米香型白酒以大米为主要原料，蒸煮后加入酒曲作为糖化发酵剂，经固态、半固态或液态发酵后蒸馏、陈酿和勾兑而成[1]。在第三届全国评酒大会上，米香型白酒被确立为4种基本香型白酒之一[2-3]。米香型白酒发酵周期短，与其他香型白酒的风味存在明显差异。乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇等风味物质赋予酒体蜜香清雅的香气；口感柔和、落口清爽和回味怡畅[4]。
原料组成成分及其在发酵过程中的变化对米香型白酒品质有重要影响，大米富含淀粉、蛋白质和脂肪，其中所含的蛋白质是白酒独特风味的关键物质[5-6]。蛋白质在发酵过程中不仅为微生物繁殖提供营养物质，还可以被蛋白酶分解为氨基酸，这些氨基酸在酵母或细菌的参与下可促进高级醇、 醛酮类以及内酯类等独特风味物质的生成[7-8]，赋予白酒独特的风味和口感[4，9]。研究表明，外源添加谷蛋白不仅能增加小米黄酒中鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）和甜味氨基酸（丙氨酸、脯氨酸）的含量，还能增加乙酸乙酯、乙酸丁酸酯、乙酸己酸酯和乙酸癸酸酯含量，提升酒体的香气复杂度[10]。鲜见关于外源添加蛋白质提高米香型白酒品质的研究报道。
本研究将外源大米蛋白添加至大米原料中酿造米香型白酒，采用常规检测方法分析米香型白酒发酵过程中理化指标，通过顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术分析挥发性风味物质，基于检测结果进行正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），结合变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值及方差分析P值筛选显著差异挥发性风味物质（VIP值＞1，P＜0.05），以期探究大米蛋白对米香型白酒品质的影响，为米香型白酒的生产和品质提升提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌种
大米、酒曲和酵母：广东省九江酒厂有限公司；大米蛋白：陕西今汉生物科技有限公司。
1.1.2 试剂
乙醇（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；糖化酶（100 000 U/g）：广东省九江酒厂有限公司；酚酞、氢氧化钠（均为分析纯）：南京化学试剂股份有限公司；浓盐酸（分析纯）：广州化学试剂厂；2-辛醇（纯度＞98%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；氯化钠（分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SOP电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GWB-1B超纯水器：北京普通用仪器有限责任公司；KQ5200V超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；890/5977B型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent 科技有限公司；DB-WAX毛细管色谱柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm）：上海元析仪器有限公司；57318 75 μm CAR/PDMS萃取纤维头、57330-U SPME手动进样手柄：美国Supelco公司；85-2数显控温磁力搅拌器：常州市金坛大地自动化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 大米蛋白的添加对米香型白酒品质的影响
对照组（N）：取1 kg大米加水室温浸泡1 h后沥干，蒸煮50 min。实验组（P）：取1 kg大米加水室温浸泡1 h后沥干，加入大米质量10%的大米蛋白蒸煮50 min。 对照组和实验组大米摊凉后，各加入24 g酒曲，拌曲后装入5 L玻璃发酵罐，2层纱布密封，32 ℃糖化24 h后加入酵母1.2 g、糖化酶4 mL、纯水2.2 L和酒曲60 g进行发酵。第1～4天发酵温度为20 ℃，第5～13天常温发酵，共发酵13 d后取上清液，测定发酵过程中其理化指标及挥发性风味物质。
1.3.2 理化指标测定
总酸含量的测定：参照GB 12456—2021《食品中总酸的测定》中的酸碱指示剂滴定法；总酯含量的测定：参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》中的指示剂法。
