为35 ℃时，有效磷含量最高，为107.36 mg/L，但其与发酵温度为33 ℃时的有效磷含量（104.15 mg/L）差异不显著（P＞0.05）。因此，选择最佳发酵温度为33 ℃。
图6 发酵温度对有效磷含量的影响
Fig. 6 Effects of fermentation temperature on effective phosphorus contents
2.2.3 发酵时间对有效磷含量的影响
发酵时间对有效磷含量的影响见图7。由图7可知，随着发酵时间的延长，发酵液中有效磷含量呈先增加后降低趋势，分析原因可能是培养基中营养消耗到一定程度后，有效磷被菌株吸收利用所致[19]。当发酵时间为36 h时，有效磷含量达到最高，为108.46 mg/L。因此，选择最佳发酵时间为36 h。
图7 发酵时间对有效磷含量的影响
Fig. 7 Effects of fermentation time on effective phosphorus contents
2.3 发酵条件优化Plackett-Burman试验
基于单因素试验结果，采用Design-Expert 12.0软件设计PB试验，试验结果见表4，方差分析结果见表5。以有效磷含量（Y）为响应值，采用Design-Expert 12.0软件对表4结果进行多元一次回归拟合，得到回归方程：Y=88.77+4.12X1+0.69X2-1.01CX3+1.32X4+4.47X5-3.18X6-10.14X7。 该模型的决定系数R2为0.942 8，P值为0.023 4（P＜0.05），表明模型有效，可用于后续分析。由表5可知，7个考察因素中只有糖蜜添加量、接种量、发酵时间对结果影响显著（P＜0.05），且根据F值大小可知，各因素对结果影响的重要程度顺序为发酵时间＞接种量＞糖蜜添加量。此外，根据回归方程中变量系数可知，糖蜜添加量和接种量对有效磷含量影响呈正效应，发酵时间对有效磷含量影响呈负效应。综上，选择糖蜜添加量、接种量和发酵时间进行最陡爬坡试验。
表4 发酵条件优化Plackett-Burman试验设计及结果
Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests for fermentation conditions optimization
试验号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 Y 有效磷含量/（mg·L-1）1234567891 0 11 12 25 15 25 15 15 15 25 25 25 15 25 15 221211122211 466464446664 0.3 0.1 0.3 0.3 0.1 0.3 0.1 0.1 0.1 0.3 0.3 0.1 553553533353 37 37 37 35 37 37 35 37 35 35 35 35 36 42 42 42 36 36 42 36 42 36 36 42 110.12±0.54 69.99±1.46 75.11±1.67 85.44±1.43 97.23±0.75 89.16±1.59 91.45±1.68 92.23±0.75 83.23±0.79 95.78±1.19 105.22±1.11 70.30±1.06
表5 Plackett-Burman试验方差分析结果
Table 5 Variance analysis results of Plackett-Burman tests
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。下同。
因素F 值P 值显著性重要性排序X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 7.97 0.23 0.48 0.72 9.37 4.14 37.48 0.047 7 0.659 3 0.526 9 0.445 3 0.037 6 0.111 5 0.003 6****3765241
2.4 发酵条件优化最陡爬坡试验
基于PB试验，采用Design-Expert 12.0软件设计最陡爬坡试验，试验设计及结果见表6。
表6 发酵条件优化最陡爬坡试验设计及结果
Table 6 Design and results of the steepest ascent tests for fermentation conditions optimization
试验号糖蜜添加量/（g·L-1）接种量/%发酵时间/h有效磷含量/（mg·L-1）123456 15 20 25 30 35 40 345678 42 40 38 36 34 32 79.98±0.39 90.80±0.47 105.74±0.66 110.79±1.65 101.45±0.61 95.67±0.44
由表6可知，在第4组试验中有效磷含量最高，即糖蜜添加量为30 g/L、接种量为6%、发酵时间为36 h。因此，固定硫酸铵添加量为1.0 g/L，磷酸钙添加量为5.0 g/L，氯化钾添加量为0.1 g/L、发酵温度为33 ℃，选择第4组试验的因素及水平作为中心点进行Box-Behnken中心组合响应面试验。
2.5 发酵条件优化响应面试验
基于最陡爬坡试验结果，以有效磷含量（Y）作为响应值，以糖蜜添加量（A）、接种量（B）、发酵时间（C）为考察因素，采用Design-Expert12.0软件设计3因素3水平的Box-Behnken中心组合响应面试验，试验设计及结果见表7，方差分析结果见表8。
表7 发酵条件优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 7 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization
试验号A 糖蜜添加量/（g·L-1）B 接种量/%C 发酵时间/h Y 有效磷含量/（mg·L-1）1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 30 25 30 35 30 30 30 35 35 30 25 35 25 25 30 30 30 67777555666665666 36 36 34 36 38 34 38 36 34 36 38 38 34 36 36 36 36 113.87±0.42 86.36±0.11 102.13±0.47 90.11±0.09 106.89±0.61 101.22±0.22 103.11±0.29 87.56±0.57 93.79±0.95 113.56±0.24 94.01±0.57 98.95±0.28 93.21±0.02 85.12±1.02 115.21±0.23 114.75±1.05 114.10±0.36
表8 回归模型方差分析
Table 8 Variance analysis of regression model
来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C2 1 855.35 17.14 8.99 19.88 0.43 4.75 2.06 1 315.99 366.64 11.17 9111111111 206.15 17.14 8.99 19.88 0.43 4.75 2.06 1 315.99 366.64 11.17 714.40 59.40 31.15 68.88 1.49 16.47 7.14 4 560.45 1 270.56 38.72＜0.000 1 0.000 1 0.000 8＜0.000 1 0.262 2 0.004 8 0.031 9＜0.000 1＜0.000 1 0.000 4*********
续表
来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性残项失拟项纯误差总和2.02 0.22 1.80 1 857.37 7341 6 0.29 0.07 0.45 0.160.917 7
采用Design-Expert 12.0软件对表7的试验数据进行多元二次回归拟合分析，结果得到二次多项回归方程：Y=-1 222.391+38.405A+98.158B+24.688C+0.065AB+0.109AC+0.359BC-0.707A2-9.331B2-0.407C2。由表8可知，该回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型拟合程度良好。回归模型的决定系数R2=0.998 9、调整决定系数R2Adj=0.997 5，进一步验证了该模型的可靠性。由P值可知，一次项A、B、C、交互项AC及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项BC对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对结果影响的主次顺序为发酵时间＞糖蜜添加量＞接种量。各因素间交互作用对结果影响的响应面及等高线见图8。由图8可知，各因素间交互作用的响应面均呈凸面，说明均存在最大值。 交互项AC和BC的等高线呈椭圆，而交互项AB的等高线趋于圆形，说明交互项AC和BC对结果影响较大，而交互项AB对结果影响较小，这与方差分析结果一致。
图8 各因素间交互作用对有效磷含量影响的响应面及等高线图
Fig. 8 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on effective phosphorus contents
采用Design-Expert 12.0软件对多元二次回归方程进行最优求解，得到最优发酵条件为：糖蜜添加量30.24 g/L、接种量6.1%、发酵时间36.36 h，硫酸铵添加量1.0 g/L，磷酸钙添加量5.0 g/L，氯化钾添加量0.1 g/L、发酵温度33 ℃，在此条件下，有效磷含量的预测值为114.61 mg/L。为便于实际操作，将最优发酵条件修订为糖蜜添加量30.25 g/L、接种量6%、发酵时间为36 h，其他条件不变。 在最优发酵条件下进行3次重复验证试验，结果得到发酵液中有效磷含量实际值为（115.55±0.06） mg/L，与预测值基本吻合，证实了响应面模型的可靠性，较优化前（84.82 mg/L），有效磷含量提高了36.23%。CHEN Y L等[40]分离筛选到一株偏肿栓菌（Trametesgibbosa）T-41，该菌株发酵168 h时，有效磷含量仅为57.5mg/L；张雪梅等[41]利用解磷菌株P4发酵72 h时，有效磷含量可达76.54 mg/L。综上，Acinetobacter S1在酿酒废水黄水底锅水基质中解磷效率较高，具有一定的研究价值。
3 结论
白酒酿造主要废水—黄水底锅水，富含多种助于微生物增殖代谢与植物生长发育的成分，有增值资源化利用价值。 本研究以黄水底锅水作为基质，以具有解磷功效的不动杆菌S1为发酵菌株，以发酵液中有效磷含量为响应值，采用单因素试验、PB试验、最陡爬坡试验和响应面试验优化得到不动杆菌S1的最优发酵条件为：黄水底锅水中补充30.25 g/L糖蜜、1.0 g/L硫酸铵、5.0 g/L磷酸钙、0.1 g/L氯化钾，不动杆菌S1接种量6%（V/V）、发酵温度33 ℃、发酵时间36h。在此优化条件下，发酵液中有效磷含量最高，为115.55 mg/L，较优化前提高了36.23%。 结果表明，不动杆菌S1具有高效解磷能力，黄水底锅水具有作为相关解磷菌菌剂的发酵液的潜质。本研究为相关解磷菌剂产品的研发提供参考和理论依据的同时，为白酒固态酿造蒸馏废水的资源化利用提供了一条新思路，减少污水处理成本，助力资源循环利用，也为农业绿色高效发展注入新活力。
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