乙醇含量的测定：取1 mL上清液过0.22 μm滤膜于进样瓶中，使用气相色谱仪进行测定。GC条件：DB-WAXUI毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；进样口温度220 ℃，检测器温度230 ℃。 程序升温条件为初始温度40℃，保持6min，以5℃/min的速度升温至120℃。载气为高纯氮气（N2）；流速1.0 mL/min；空气流速300 mL/min；H2流速35 mL/min；分流进样，分流比为25∶1，进样量1 μL。
1.3.3 挥发性风味物质的测定
采用HS-SPME-GC-MS法测定米香型白酒挥发性风味物质[11]，并稍作修改。
HS-SPME条件：取上清液7 mL加入到20 mL顶空瓶中，加入磁力转子、2 g NaCl和100 μL内标溶液（81.90 mg/L 2-辛醇）混匀。在50℃下平衡5min，插入已活化的萃取针（50/30μm DVB/CAR/PDMS），吸附萃取45 min，转速400 r/min，随即将萃取针插入气质联用仪进样口中，250 ℃解吸5 min。
GC条件：采用DB-WAXUI毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，不分流进样，高纯氦气（He）作为载气。 程序升温条件为初始温度30 ℃，保持6 min，以2 ℃/min升温至4 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至100 ℃，保持10 min，以10 ℃/min升温到200 ℃，保持10 min。
MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；采集模式为全扫描，质量扫描范围50～550 m/z。
定性与定量分析：将所测得谱峰利用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库相匹配，选择匹配度＞80的化合物进行定性分析。 采用内标法进行相对定量，计算公式如下：
式中：CX为化合物质量浓度，mg/kg；CS为内标物的质量浓度，mg/kg；AX为化合物峰面积；AS为内标物的峰面积。
1.3.4 数据分析
采用Microsoft Office Excel 365软件处理实验数据；Origin 2021绘制折线图；TBtoolsV1.098绘制热图。
2 结果与分析
2.1 大米蛋白对米香型白酒发酵过程中总酸含量的影响
白酒发酵过程中一般会产生酸类物质，同时酸类物质会和醇类物质反应生成关键的酯类风味物质，为白酒提供醇厚香味。米香型白酒发酵过程中总酸含量变化见图1。由图1可知，当发酵1～3 d时，两个组别发酵醪液的总酸含量快速增加；发酵时间＞3 d时，总酸含量缓慢增加。当米酒开始发酵，产酸菌开始生长，使总酸含量升高，但过高的有机酸含量会抑制微生物生长，导致总酸含量缓慢增加。发酵结束时，对照组、实验组发酵醪液总酸含量分别为4.62 g/L、5.96 g/L。 实验组发酵醪液中总酸含量比对照组高40.21%，其可能的原因是，大米蛋白的添加提高了发酵醪液中氮源含量，促进产酸菌生长代谢[14]。因此，大米蛋白的添加提高了米香型白酒的总酸含量。
图1 米香型白酒发酵过程中总酸含量的变化
Fig.1 Changes of total acid contents in rice-flavor Baijiu during fermentation process
2.2 大米蛋白对米香型白酒发酵过程中总酯含量的影响
米香型白酒发酵过程中总酯含量的变化见图2。由图2可知，对照组发酵醪液的总酯含量在发酵1～5 d期间内快速增加，由发酵起始（1.51 g/L）增加至3.25 g/L；发酵时间＞5 d之后，总酯含量有所下降。实验组发酵醪液的总酯含量在发酵1～9 d内增加，但发酵时间＞9 d，总酯含量趋于平稳；当发酵结束时，对照组、实验组发酵醪液总酯含量分别为3.25 g/L、3.52 g/L。 大米蛋白的添加为酿造微生物提供了丰富的氮源，促进了酵母菌等微生物的生长和代谢活性，加速酯化反应进行，生成酯类物质。但随着有机酸的不断积累导致pH下降，同时乙醇浓度升高，酯化反应速率减慢[15]。因此，大米蛋白的添加提高了米香型白酒的总酯含量。
图2 米香型白酒发酵过程中总酯含量的变化
Fig.2 Changes of total ester contents in rice-flavor Baijiu during fermentation process
2.3 大米蛋白对米香型白酒发酵过程中乙醇含量的影响
米香型白酒发酵过程中乙醇含量的变化见图3。由图3可知，发酵至3 d时，随着发酵时间在1～13 d范围内的增加，两个组别发酵醪液的乙醇含量变化趋势一致，均呈先升高后平稳再升高的趋势，且含量相差不大；当发酵结束时，对照组、实验组发酵醪液乙醇含量分别为167.00 g/L、161.16 g/L，实验组发酵醪液乙醇含量比对照组低3.50%。 其原因可能是，发酵初期添加大米蛋白有利于提高氮源含量，促进酵母菌快速繁殖，产生大量CO2和酒精。随着CO2含量增加，抑制酵母的酒精代谢[16]。因此，大米蛋白的添加提高了米香型白酒的乙醇含量。
图3 米香型白酒发酵过程中乙醇含量的变化
Fig.3 Changes of alcohol contents in rice-flavor Baijiu during fermentation process
2.4 大米蛋白对米香型白酒发酵过程中挥发性风味物质的影响
2.4.1 挥发性风味物质种类和含量分析
发酵结束后对照组发酵醪液中共检出37种挥发性风味物质，包括醇类12种、酯类14种、醛酮类3种、酸类1种、酚类2种、烯烃类2种、烷烃类2种以及其他类1种；而实验组发酵醪液共检测出44种挥发性风味物质，包括醇类13种、酯类18种、醛酮类3种、酸类1种、酚类2种、烯烃类3种、烷烃类3种以及其他类1种。与对照组相比，实验组发酵醪液中增加了1-戊醇及9-十六碳烯酸乙酯、十三烷酸乙酯、反油酸乙酯、庚酸乙酯，说明大米蛋白的添加可增加米香型白酒风味物质的种类。进一步对两个组别发酵过程中挥发性风味物质含量进行分析，结果见图4。
图4 发酵结束时各类别挥发性风味物质种类（a）和发酵过程中挥发性风味物质含量变化（b）
Fig.4 Types of various categories volatile flavor substances after fermentation (a) and the changes of volatile flavor substances contents during fermentation process (b)
由图4可知，发酵1～5 d时，对照组发酵醪液中挥发性风味物质总含量均高于实验组；随着发酵的进行，实验组发酵醪液中挥发性风味物质总含量整体优于对照组。当发酵结束时，实验组、对照组发酵醪液中挥发性风味物质含量分别为16.97 mg/kg、13.45 mg/kg，其原因可能是，添加大米蛋白可为微生物的生长繁殖提供营养物质，促进挥发性风味物质的生成。
2.4.2 发酵过程中各类别挥发性风味物质变化
（1）醇类物质变化
醇类物质是白酒中主要的醇甜和助香物质，可形成香味前体物质，与酸类物质反应生成酯类物质[12]。米香型白酒发酵过程中醇类物质聚类分析热图见图5。 由图5可知，对照组、实验组发酵醪液中醇类物质分别检出12种、13种。异戊醇、异丁醇和苯乙醇主要合成前体物分别为亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸[18]。 其中，异戊醇和异丁醇在实验组发酵醪液中含量高于对照组，发酵结束时，其在实验组发酵醪液中含量分别为1.53 mg/kg和8.63 mg/kg；苯乙醇是米香型白酒中关键醇类挥发性风味物质，呈面包香、清甜的玫瑰样花香味[15]。发酵1～5 d时，对照组发酵醪液中苯乙醇含量高于实验组，随着发酵时间的增加，对照组发酵醪液苯乙醇含量呈逐渐下降趋势，在发酵结束时，实验组中苯乙醇含量（3.10 mg/kg）高于对照组（1.94 mg/kg）。大米蛋白的添加可以提高白酒发酵体系中亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸含量，从而提高了异戊醇、异丁醇和苯乙醇含量。1-辛醇和正丁醇能够增强白酒的复杂性和层次感，调整香气，使酒体更加丰富和协调[19]。发酵结束时，对照组与实验组发酵醪液中醇类物质总含量分别为9.01 mg/kg和14.15 mg/kg。异戊醇和异丁醇是米香型白酒中易引起饮用者出现“上头”现象的主要风味物质，适宜的异戊醇和异丁醇含量可以丰富白酒的口感，且平衡酒体韵味[17]。因此，推测大米蛋白添加可提升异丁醇、异戊醇和苯乙醇等物质的含量，促进醇类物质的形成。
图5 米香型白酒发酵过程中醇类物质含量聚类分析热图
Fig.5 Heat map of cluster analysis of alcohol contents in rice-flavor Baijiu during fermentation process
颜色深浅表示经归一化处理后的相对含量（红色代表含量较高，蓝色代表含量较低）。
（2）酯类物质变化
酯类挥发性风味物质作为白酒的重要香气成分，赋予白酒独特的口感和风味[20]。米香型白酒发酵过程中酯类物质聚类分析热图见图6。由图6可知，对照组、实验组发酵醪液分别检出14种、18种酯类物质，乙酯类是构成米香型白酒风味的主体。 其中，乙酸乙酯（具果香、花香）和乳酸乙酯（具甜味、奶香）是含量较高的2种关键风味物质[21]。当发酵至第11天，与对照组发酵醪液乙酸乙酯含量（0.88 mg/kg）相比，实验组发酵醪液中乙酸乙酯含量为1.1 mg/kg，比对照组高39.43%；发酵结束时，实验组发酵醪液中乳酸乙酯的含量是对照组的1.8倍。 此外，大米蛋白的添加促进了新的酯类物质合成，如十三烷酸乙酯、反油酸乙酯、庚酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯。其原因可能是，大米蛋白的添加促进了产酯微生物的代谢活力[22-23]。尽管其中部分新酯（如反油酸乙酯等）的风味贡献尚不明确[24]，但庚酸乙酯已被证实是白酒的重要香味成分。 综上所述，大米蛋白的添加对米香型白酒的整体风格的协调与平衡具有重要作用。发酵结束时，实验组发酵醪液中酯类物质含量（3.05 mg/kg）高于对照组（2.26 mg/kg），表明大米蛋白的添加有效促进酯类物质的合成。
图6 米香型白酒发酵过程中酯类物质含量聚类分析热图
Fig.6 Heat map of cluster analysis of ester contents in rice-flavor Baijiu during fermentation process
（3）其他类物质变化
米香型白酒发酵过程中其他种类（醛类、酸类、酮类、酚类、烯烃类、烷烃类和芳香烃类）物质含量聚类分析热图见图7。
图7 米香型白酒发酵过程中其他类物质含量聚类分析热图
Fig.7 Heat map of cluster analysis of others components contents in rice-flavor Baijiu during fermentation process
由图7可知，醛类物质作为米香白酒的重要挥发性风味物质，其阈值较低。发酵结束时，实验组发酵醪液中壬醛含量（4.9 μg/kg）高于对照组（3.7 μg/kg）。 酸类物质影响白酒口感与香气，酸类物质中仅检出乙酸，发酵结束时，实验组发酵醪液中含量较高。 酚类物质中检出4-乙基-2甲氧基苯酚（香辛料和草药香气[25]）和4-乙烯基-2甲氧基苯酚（发酵香、炒花生香[26]），4-乙基-2甲氧基苯酚含量在对照组发酵过程中高于实验组；而具有生物活性的4-乙烯基-2-甲氧基苯酚在实验组发酵过程中含量更高，表明大米蛋白的添加可能特异性地抑制了前者的合成路径，而促进了后者的生成[27]。烯烃类物质中检出α-蒎烯（松脂味[28-29]）及右旋萜二烯（新鲜橙子香气）。 综上，大米蛋白的添加可抑制具有生物活性的α-蒎烯的形成，但可促进右旋萜二烯的积累。
2.4.3 OPLS-DA结果
为系统阐明大米蛋白添加对米香型白酒醪液特征风味的影响，筛选显著差异物质，构建OPLS-DA模型，分析结果见图8。
图8 挥发性风味物质正交偏最小二乘-判别分析得分图（a）、200次置换检验结果（b）及变量重要性投影值（c）
Fig.8 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis score graph (a), 200 permutation test results (b) and variable importance in the projection values (c) of volatile flavor substances
由图8a可知，OPLS-DA模型的解释变异数（R2X）为0.717，预测能力（R2Y）为0.988，表明其具有良好的准确性与预测能力[30]，并能清晰区分实验组与对照组样品，证实大米蛋白的添加对米香型白酒在挥发性风味物质组成影响较大。由图8b可知，200次置换检验结果左侧的R2与Q2值均低于右侧，且R2截距为0.839，Q2截距为-0.274，表明OPLS-DA模型有效、稳定，且未出现过拟合[31]。VIP值可量化各变量对样品分类的贡献，利用方差分析P值及VIP值筛选出显著差异挥发性风味化合物（VIP值＞1，P＜0.05）。由图8c可知，共鉴定出21种显著差异挥发性风味物质，包括4-乙基愈创木酚、壬酸乙酯、油酸乙酯、1-戊酸、异戊醇、苯乙醇、正丁醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯和庚酸乙酯等物质，这些物质是影响添加大米蛋白米香型白酒风味轮廓的显著差异物质。
3 结论
外源添加大米蛋白对米香型白酒的发酵过程及风味品质具有明显影响。 大米蛋白的添加提高了发酵醪液的总酸、总酯及乙醇含量。 发酵结束时，添加大米蛋白酿造米香型白酒醪液中总酸、总酯及乙醇含量分别为5.96 g/L、3.52 g/L和161.16 g/L，而对照组总酸、总酯含量及乙醇含量分别为4.62 g/L、3.25 g/L和167.00 g/L。 实验组发酵醪液在发酵结束时共检测出挥发性风味物质种类（44种）高于对照组（37种），发酵结束时，添加大米蛋白酿造米香型白酒醪液中增加了1-戊醇及9-十六碳烯酸乙酯、十三烷酸乙酯、反油酸乙酯、庚酸乙酯等酯类物质，且挥发性风味物质含量（16.97 mg/kg）高于对照（13.45 mg/kg）。OPLS-DA模型可有效区分2个组别样品，共筛选出21种显著差异挥发性风味物质（VIP值＞1，P＜0.05），包括4-乙基愈创木酚、壬酸乙酯、油酸乙酯、1-戊酸、异戊醇、苯乙醇、正丁醇、乳酸乙酯、苯甲酸乙酯和庚酸乙酯等物质，这类物质是形成添加大米蛋白的米香型白酒独特风味轮廓的潜在关键贡献者，本研究为米香型白酒风味品质提升提供了技术支撑。
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